燈盞花對血管內皮細胞損傷大鼠Wnt/β-catenin信號通路及炎癥介質的影響

白如君　劉俊　周有利

摘要 目的：研究燈盞花素對血管內皮細胞損傷大鼠的保護機制及對Wnt/β-catenin信號通路的作用機制。方法：選取60只SD大鼠，隨機分為健康組、模型組、燈盞花素低劑量組（BL組）、燈盞花素高劑量組（BH組），每組15只。采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察血管形態；逆轉錄PCR測Wnt信使RNA（mRNA）、卷曲蛋白1（FZD1） mRNA、軸蛋白1（AXIN1） mRNA、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β） mRNA、β-連環素 mRNA、血管內皮生長因子（VEGF） mRNA；酶聯免疫吸附試驗測定腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、C反應蛋白（CRP）；顯微鏡觀察血管內皮細胞形態；MTT測血管內皮細胞增殖；蛋白質印跡法（Western Blotting）測Wnt、FZD 1、AXIN1、GSK-3β、β-連環素、VEGF水平。結果：健康組大鼠血管內無明顯改變；模型組有明顯血管損傷；BL組與BH組大鼠血管損傷有所改善，且以BH組效果明顯。與健康組比較，模型組血管內皮細胞間隙寬、細胞形態變小、脫落；BL組血管內皮細胞與模型組較為接近；BH組血管內皮細胞間隙變窄且凋亡減少，形態有所改善。與健康組比較，模型組Wnt、VEGF、FZD1、β-連環素、AXIN1、血管內皮細胞不同時間點OD值均降低，GSK-3β、TNF-α、CRP、血管內皮細胞凋亡率升高（P<0.05），與模型組比較，BL組與BH組Wnt、VEGF、FZD1、β-連環素、AXIN1、血管內皮細胞不同時間點OD值均升高，GSK-3β、TNF-α、CRP、血管內皮細胞凋亡率降低（P<0.05），且以BH組效果更為顯著（P<0.05）。結論：燈盞花素通過調控Wnt/β-catenin信號通路表達，控制血管的穩定性，從而對血管內皮細胞損傷大鼠的起保護作用。

關鍵詞 燈盞花素；血管內皮細胞損傷大鼠；Wnt/β-catenin信號通路；卷曲蛋白1；軸蛋白1；β-連環素；血管內皮生長因子；糖原合成酶激酶-3β

Effects of Breviscapine on Wnt/β-catenin Signaling Pathway and Inflammatory Mediators in Rats with Vascular Endothelial Cell Injury

BAI Rujun，LIU Jun，ZHOU Youli

（Tianyou Hospital Affiliated to Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430000，China）

Abstract Objective：To study the protective mechanism of breviscapine on rats with vascular endothelial cell injury and its mechanism on the Wnt/β-catenin signaling pathway.Methods：Sixty SD rats were randomly divided into a healthy group，a model group，a low-dose breviscapine group（BL group），and a high-dose breviscapine group（BH group），with 15 rats in each group.Blood vessel morphology was observed by HE staining，and the mRNA expression of Wnt，FZD1，AXIN1，GSK-3β，β-catenin，and VEGF was detected by RT-PCR.TNF-α and CRP were measured by ELISA.The morphology of vascular endothelial cells was observed under the microscope.MTT was used to measure vascular endothelial cell proliferation.The levels of Wnt，FZD1，AXIN1，GSK-3β，β-catenin，and VEGF were measured by Western blot.Results：There were no obvious changes in the blood vessels of healthy rats.The model rats showed obvious vascular injury.Vascular injury was improved in the BL group and the BH group，especially in the BH group.Compared with the healthy group，the model group showed wider space between vascular endothelial cells and smaller and exfoliated cells.The vascular endothelial cells of the BL group were similar to those of the model group.The BH group had narrowed vascular endothelial cell space and reduced apoptosis，and the morphology was improved.Compared with the healthy group，the model group showed decreased OD values of Wnt，VEGF，FZD1，β-catenin，AXIN1，and vascular endothelial cells at different time points，and increased apoptosis rates of GSK-3β，TNF-α，CRP，and vascular endothelial cells（P<0.05）.Compared with the model group，the BL and BH groups showed increased OD values of Wnt，VEGF，FZD1，β-catenin，AXIN1，and vascular endothelial cells at different time points and decreased apoptosis rates of GSK-3β，TNF-α，CRP，and vascular endothelial cells（P<0.05），and such changes were more significant in the BH group（P<0.05）.Conclusion：Breviscapine can control vascular stability by regulating the expression of the Wnt/β-catenin pathway，thereby protecting against vascular endothelial cell injury in rats.

