血清腫瘤標志物聯合檢測在非小細胞肺癌診斷和預后評估中的價值

張念倫，孔芹，薄麗英，姜冰雪

肺癌是最常見的惡性腫瘤，據世界衛生組織統計[1]目前肺癌的發病率和死亡率均居所有惡性腫瘤之首，給人類健康帶來嚴重威脅。肺癌組織學類型分為非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)兩類，其中85%～90%為NSCLC[2]。早期肺癌并無特異性臨床癥狀，一旦出現如咳血、脊背放射疼、惡病質等典型臨床癥狀來醫院就診時已處于晚期，即使經過治療預后也極差，病死率高。統計數字顯示[3]原位肺癌治愈率接近100%，早期肺癌經根治性手術5年生存率可達60%～90%，而晚期肺癌5年生存率僅為5%～20%。因此肺癌早期診斷、早期根治性手術尤為重要，能極大提高生存率，改善預后[4-5]。肺穿刺組織活檢病理學檢查是診斷肺癌的金標準，但作為有創檢查不適合高危人群篩查及預后隨訪，低劑量多層螺旋CT檢查在高危人群肺癌的篩查中得到了推廣應用，但對于一些小病灶容易誤診和漏診[6]。血清腫瘤標志物檢測是一種體外無創非侵入式液體活檢診斷技術，能檢測到多種與惡性腫瘤相關的生物學標志物，它在惡性腫瘤的診斷中越來越受到臨床重視，也是對影像學診斷的有效補充，它適合高危人群篩查及預后隨訪。微小RNA-21(miRNA-21)、癌胚抗原(CEA)、鱗狀細胞癌抗原(SCCAg)是與肺癌發生發展密切相關的標志物。本研究欲選取血清miRNA-21、CEA、SCCAg聯合檢測診斷肺癌，以期為肺癌的早期診斷提供實驗室依據。

1 一般資料與方法

1.1 一般資料 資料收集于2015年6月至2016年12月在日照市人民醫院初次確診的118例NSCLC患者(惡性腫瘤組)為研究對象，男71例，女47例；年齡38～82歲，平均年齡(62.53±15.69)歲；臨床分期：Ⅰ期28例、Ⅱ期38例、Ⅲ期37例、IV期15例；組織類型：鱗癌53例、腺癌65例；分化程度：高分化32例，中分化45例，低分化41例。選取同期來醫院就診的50例肺部良性病變患者為良性對照組，均經病理學、影像學及血清學等排除癌變，包括肺良性結節、肺結核、肺炎等，其中男28例，女22例；年齡35～83歲，平均年齡(63.16±16.23)歲。另選取50例健康志愿者為正常對照組，男31例，女19例；年齡34～81歲，平均年齡(62.98±15.67)歲。三組人群性別、年齡等基線資料比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 選取標準 納入標準：118例NSCLC患者均經病理組織學確診；確診前均未接受任何抗腫瘤治療；均有血清miRNA-21、CEA、SCCAg檢查資料及隨訪資料。排除標準：排除伴其他系統惡性腫瘤患者；排除嚴重肝腎功能不全者；排除研究資料不全者。

1.3 方法 清晨06：00—09：00抽取惡性腫瘤組及良性對照組和正常對照組空腹靜脈血5 mL，靜置自凝后分離血清待檢。

血清miRNA-21采用實時熒光定量PCR法檢測。血清總RNA 提取試劑盒購于美國Applied Biosyste公司，反轉錄試劑盒購于日本TaKaRa 公司，引物由上海生工生物工程公司設計和合成，PCR試劑盒購于北京艾德萊生物科技有限公司，ABI-7300型PCR儀購于美國Applied Biosyste公司。各反應步驟嚴格按照操作說明進行。以U6為內參，采用2-△△Ct的方法計算血清miRNA-21相對表達量。

血清CEA、SCCAg采用免疫電化學發光法檢測，儀器為德國羅氏e-801，試劑為羅氏配套試劑。

1.4 結果判斷 單項檢測結果判斷：血清miRNA-21、CEA、SCCAg單項檢測超過截斷值即判斷診斷NSCLC陽性，等于或低于截斷值即判斷診斷NSCLC 陰性；聯合檢測結果判斷：血清miRNA-21、CEA、SCCAg聯合檢測組合中，有一項或一項以上超過截斷值即判斷診斷NSCLC陽性，均等于或低于截斷值即判斷診斷NSCLC陰性。

