金匱腎氣丸和桂附地黃丸治療慢性腎小球腎炎作用機制探討*

吳雙，李家興，王雯澌，劉艷霞，徐巍巍，劉俊康

陸軍軍醫大學生藥學與中藥學教研室 重慶 400038

慢性腎小球腎炎（Chronic glomerulonephritis，CGN）大多起源于免疫介導的炎癥，以血尿、蛋白尿、水腫及高血壓為典型臨床表現，并且具有病程長、難以自愈特點，若治療不當，最終可發展為慢性腎衰竭[1]。現代醫學對于慢性腎小球腎炎的治療，主要采取糾正高血壓、調節水電解質平衡、抗血小板凝聚和積極控制感染等策略[2]，但是上述治療難以取得滿意效果。而中醫學在慢性腎小球腎炎的治療中具有巨大的潛力[3]。慢性腎小球腎炎在中醫古籍中并無明確病名，根據臨床表現可將其將歸為“水腫”“腰痛”“腎風”等范疇[4]。張仲景的《金匱要略》曾記載：“虛勞腰痛，少腹拘急，小便不利者，八味腎氣丸主之”[5]。 腎主水，腎氣虧虛，水液代謝受阻，引發或加重水腫，腰為腎之府，腎氣虧虛腎府失榮，不榮則痛[6]。因其出自《金匱要略》，后世也常將文中的八味腎氣丸稱作金匱腎氣丸。而實際上，目前市場上中成藥金匱腎氣丸并非仲景金匱腎氣丸，則是接近添加了牛膝和車前子的濟生腎氣丸；接近仲景金匱腎氣丸的中成藥替代品當屬桂附地黃丸[7]。

雖然目前傳統中醫藥已經在治療腎臟慢性疾病上有顯著成效，但是仍缺乏一套完整的解釋理論和標準規范，能見其效，不見其因，以致很多人存懷疑態度。網絡藥理學是一種運用現代網絡方法分析藥物與疾病和靶點之間“多成分、多靶點、多途徑”協同作用關系的藥理學方法[8]。本文運用中藥網絡藥理學的方法，利用公開數據信息庫挖掘出目前臨床上較為常用于治療腎臟疾病的藥物——金匱腎氣丸和桂附地黃丸的有效成分、中藥靶標、疾病靶標，構建“藥物-成分-靶標-疾病”的拓撲網絡，預測并比較金匱腎氣丸和桂附地黃丸在治療慢性腎小球腎炎的作用差異，推測其可能存在的分子作用靶點和通路，為后續的實驗研究提供理論支持[9]。

資料與方法

1 材料

TCMSP 數據庫是獲得藥物和靶點關系的中草藥系統藥理學平臺；Uniprot 數據庫是全球蛋白資源數據庫。人類基因數據庫Genecard 和人類在線孟德爾遺傳平臺OMIM 是收集疾病相關的基因的數據庫。String 數據庫是檢索和圖像化已知蛋白和預測蛋白之間互作關系的系統。Cytoscape 是可以對網絡進行分析的軟件。

2 方法

2.1 桂附地黃丸和金匱腎氣丸主要成分和靶點的檢索和篩選 登錄中藥系統藥理學技術平臺TCMSP，根據2020 版《中國藥典》中所述，分別以肉桂、澤瀉、山茱萸、茯苓，附子、山藥、牡丹皮、熟地黃為關鍵詞[10]檢索桂附地黃丸中有效成分。將成分通過TCMSP 數據庫的藥物口服利用度（OB）和類藥性（DL）等參數作為篩選條件。其中OB 是衡量藥物口服后，經胃腸道被吸收進入循環系統的指標，DL 是衡量藥物臨床療效的指標。在對中藥進行研究的過程中將OB ≥30%和DL ≥0.18 作為篩選標準[11]。使用同樣的方法，根據采用《中藥成方制劑》中所述，對今方金匱腎氣丸的主要成分（桂枝、山藥、附子、山茱萸、熟地黃、茯苓、澤瀉、牡丹皮、牛膝、車前子）[12]進行查詢并篩選。并利用已發表的文獻報道補充與活性化合物相關的已知靶點。然后，將收集到的活性成分所對應的靶點蛋白導入到Uniprot 數據庫，設定“Homo sapiens”（人屬）為關鍵詞，實現蛋白到基因名稱的轉化。

