高效液相色譜法同時測定清肝益脾膠囊中靛藍和靛玉紅含量*

徐明昊，王斯琦，蘇子衡，潘韻芝，程軍平△

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇蘇州 215000； 2. 江蘇省蘇州市第五人民醫(yī)院，江蘇蘇州 215000）

清肝益脾膠囊系中醫(yī)臨床經(jīng)驗方，具有改善肝功能、降酶、退黃，增強細胞免疫功能，有疏肝健脾、清利濕熱功效。該方以泥鰍為君藥，清熱疏肝、調(diào)節(jié)免疫，輔以臣藥青黛抗炎保肝，最后佐以僵蠶提高機體免疫力，全方配伍得當，臨床治療慢性乙肝的療效良好［1-2］。但現(xiàn)行質(zhì)量標準中檢測項僅有制劑通則要求的項目，不利于清肝益脾膠囊的質(zhì)量控制。青黛藥材中靛藍和靛玉紅為發(fā)揮抗肝損傷的主要有效成分。本研究中通過查閱文獻［3 - 5］，建立了同時測定清肝益脾膠囊中靛藍和靛玉紅含量的高效液相色譜（HPLC）法，以為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型液相色譜儀（美國Agilent公司），包括四元泵，全自動進樣器，檢測器，蒸發(fā)光散射檢測器，工作站；XO-5200DTD型超聲波清洗機（南京先歐儀器制造有限公司）；1-14K型高速離心機（美國Sigma-Aldrich公司）；PL203型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

清肝益脾膠囊（蘇州市第五人民醫(yī)院自制，批號分別為20200808，20201019，20210228）；靛藍對照品（批號為J1726025，含量≥98%），靛玉紅對照品（批號為20121805，含量≥98%），均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇（色譜純，江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司，批號為20210401）；N，N-二甲基甲酰胺（色譜純，生工生物工程上海股份有限公司，批號為G506BA1009）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS柱（250 mm×4.6 mm，25 μm）；流動相：甲醇-水（70∶30，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：290 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

分別取靛藍、靛玉紅對照品13.20，11.40 mg，精密稱定，分別置100 mL容量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺適量，超聲（功率250 W、頻率40 kHz，下同）使溶解，再加N，N-二甲基甲酰胺定容，搖勻，即得單一對照品貯備液；各取適量，加N，N-二甲基甲酰胺制成混合對照品溶液。取樣品內(nèi)容物粉末約0.1 g，精密稱定，置100 mL磨口錐形瓶中，精密加入N，N- 二甲基甲酰胺10 mL，稱定質(zhì)量，在25 ℃下超聲提取30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用N，N-二甲基甲酰胺補足減失的質(zhì)量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得質(zhì)量濃度為10.00 mg/mL的供試品溶液。按清肝益脾膠囊處方及工藝制備不含青黛藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液［6-9］。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗及專屬性試驗：精密量取2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，與對照品溶液色譜有相同色譜峰，各色譜峰基線分離良好，且陰性對照無干擾。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Indigo 2.Indirubin A.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取靛藍、靛玉紅對照品各適量，精密稱定，分別加入N，N- 二甲基甲酰胺溶液制成質(zhì)量濃度分別為7.63，15.25，30.50，61.00，122.00 μg/mL和5.00，10.00，20.00，40.00，80.00 μg/ mL 的系列對照品溶液。各取10 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以待測成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，靛藍為Y1=40.493X1+76.128（R2=0.999 8，n=5），靛玉紅為Y2=34.631X2-9.045 8（R2=1.000 0，n=5）。結(jié)果表明，靛藍和靛玉紅質(zhì)量濃度分別在7.63～122.00 μg/mL和5.00～80.00 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好［10］。

精密度試驗：取2.2項下同一批（批號為20201019）供試品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果靛藍、靛玉紅峰面積的RSD分別為0.20%和2.13%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為20201019）供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，10，12，24 h時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果靛藍和靛玉紅峰面積的RSD分別為0.46%和2.31%（n=8），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為20201019）內(nèi)容物適量，共6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果靛藍、靛玉紅含量的RSD分別為0.26%和2.10%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的供試品溶液6 份，分別精密加入2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測定

取3 批樣品內(nèi)容物各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，計算樣品中靛藍和靛玉紅含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品中靛藍和靛玉紅含量測定結(jié)果（μg/mg，n=3）Tab.2 Results of content determination of indigo and indirubin in samples（μg/mg，n=3）

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

預(yù)試驗中，考察了甲醇-水流動相比例，以待測色譜峰的峰形和分離度為考察指標，發(fā)現(xiàn)為甲醇- 水為70∶30（V/V）時靛藍和靛玉紅的出峰時間適宜，色譜峰峰形良好、柱效高；又考察了25，30 ℃柱溫下的圖譜，發(fā)現(xiàn)30 ℃時的色譜峰峰形好、柱效高；還考察了流速，發(fā)現(xiàn)1.0，0.5 mL/ min 流速下出峰時間適宜、峰形好，綜合時效，最終選擇流速為1.0 mL/min。

3.2 樣品含量測定結(jié)果分析

清肝益脾膠囊是3味藥材粉末填充膠囊，在制備供試品溶液時采取超聲提取法，取膠囊中的混合藥粉，精密稱定，加入N，N-二甲基甲酰胺溶液，超聲30 min 提取靛藍、靛玉紅；此外，研究中還發(fā)現(xiàn)清肝益脾膠囊中靛藍的含量受藥品貯存時間的影響，其原因可能是青黛藥材中靛藍和靛玉紅是同分異構(gòu)體，由于光照、溫度和時間等因素的影響，可能發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，但含量均在合理范圍內(nèi)，因此藥品在貯存時應(yīng)盡可能將其置避光處，并放入棕色瓶進行避光，同時要保證供試品溶液在24 h 內(nèi)測定完畢。制劑中靛玉紅含量穩(wěn)定性較好，說明該檢測方法具有科學(xué)性和準確性。

3.3 制劑質(zhì)量標準提升的必要性

清肝益脾膠囊是蘇州市第五人民醫(yī)院的協(xié)定方，具有多年的臨床實用經(jīng)驗，根據(jù)臨床數(shù)據(jù)顯示，該處方治療肝纖維化效果較佳，在治療肝損傷疾病方面有良好作用，用清肝益脾膠囊治療1 000 例乙肝患者，總有效率達85%，發(fā)現(xiàn)清肝益脾膠囊在調(diào)節(jié)機體免疫力、清除復(fù)合物及機體的肝細胞恢復(fù)等方面有重要作用［11］。但清肝益脾膠囊現(xiàn)有質(zhì)量標準不足以驗證藥品的安全性、穩(wěn)定性及有效性［12］。優(yōu)化生產(chǎn)工藝、不斷提高質(zhì)量控制水平和質(zhì)量標準是院內(nèi)制劑發(fā)展的必由之路［13］。

3.4 方法評價

本研究中建立的方法操作簡便，結(jié)果準確，專屬性強，可用于清肝益脾膠囊的質(zhì)量控制，保障院內(nèi)制劑的品質(zhì)和制劑工藝的穩(wěn)定，并可為制劑質(zhì)量標準的提高提供依據(jù)。