1.5 預后評價 治療結束后隨訪5年，每3個月來醫院復查一次，復查項目包括影像學和血清miRNA-21、CEA、SCCAg檢查，記錄每次復查結果。在隨訪過程中發現復發、新的轉移灶或死亡為發生事件，停止隨訪；隨訪過程中未發現復發、未出現新的轉移灶或未出現死亡為無發生事件。

1.6 統計學方法 所得數據采用SPSS 20.0統計軟件處理，計量數據以均數±標準差(±s)表示，兩組間數據比較采用獨立樣本t檢驗，多組間計量數據比較采用方差(F)分析；以率[n(%)]表示計數資料，組間比較行χ2檢驗。繪制ROC曲線求取血清miRNA-21、CEA、SCCAg 診 斷NSCLC 最 佳 截 斷值，采用Logistic多元回歸進行多因素分析，利用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗生存分析。以病理診斷為金標準，用四格表法統計計算血清miRNA-21、CEA、SCCAg 單 項 及 聯 合 檢 查 診 斷NSCLC的價值。

2 結果

2.1 三組人群血清miRNA-21、CEA、SCCAg表達水平比較 惡性腫瘤組血清miRNA-21、CEA、SCCAg表達水平明顯高于良性對照組和正常對照組(P＜0.01)；良性對照組和正常對照組血清miRNA-21、CEA、SCCAg水平比較差異無統計學意義(t＝0.665、1.558、1.894，P＝0.506、0.123、0.061)，P＞0.05，見表1。

表1 三組人群血清miRNA-21、CEA、SCCAg表達水平比較(±s)

表1 三組人群血清miRNA-21、CEA、SCCAg表達水平比較(±s)

注：miRNA-21＝微小RNA-21，CEA＝癌胚抗原，SCCAg＝鱗狀細胞癌抗原，下同；與兩個對照組比較，aP＜0.01。

組別 例數 miRNA-21 CEA/(ng·mL-1) SCCAg/(ng·mL-1)惡性腫瘤組 118 4.93±1.22a 121.36±33.56a 86.37±21.03a良性對照組 50 1.32±0.40 3.69±0.92 2.03±0.49正常對照組 50 1.17±0.35 3.42±0.81 1.85±0.46 F值 344.796 460.598 498.929 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 惡性腫瘤組患者血清miRNA-21、CEA、SCCAg表達水平與不同臨床病理因素關系 惡性腫瘤組患者血清miRNA-21、CEA、SCCAg水平與患者年齡、性別無相關性(P＞0.05)，腫瘤直徑＞3 cm、臨床高分期、低分化、復發、轉移及治療前患者血清miRNA-21、CEA、SCCAg水平明顯高于腫瘤直徑≤3 cm、臨床低分期、高中分化、無復發、無轉移及治療后血清水平(P＜0.05)，miRNA-21 在鱗癌和腺癌血清表達水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)，CEA在腺癌血清表達水平高于鱗癌(P＜0.01)，SCCAg在鱗癌血清表達水平高于腺癌(P＜0.01)，見表2。

表2 惡性腫瘤組血清miRNA-21、CEA、SCCAg表達水平與不同臨床病理因素關系(±s)

表2 惡性腫瘤組血清miRNA-21、CEA、SCCAg表達水平與不同臨床病理因素關系(±s)