Keywords Breviscapine; Vascular endothelial cell injury rats; Wnt/β-catenin signaling pathway; FZD1; AXIN1; β-catenin; VEGF; GSK-3β

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.01.015

近年來，我國心腦血管疾病的發病率逐年遞增，動脈硬化是其產生的根本。研究表明，血管內皮細胞損傷是動脈硬化的始動環節或關鍵因素［1］。血管內皮細胞可修復機體所受到的損傷，具有促進血管新生、止血、抗血栓、參與免疫活動等功能。血管內皮在遇到損傷時，會增加縮血管因子、減少舒血管因子的釋放，破壞血管間平衡，導致血管疾病產生［2-3］。因此，保持內皮細胞功能的完整性，在心血管系統穩態調節中起重要作用，心腦血管疾病具有發病率高、病死率高、致殘率高、并發癥多和復發率高的特點，且發病率有逐年增加的趨勢，有效的治療方法相對缺乏［4-5］。因此，尋找新的治療方法和有效的干預策略是當前心腦血管領域研究的熱點和難點。有研究證實中藥通過調控相關信號通路對于心腦血管疾病具有較好的療效。燈盞花素是從菊科飛蓬屬植物短亭飛蓬中提取的黃酮類化合物，其主要成分為燈盞乙素，還含有少量的燈盞甲素，具有保護缺血性腦血管疾病、調節血管內皮功能、緩解腦血管痙攣、降低血脂、調節免疫及減輕炎癥反應、抗自由基損傷、抑制血小板凝集等作用。臨床上常用于治療腦梗死及腦血栓、腎病綜合征、糖尿病、類風濕性關節炎等疾病。另有研究證實Wnt/β-catenin（β-連環素）信號通路對動脈粥樣硬化血管損傷具有一定的改善作用［6］。Wnt是一種通過分泌的形式發揮作用的糖蛋白，可促進β-連環素積累，游離的β-連環素進入細胞核后具有調控基因表達的能力；Wnt信號具有調節細胞生物活性的作用，在成人機體內主要參與體內平衡穩定［7］。因此，本文研究燈盞花素對血管內皮細胞損傷大鼠的保護機制及對Wnt/β-catenin信號通路的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及細胞 選取60只健康雄性SD大鼠，6～8周齡，體質量120～130 g，購自遼寧長生公司，許可證號：SYXK（遼）2019-0214，常規飼養1周，自由飲食、飲水，溫度23～24 ℃，相對濕度40%～50%。大鼠心肌微血管內皮細胞（CardiacMicrovascular Endothelial Cells，CMECs）購自上海賓穗生物科技有限公司（貨號：BS-C00866146）。本研究已通過武漢科技大學附屬天佑醫院動物倫理委員會批準通過（倫理審批號：2021-036-8）。

1.1.2 藥物 燈盞花素原料粉（昆明振華制藥公司，批號：27740-01-8），用適量pH 6.8的磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）溶解，加注射用水配成10%（W/V）溶液。

1.1.3 試劑與儀器 二甲苯（寧波玖林公司，批號：8877087），蛋白裂解液（上海如吉公司，編號：111-11-5），甲醛（濟南旺杰公司，編號：30525-89-4），酶聯免疫吸附試驗試劑盒（武漢伊萊瑞特公司，貨號：E-EL-）；BECKMAN COULER HMX全自動血球計數儀（貝克曼庫爾特公司，美國，型號：LH750），發色底物法試劑盒（上海冠東生物科技有限公司，法國，貨號：220502）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用隨機數字表法將60只大鼠分為健康組、模型組、燈盞花素低劑量組（BL組）、燈盞花素高劑量組（BH組），每組15只。健康組大鼠不處理，其余大鼠麻醉后切開右腹股溝區，暴露股動脈，遠心端結扎，近心端手術絲線拉開，在結扎線上方采用手術剪做橫切口，從切口向腹股溝方向插入長2 cm直徑0.138 mm鎳鈦記憶合金球囊導絲，至胸主動脈5 cm處，停留1 min，反復3次，造成動脈血管擴張、內膜剝離，后取出導絲，結扎近心端，松開絲線，恢復血流。