2.2 慢性腎小球腎炎相關靶點的查詢和匹配 在Genecards 數據庫和OMIM 數據庫以“慢性腎小球腎炎”的相關英文名稱“chronic glomerulonephritis”“chronic nephritis” “CGN”“CKD”等為關鍵詞檢索相關靶點蛋白，去除重復部分。將桂附地黃丸有效靶點與慢性腎小球腎炎相關靶點的關系進行分別對應，對比篩選出藥物和疾病共同的潛在靶點基因，并利用R語言及程序包VennDiagram 展示韋恩圖。并利用同樣方法繪制出金匱腎氣丸中靶點基因和疾病基因的交集。

2.3 Cytoscape 網絡的繪制 將上述查詢整理的藥物及有效成分和作用靶點導入到Cytoscape 軟件進行處理使之可視化，構建出藥物-有效成分-靶點基因網絡。每一個節點與其他節點的直接作用數量由自由度來表示，即自由度與生物學功能和重要性呈正相關[13]。

2.4 構建PPI 網絡 將上述篩選出的交集靶點蛋白導入到String 數據庫，以最低相互作用閾值等于0.4和“Human Sapiens”為蛋白質種類篩選交集基因，去除沒有相關性的靶蛋白，建立PPI 網絡，用以描述桂附地黃丸有效成分與慢性腎小球腎炎靶點。同理構建出金匱腎氣丸的PPI 網絡，并統計兩者的前15 節點數目排名。

2.5 KEGG 信號通路富集和GO 功能分析 使用KEGG 數據庫對重要靶點基因進行富集分析，篩選出信號通路滿足P，Q ≤0.05，并運用R 語言包進行顯示。再利用R 語言中的BiocManager 包和enrichGO 包對慢性腎小球腎炎潛在靶點分別和桂附與金匱的有效成分進行GO 分析，并以氣泡圖進行描述。

結 果

1 篩選的活性成分和預測的靶標

以上文對OB 和DL 值的限定，在TCMSP 數據庫對桂附地黃丸和金匱腎氣丸進行檢索，去重后得到核心活性成分，如圖1（a）（b）所示。

圖1 （a） 桂附地黃丸成分數據

圖1 （b） 金匱腎氣丸成分數據

2 藥物-疾病共同靶標結果

桂附地黃丸和金匱腎氣丸的韋恩圖如圖2（a）（b）所示。其中慢性腎小球腎炎的靶標基因為1849 個，桂附地黃丸和金匱腎氣丸的靶標基因分別為137 個和230 個，取交集后，治療靶點為58 和111 個。

圖2 （a）

圖2 （b）

3 藥物-有效成分-靶點-疾病網絡圖繪制結果

如圖3（a）（b）所示。每一個節點用不同顏色表示，紅色，綠色和藍色節點分別代表藥物，活性成分和作用靶點。點與點之間的連線代表了兩者之間的對應關系。圖3（a）為桂附地黃丸的藥物-有效成分-靶點-疾病相互作用網絡，包括7 個發揮作用的藥材，47 種藥材中的活性成分，137 個藥物作用靶點和1 種相關疾病，共計192 個節點和500 條連線。圖3（b）為金匱腎氣丸的藥物-靶點-疾病相互作用網絡，包括10 個發揮作用的藥材，81 種藥材中的活性成分，232 個藥物作用靶點和1 種相關疾病，共計324 個節點和895 條連線。

圖3 （a）

圖3 （b）

4 共同靶點的蛋白質-PPI 網絡構建分析

根據STRING 網站對篩選出來的治療慢性腎小球腎炎靶點蛋白進行分析得到的PPI 網絡圖見圖4（a）（b）。如圖4（a）所示桂附地黃丸57 種共同靶蛋白之間的相互作用關系，如圖4（b）所示金匱腎氣丸相互作用的110 個靶蛋白，節點和邊分別代表了靶蛋白和蛋白的互相關系，包括有既往實驗證明、基因共表達、基因共現、蛋白質同源、基因鄰接、基因融合等，桂附地黃丸和金匱腎氣丸的前15 節點數目排名見于圖5（a）（b）。