注：組內分別比較，bP＜0.05。

?項目 例數 miRNA-21 t值 P值 CEA/(ng·mL-1) t值 P值 SCCAg/(ng·mL-1) t值 P值年齡/歲 1.605 ＞0.05 1.840 ＞0.05 1.848 ＞0.05≤60 49 4.74±1.21 130.12±35.26 95.28±27.35＞60 69 5.11±1.25 114.97±49.35 80.04±22.31性別 1.076 ＞0.05 1.630 ＞0.05 1.000 ＞0.05男71 4.77±1.18 125.34±34.26 88.25±25.14女47 5.06±1.75 115.35±29.87 83.53±25.01腫瘤直徑/cm 5.959 ＜0.01 5.252 ＜0.01 6.675 ＜0.01≤3 51 3.93±1.10 102.97±28.64 65.51±19.47＞3 67 5.67±1.85b 135.36±36.25b 102.25±35.42b組織類型 0.671 ＞0.05 7.363 ＜0.01 13.190 ＜0.01腺癌 65 4.86±1.23 140.23±37.52b 54.33±20.51鱗癌 53 5.01±1.18 98.22±19.68 125.67±37.26b臨床分期 11.170 ＜0.01 6.822 ＜0.01 15.470 ＜0.01Ⅰ～Ⅱ期 66 3.50±1.03 102.43±26.89 45.49±15.32Ⅲ～Ⅳ期 52 6.75±2.06b 145.39±41.25b 138.26±45.61b分化程度 11.061 ＜0.01 8.130 ＜0.01 11.900 ＜0.01高、中分化 77 3.81±1.15 104.85±27.64 62.99±24.36低分化 41 7.03±2.14b 152.37±38.76b 130.26±39.81b淋巴結轉移 2.569 ＜0.05 5.647 ＜0.01 5.744 ＜0.01無45 4.40±1.19 98.82±30.17 67.09±24.10有73 5.26±2.04b 135.26±36.21b 98.26±27.65b遠處轉移 9.290 ＜0.01 9.294 ＜0.01 11.940 ＜0.01無103 4.45±1.17 110.10±32.15 72.92±27.11有15 8.25±2.86b 201.43±54.27b 178.62±56.13b復發 9.316 ＜0.01 11.030 ＜0.01 11.470 ＜0.01無79 4.02±1.20 97.97±27.06 64.55±23.59有39 6.82±2.06b 168.74±42.15b 130.56±38.67b治療 26.580 ＜0.01 36.990 ＜0.01 37.860 ＜0.01前118 4.93±1.22b 121.36±33.56b 86.37±21.03b后118 1.57±0.63 6.78±2.42 4.35±1.98

2.3 Logistic多因素回歸分析 以血清miRNA-21、CEA、SCCAg表達水平為自變量，以是否發生NSCLC為因變量，進行多因素Logistic多元回歸分析，結果顯示血清miRNA-21、CEA、SCCAg水平均是影響發生NSCLC的獨立危險因素，見表3。

表3 Logistic多因素回歸分析

2.4 預后評價 治療后隨訪5年，血清miRNA-21、CEA、SCCAg高水平表達組(miRNA-21＞6.12、CEA＞156.43 ng/mL、SCCAg＞134.26 ng/mL)5年無事件生存率明顯低于低水平表達組(miRNA-21≤6.12、CEA≤156.43 ng/mL、SCCAg ≤134.26 ng/mL)，P＜0.01，見圖1～3。

圖1 血清miRNA-21水平與NSCLC患者5年生存關系

圖2 血清CEA水平與NSCLC患者5年生存關系

圖3 血清SCCAg水平與NSCLC患者5年生存關系

2.5 血清miRNA-21、CEA、SCCAg單項及聯合檢測診斷NSCLC的價值比較 以惡性腫瘤組、良性對照組血清miRNA-21、CEA、SCCAg表達水平繪制診斷NSCLC的ROC曲線，求取其診斷NSCLC的最佳截斷值。ROC曲線顯示血清miRNA-21、CEA、SCCAg診斷NSCLC的曲線下面積(AUC)分別為0.826(95%CI：0.775，0.896)、0.798(95%CI：0.729，0.873)、0.787(95%CI：0.715，0.862)；最大約登指數分別為0.779、0.665、0.653，對應診斷NSCLC最佳截斷值分別為miRNA-21：2.51，CEA：5.79 ng/mL，SCCAg：3.12 ng/mL。

以病理診斷為金標準，血清miRNA-21、CEA、SCCAg單項及聯合檢測診斷NSCLC價值，見表4。血清miRNA-21、CEA、SCCAg三項聯合檢測診斷NSCLC的敏感性、準確性、陰性預測值與各單項比較明顯提高(P＜0.01)。