將CMECs分為健康組、模型組、BL組、BH組。模型組、BL組與BH組，給予脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導建立血管內皮細胞損傷模型：將細胞用含10%胎牛血清的RMPI-1640培養基接種于96孔板，調整細胞濃度為2×104/mL，每孔200 μL。根據前期實驗，待細胞完全貼壁后用空白培養基饑餓處理12 h后，用2.5 μg/mL的LPS損傷24 h建立血管內皮細胞損傷模型。

1.2.2 給藥方法 1）大鼠：建模24 h后，給予BL組與BH組大鼠燈盞花素溶液灌胃，單次劑量分別為50 μmol/L、200 μmol/L，1次/d，模型組及健康組給予等量生理鹽水灌胃1次/d，共14 d。2）細胞：在BL組與BH組培養基中分別加入50 μmol/L、200 μmol/L的燈盞花素與血管內皮損傷細胞共培養72 h后胰酶消化、離心、重懸。37 ℃培養箱內孵育，隔日換液。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色檢測血管形態 灌胃結束后，取各組大鼠，麻醉處死，留取胸主動脈血管段，甲醛固定，硝酸脫鈣，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規切片，HE染色，光鏡下觀察染色結果。

1.2.3.2 逆轉錄PCR檢測Wnt mRNA、Wnt受體卷曲蛋白1（Frizzled1，FZD1） mRNA、軸蛋白1（AXIN1）mRNA、糖原合成酶激酶-3β（Glycogen Synthase Kinase，GSK-3β）mRN、β-連環素 mRNA、血管內皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）mRNA。

取大鼠胸主動脈血管段組織，加入少量蛋白裂解液，提取單細胞懸液沖洗后放于無菌試管管中，按Trizol法提取總RNA，Primer 5.0合成引物。將RNA逆轉錄為cDNA，以ACTB為內參，PCR條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，總計40個循環，采用2-△△Ct法分析［8］。見表1。

1.2.3.3 檢測各組大鼠腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、C反應蛋白（C-reactive Protein，CRP）水平 取各組大鼠腹腔靜脈血2 mL，離心半徑8 cm，1 250 r/min離心5 min，取上清保存于-20 ℃。采用酶聯免疫吸附試驗檢測TNF-α、CRP水平。

1.2.3.4 顯微鏡觀察各組大鼠血管內皮細胞形態取各組CMECs用PBS洗滌后，離心半徑8 cm，800 r/min離心5 min，選擇100 μL的1×結合緩沖液，進行重懸細胞操作，提取細胞懸液顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.3.5 MTT法檢測各組大鼠血管內皮細胞增殖情況 取各組CMECs用PBS洗滌，離心半徑8 cm，800 r/min離心5 min，以8×103個細胞接種于96孔板，待細胞密度至50%時，換液，分別孵育12 h、24 h、48 h后用MTT法檢測各孔光密度（Optical Density，OD）值，通過OD值的變化判斷細胞增殖能力大小，OD值越大細胞增殖能力越強。

1.2.3.6 TUNEL檢測血管內皮細胞凋亡 取各組大鼠胸主動脈血管段組織與蛋白酶K室溫孵育15～30 min，PBS清洗后加入TUNEL檢測液，常溫無光孵育1 h，后PBS沖洗3次。加50 μL converter-POD，常溫無光孵育0.5 h。PBS清洗，DAB液顯色，沖洗，蘇木精復染，脫水透明，封片。熒光顯微鏡下觀察，并計數其中發熒光的陽性細胞。