圖4 （a）

圖4 （b）

圖5 （a） 桂附地黃丸靶蛋白節點數目排名（示前15）

圖5 （b） 金匱腎氣丸靶蛋白節點數目排名（示前15）

5 共同靶點的KEGG 通路富集分析和GO 功能富集

根據KEGG 分析結果桂附地黃丸和金匱腎氣丸抗慢性腎小球腎炎預測靶點的通路分布，結果發現分別有150 條和167 條KEGG 代謝通路參與其中，圖6（a）（b）列舉了排在前面的15 條通路。以動脈粥樣硬化與脂質相關的信號通路為例，示桂附腎氣丸和金匱地黃丸主要作用靶點的具體機制見圖7（a）（b）。

圖6 （a） 金匱腎氣丸KEGG 信號通路分析

圖6 （a） 桂附地黃丸KEGG 信號通路分析

圖7 （a）

圖7 （b）

圖8（a）（b）展示GO 分析氣泡圖。生物過程由縱坐標表示，基因數量由橫坐標和氣泡的面積大小共同決定。P 值越小，氣泡紅色越深。

圖8 （a）

圖8 （a）

討 論

通過藥物-靶點-疾病網絡可發現，桂附地黃丸的網絡中，自由度較高的活性成分是kaempferol、beta-sitosterol、Stigmasterol、Tetrahydroalstonine、Kadsurenone，提示這些成分可能是桂附地黃丸治療慢性腎小球腎炎的物質基礎；自由度較高的靶點是NCOA2、PTGS2、PTGS1、PGR、NR3C2、HSP90、ADRA1B，提示這些靶點可能是桂附地黃丸治療慢性腎小球腎炎的關鍵靶點。而在金匱腎氣丸的網絡中，作用靶點較多的活性成分是kaempferol、beta-sitosterol、Stigmasterol、Tetrahydroalstonine、Kadsurenone，連接活性成分和通路較多的靶點是NCOA2、PTGS2、PTGS1、PGR、HSP90、NR3C2、ADRA1B。通過對比兩個網絡圖，可以初步發現金匱腎氣丸和桂附地黃丸在主要作用的活性成分和潛在靶點上效果基本類似。

通過PPI 網絡中可見，在桂附地黃丸在治療慢性腎小球腎炎中，可能是作用于TNF、AKT1、VEGFA、PPARG、CASP3、PTGS2、JUN 等核心靶點發揮作用。而在金匱腎氣丸治療慢性腎小球腎炎中，可能是作用于TNF、ATK1、IL-6、VEGFA、IL1-β、JUN、CASP3等核心靶點發揮作用。其中兩者都包括的相互作用較為密切的蛋白有TNF、AKT1、VEGFA、PPARG 和CASP3 等。其中，TNF 可以促進細胞凋亡，在自身免疫疾病和炎癥中發揮重要作用[14]，通過調控TNF-α可以保護腎臟[15]；VEGFA 可以抑制細胞凋亡，參與血管通透性調節[16]；PPARG 在參與激活某種受體，進而促進過氧化物酶體增殖中發揮重要作用[17]；CASP3 參與負責凋亡執行的半胱天冬酶的激活級聯[18]。兩者藥物的靶點都主要涉及炎癥物質產生，細胞生長與凋亡，脂質代謝，下游基因轉錄等方面，由此我們可以推測兩種藥方可能通過抑制細胞凋亡，降低炎癥反應，改善腎血管通透性等方面來減輕腎臟損傷。