表4 血清miRNA-21、CEA、SCCAg單項及聯合檢測診斷NSCLC的價值比較 單位：%

3 討論

惡性腫瘤是在多種致癌因素相互作用下細胞增殖、分化失控而致癌變，在這個發生發展過程中機體會產生多種腫瘤相關物質，俗稱腫瘤標志物[7]。腫瘤標志物可以是腫瘤細胞自身分泌產生的，也可以是腫瘤與機體相互作用產生的，它們可以存在于腫瘤組織內，也可以分泌到體液包括外周血液循環中[8]。腫瘤標志物表達異常，提示體內惡性腫瘤可能存在。由于癌基因的復雜性，一種惡性腫瘤可以產生多種標志物，同時一種標志物可以存在于多種惡性腫瘤中，它們的敏感性、特異性不盡相同，單項檢測價值有限，根據每種惡性腫瘤的性質有選擇的數種腫瘤標志物聯合檢測是提高診斷符合率的有效方法[9]。

miRNA是一類單鏈非編碼的小分子RNA，以反轉錄后的方式通過調控不同基因的表達，參與了細胞分化、增殖、黏附、凋亡等多種重要的生物學活動[10]。miRNA在惡性腫瘤的發生發展過程中發揮癌基因或抑癌基因作用，促進或抑制惡性腫瘤的生成[11]。miRNA-21是miRNA家族中的一員，研究表明[12]miRNA-21在肺癌組織或血清中表達上調，作為癌基因促進癌細胞的增殖、轉移及抑制癌細胞凋亡，與肺癌的發生發展密切相關。相關報道顯示[13]miRNA-21在NSCLC血漿表達水平顯著高于對照組，可以作為診斷NSCLC的相關性指標。本研究miRNA-21診斷肺癌的敏感性為72.88%，與報道基本一致；NSCLC外周血miRNA-21表達水平與腫瘤臨床分期呈明顯正相關，復發轉移者外周血miRNA-21表達水平升高更明顯[14]。miRNA-21可以作為一種新型標志物用于NSCLC 診斷及預后判斷。

CEA是來自于胚胎發育時期一種抗原物質，出生后正常健康人群外周血含量很低，一般小于5.00 ng/mL。惡性腫瘤細胞尤其腺癌細胞可以分泌大量CEA，從而使血清CEA表達水平升高[15]。CEA在肺癌患者血清有不同程度表達，尤其NSCLC中的腺癌患者血清有高表達。劉小燕[16]研究表明NSCLC組中CEA在腺癌患者血清表達水平高于鱗癌，我們的研究與此一致。研究發現[17]肺癌臨床高分期、低分化、復發轉移患者血清CEA水平明顯高于臨床低分期、高中分化、無復發轉移患者血清水平，治療有效后血清CEA水平明顯降低，因此CEA是判斷腫瘤復發轉移與評估預后較好的血清學指標。

SCCAg是一種糖蛋白，是鱗狀上皮癌的相關標志物。當上皮細胞發生惡變時，惡性細胞增殖產生大量SCCAg，釋放入血而引起外周血SCCAg異常增高，SCCAg是最早用于診斷宮頸癌的相關標志物[18]。近幾年研究發現[19]SCCAg也是肺癌發生發展過程中的一種相關標志物。李文明等[20]研究表明，SCCAg對NSCLC的診斷敏感性高于SCLC，鱗癌又高于腺癌，其對肺鱗癌、肺腺癌、小細胞肺癌診斷敏感性依次為65.00%、52.10%、12.50%，說明SCCAg對NSCLC尤其鱗癌診斷價值較高。不過一些肺部良性疾病如個別良性肺結節、肺結核也有一過性升高現象，因此對待檢驗結果要注意鑒別[21]。

本研究結果顯示，惡性腫瘤組患者血清miRNA-21、CEA、SCCAg水平明顯高于對照組，惡性腫瘤組患者腫瘤直徑＞3 cm、臨床高分期、低分化、復發、轉移及治療前患者血清miRNA-21、CEA、SCCAg水平明顯高于腫瘤直徑≤3 cm、臨床低分期、高中分化、無復發、無轉移及治療后患者血清水平，miRNA-21水平與NSCLC組織類型無相關性(P＞0.05)，CEA在腺癌血清表達水平高于鱗癌(P＜0.01)，SCCAg在鱗癌血清表達水平高于腺癌(P＜0.01)；血清miRNA-21、CEA、SCCAg水平是發生NSCLC的獨立危險因素；依據生存曲線可評估預后。

血清miRNA-21、CEA、SCCAg三項聯合檢測診斷NSCLC的敏感性和準確性明顯高于單項檢測，聯合檢測可以相互補充相互印證，減少誤漏診，有利于肺癌早期診斷。