1.2.3.7 蛋白質印跡法（Western Blotting）檢測Wnt、FZD 1、AXIN1、GSK-3β、β-連環素、VEGF水平取各組細胞，胰酶消化，離心，離心半徑8 cm，800 r/min離心5 min，取上清液。放入樣孔中，進行電泳實驗。電泳后將樣品轉至聚偏二氟乙烯（Polyvinylidenefluoride，PVDF）膜上，清洗樣品，將其放置在洗滌緩沖液（Tris Buffered Saline Tween，TBST）中室溫下混勻10 min，封閉蛋白1 h后，將其置于4 ℃環境孵育過夜。將一抗Wnt、FZD 1、AXIN1、GSK-3β、β-連環素、VEGF（1∶500）和二抗（1∶2 500）孵育45 min，用TBST將蛋白樣品清洗3次，凝膠成像系統曝光成像，進一步分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，符合正態分布多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，不同時間點組間比較采用重復測量方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果 健康組大鼠血管內無明顯改變，為單層內皮細胞；模型組有明顯的血管損傷，在損傷處有內皮脫落以及內膜損傷；BL組與BH組血管損傷有所改善，損傷處內皮脫落及內膜損傷有所緩解，BH組較BL組效果明顯。見圖1。

2.2 逆轉錄PCR檢測各組大鼠胸主動脈血管段組織中Wnt mRNA、FZD1 mRNA、AXIN1 mRNA、GSK-3β mRNA、β-連環素mRNA、VEGF mRNA水平 與健康組比較，模型組大鼠胸主動脈血管段組織中Wnt mRNA、FZD1 mRNA、AXIN1 mRNA、β-連環素 mRNA、VEGF mRNA水平下降，GSK-3β mRNA水平升高（P<0.01），與模型組比較，BL組與BH組大鼠Wnt mRNA、FZD1 mRNA、AXIN1 mRNA、β-連環素 mRNA、VEGF mRNA水平有所升高，GSK-3β mRNA水平有所下降（P<0.01），與BL組比較，BH組大鼠Wnt mRNA、FZD1 mRNA、AXIN1 mRNA、β-連環素 mRNA、VEGF mRNA水平較高，GSK-3β mRNA水平較低（P<0.01）。見表2，圖2。

2.3 各組大鼠血清中TNF-α、CRP水平 健康組大鼠血清中TNF-α、CRP表達比模型組低（P<0.01），模型組大鼠血清中TNF-α、CRP表達高于BL組與BH組（P<0.01），BL組大鼠血清中TNF-α、CRP表達比BH組高（P<0.01）。見表3，圖3。

2.4 各組大鼠血管內皮細胞形態檢測結果 倒置顯微鏡下觀察各組大鼠血管內皮細胞損傷24 h細胞形態，發現模型組與健康組血管內皮細胞比較，間隙寬、細胞形態變小、脫落；BL組血管內皮細胞與模型組較為接近；BH組血管內皮細胞間隙變窄，細胞死亡減少，形態有所改善。見圖4。

2.5 各組大鼠血管內皮細胞增殖情況的檢測結果健康組大鼠在不同時間點血管內皮細胞OD值均高于模型組（P<0.05），模型組血管內皮細胞在不同時間點的OD值較BL組低（P>0.05），BH組血管內皮細胞在不同時間點的OD值均高于BL組（P<0.05）。見表4，圖5。

2.6 各組大鼠血管內皮細胞凋亡情況的檢測結果健康組大鼠血管內皮細胞凋亡率（3.24±0.31）%低于模型組（25.41±2.07）%與BL組（24.86±2.37），差異有統計學意義（P<0.05），模型組與BL組血管內皮細胞凋亡率差異無統計學意義（P>0.05），BL組凋亡率高于BH組（14.26±1.08）%，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖6。

2.7 各組Wnt、FZD1、AXIN1、GSK-3β、β-連環素、VEGF水平比較 與健康組比較，模型組大鼠血管組織中Wnt、FZD1、AXIN1、β-連環素、VEGF蛋白水平下降，GSK-3β蛋白水平升高（P<0.01），與模型組比較，BL組與BH組大鼠血管組織中Wnt、FZD1、AXIN1、β-連環素、VEGF蛋白水平有所升高，GSK-3β水平有所下降（P<0.01），與BL組比較，BH組大鼠血管組織中Wnt、FZD1、AXIN1、β-連環素、VEGF蛋白水平較高，GSK-3β水平較低（P<0.01）。見表5，圖7。