在GO 富集和KEGG 通路富集中，兩者排名較前且有分子作用價值的通路都有脂質和動脈粥樣硬化信號通路、AGE-RAGE、乙肝、化學致癌受體激活、PI3K/Akt、EB 病毒感染、人乳頭瘤病毒感染、HIF-1、TNF 等信號通路。通過介導AGE-RAGE、TNF、PI3K/AKT、HIF-1 等這些信號通路，桂附地黃丸和金匱腎氣丸參與了機體脂質和糖類代謝、氧化應激反應、營養水平、抗細菌病毒、抗細胞凋亡等生物學過程以發揮其治療效果。綜合兩者的蛋白互作（PPI）網絡和KEGG 通路富集分析中可見，慢性腎小球腎炎的發生存在眾多的核心靶基因，其中與TNF、AKT1、VEGFA、CASP3、JUN 等關系最為密切，其發病信號通路主要包括AGE-RAGE、TNF、PI3K/Akt、HIF-1 通路等。對比金匱腎氣丸的網絡藥理學分析，我們不難發現不論是金匱腎氣丸，還是桂附地黃丸，在調節血脂異常，抑制動脈粥樣硬化的斑塊形成、抑制細胞異常凋亡、調節腎臟對尿糖的過濾和重吸收，防止腎性糖尿病的發生、防止抗原免疫復合物在腎小球的沉積發揮了相同的作用。

但是，仔細對比兩者KEGG 通路可以發現，一方面金匱腎氣丸作用的靶蛋白和通路較桂附地黃丸更多，這一方面是由于金匱腎氣丸比桂附地黃丸多了牛膝和車前子兩味藥，因此擁有更多的活性成分。另一方面，金匱腎氣丸將古方中的肉桂替換成桂枝，有文章表明在桂枝皮部的有效成分更高，且直徑與皮部含量成負相關[19]。這也就不難理解，為什么桂枝相較于肉桂的活性成分會有明顯的增加。另一方面作為同樣的靶點，金匱腎氣丸作用的更集中于通路下游，以圖7（a）（b）脂質和動脈粥樣硬化信號通路為例。金匱腎氣丸和桂附地黃丸均可通過調節內皮細胞上的基質金屬蛋白酶1（MMP1），調控下游PI3K-AKT途徑，進而抑制eNOS、Bax 的產生，減少細胞凋亡，同時可以通過下調JNK-AP-1 途徑抑制炎癥因子的產生以及單核巨噬細胞的粘附和趨化，減少粥樣斑塊的破裂，改善血管硬化。但在對比桂附地黃丸和金匱腎氣丸通路圖時，我們發現金匱腎氣丸更多作用于通路下游的單核細胞粘附趨化因子，炎癥因子等，直接調控這些趨化因子發揮作用。除此外，金匱腎氣丸還可以調控apoB 和apoB100，調控低密度脂蛋白運輸，進而改善脂質血管沉積。

綜上所述，有多種核心靶基因及其相關的信號通路牽涉到了慢性腎小球腎炎的發病機制中[20]。我們通過網絡藥理學比較了金匱腎氣丸和桂附地黃丸在治療慢性腎小球腎炎的活性成分和信號通路，一分子對應多靶點，且一靶點對應多通路[21]，揭示了兩種中成藥在抗慢性腎小球腎炎這一自身免疫性疾病過程中多成分、多靶點、多通路的作用特點，并比較兩種藥在治療過程中的相同和不同之處，為后續課題組在抗慢性腎小球腎炎實驗設計優化和具體機制闡述提供了數據參考。但受限于當前中藥的數據庫仍存在數據資源不足的問題，使得所探究的中藥化學成分及靶點可能與實際存在出入，因此關于金匱腎氣丸在慢性腎小球腎炎治療方面是否較桂附地黃丸有更好的效果，仍需要依靠文獻報道，實驗驗證等方式進一步證實金匱腎氣丸和桂附地黃丸治療慢性腎小球腎炎的作用機制差異。同時在KEGG 通路富集分析中，二者除了在治療慢性腎小球腎炎外，還在肝炎、化學物質致癌、EB 病毒感染、卡波氏肉瘤等通路發揮作用，可以考慮通過尋找二者共同作用的免疫學相關的靶點和相關機制來加以具體解釋，為后續相關疾病的治療提供理論支持。