3 討論

血管內皮細胞損傷是心腦血管疾病的發病基礎，該病是50歲以上中老年人群常見疾病，具有較高的患病率、致殘率、致死率，因此，對于血管內皮細胞損傷后的修復極為重要［9］。本實驗研究燈盞花素對血管內皮細胞損傷大鼠的保護機制及對Wnt/β-catenin信號通路的作用機制。

Wnt/β-catenin信號通路在正常細胞中不激活，已有研究證實，血管疾病的產生與該信號通路的異常表達有關［10］。Wnt通過與膜受體FZD結合，從而抑制GSK-3β與AXIN1的表達，降低β-連環素的磷酸化；β-連環素可作為血管內皮與肌動蛋白細胞骨架之間的支架，當存在Wnt配體FZD1時，可促使其轉移至細胞核內進行轉錄調節，并激活靶基因VEGF等轉錄，控制血管穩定性［11］。中醫學認為“久病必有瘀”，臟腑功能長期失調導致動脈硬化，因此，在對于其的治療應以活血化瘀為主，燈盞花素具有活血舒筋、化瘀止痛等功效［12］。華寶桐等［13］對人心臟微血管內皮細胞的研究中提出，燈盞花素可保護血管內皮細胞防止損傷，其作用機制是通過提高VEGF水平來完成的；JIANG等［14］實驗中提出，燈盞花素可通過降低GSK-3β水平，治療腦損傷大鼠；余文珍等［8］對頸動脈粥樣硬化大鼠的實驗中提出活血化瘀法可通過提高Wnt、FZD1、AXIN1、β-連環素、VEGF的水平，降低GSK-3β的表達可保護頸動脈血管內皮損傷。本研究結果與上述研究結果相似，燈盞花素對血管內皮損傷大鼠具有保護作用，其作用機制可能是燈盞花素通過降低GSK-3β水平、提高VEGF表達，從而提高Wnt、FZD1、AXIN1、β-連環素水平，阻止β-連環素磷酸化，控制血管穩定性，保護血管內皮損傷。在本HE染色結果表明，在經過燈盞花素治療后，血管內皮損傷及脫落有所改善，這一結果也可證實燈盞花素對血管內皮損具有保護作用。

TNF-α是炎癥介質和免疫調節因子，可介導內皮細胞損傷，加快動脈硬化惡化［15］。CRP能夠反映細胞損傷程度和炎癥嚴重程度，CRP過表達是心血管意外發生的重要因素之一，能夠增加心腦血管疾病發病的風險［16-18］。武迎磊等［19］對動脈硬化大鼠的實驗研究中提出，燈盞花素素通過降低TNF-α、CRP等水平，抑制炎癥反應，減少血管內皮損傷，對動脈粥樣硬化具有治療的作用。本研究結果與上述研究結果相似。

血管內皮細胞是構成血管平滑肌與血液之間的重要屏障，有著重要的生理調節作用［20］。李釗飛［21］對大鼠腦微血管內皮細胞損傷的實驗中提出，燈盞花素對血管內皮細胞損傷具有保護作用，并能表現出明顯的劑量效應關系，具體的作用機制可能與降低炎癥反應，促進血管內皮細胞增殖有關。本研究證實燈盞花素對血管內皮細胞具有一定的保護作用。

綜上所述，燈盞花素通過提高Wnt、FZD1、AXIN1、β-連環素、VEGF水平降低GSK-3β表達，控制血管的穩定性，從而對血管內皮細胞損傷大鼠的起保護作用。

利益沖突聲明：無。

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（2021-10-13收稿 本文編輯：吳珊）

基金項目：湖北省中醫藥中西醫結合科研項目計劃項目（a2013Z-Y46）作者簡介：白如君（1980.10—），女，碩士，主治醫師，研究方向：內分泌及代謝性疾病的臨床及研究，E-mail：yufangtu750574@163.com通信作者：劉俊（1976.12—），女，碩士，主管技師，研究方向：檢驗專業，E-mail：577363107qq.com