3種植物揮發物緩釋劑的篩選

錢曉香，母 妮，楊六三，劉 航，陳 明，肖 春，董文霞

（云南農業大學 植物保護學院/云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201）

植物揮發物在植食性昆蟲的寄主定向、產卵、聚集等行為中發揮著重要的作用。不少植物揮發物成分對植食性昆蟲具有引誘作用，一些植物揮發物已經在田間試驗中表現出對害蟲較高的引誘活性［1］。但是由于植物揮發物具有較強的揮發性，持效期短，很難起到在較長時間內控制害蟲的目的，因而其在田間的應用受到了較大的限制。因此，迫切需要研制出良好的植物揮發物緩釋劑，控制植物揮發物的釋放速率，延長持效期，提高植物揮發物對害蟲的引誘效果。

一些研究發現，植物揮發物組分中d-檸檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯對一些害蟲具有引誘活性。在室內行為測定中，將d-檸檬烯放入味源瓶中，能夠引誘柑橘大實蠅(Bactrocera minax)的雄蟲［2］；將d-檸檬烯滴加在濾紙上，可以引誘花椒窄吉丁(Agrilus zanthoxylumi)的雄蟲、朱紅毛斑蛾(Phauda flammans)的雌雄成蟲［3-4］；將d-檸檬烯加入橡膠塞中，對草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的雌蟲具有引誘作用［5］。室內行為實驗結果表明：將β-石竹烯滴加在濾紙上，能夠引誘普通大薊馬(Megalurothrips usitatus)、斑翅果蠅(Drosophila suzukii)的雌蟲、朱紅毛斑蛾的雌雄成蟲［4,6-7］；將β-石竹烯放入味源瓶中，能夠引誘橘小實蠅(Bactrocera dorsalis)的雌蟲［8］。此外，將β-石竹烯加入棉芯中，在田間可以顯著引誘番石榴實蠅(Bactrocera correcta)的雄蟲［9］；將十四酸乙酯滴在棉花團上，在棗園中能誘集到大量的棗實蠅(Carpomya vesuv-iana)，在沙棘林里能誘集到沙棘繞實蠅(Rhagoletis batava)［10-11］。這些研究均限于室內行為測定或者田間初步實驗，還沒有真正將植物揮發物制成緩釋劑應用于害蟲的田間防治，主要由于這幾種植物揮發物的揮發性太強，在濾紙片或者味源瓶中30 min之內就完全釋放［12］。目前常用的緩釋材料有橡膠塞、液體石蠟+離心管、聚乙烯小瓶、微膠囊、迷向絲、蠟滴等［13-15］。其中，橡膠塞是一種傳統的緩釋材料［16］，已經被廣泛用于蛾類昆蟲性信息素的研究，但其在自然條件下難以降解。大部分植物揮發物的分子量比信息素揮發物的更小，揮發性更強，橡膠塞是否適合作為植物揮發物的緩釋材料應用于田間害蟲防治，還不清楚。有研究將植物揮發物組分加到液體石蠟+離心管緩釋材料中，制成誘劑用于害蟲的田間引誘試驗［15,17-18］。但是這些研究均未涉及植物揮發物成分在液體石蠟+離心管中的釋放速率和持效期。2009年，Zada等［19］首次報道了一種新的緩釋材料溶膠—凝膠的合成方法。2014年，Bian等［20］將該方法用于10種茶樹揮發物組分（順-3-己烯醇、6-甲基-5-庚烯-2-醇、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇、順-3-己烯乙酸酯、反-2-己烯丁酸酯、己酸葉醇酯、苯甲醛、水楊酸甲酯、反-肉桂醛、反-2-己烯醛）緩釋劑的制備，這些揮發物在溶膠—凝膠的持效期均長于14 d，其中順-3-己烯醇、反-2-己烯醛、β-芳樟醇緩釋劑對茶蚜(Toxoptera aurantii)具有良好的誘集效果，表現出了良好的應用前景。除了上述10種植物揮發物外，其他植物揮發物在溶膠—凝膠緩釋劑中持效期的研究還未見報道。

為了明確適合應用于田間害蟲防治的d-檸檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯緩釋劑型，筆者比較了室外條件下這3種植物揮發物在橡膠塞、液體石蠟+離心管、溶膠—凝膠中的釋放速率和持效期，從中篩選出了這3種揮發物的最適緩釋劑，以期為其田間應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試標準化合物的信息見表1。

表1 供試標準化合物的純度及來源

1.2 試驗方法

1.2.1 不同溶劑中3種化合物含量測定的標準曲線繪制 正己烷溶劑中3種化合物含量-峰面積的標準曲線繪制：通過預實驗確定3種化合物在橡膠塞中的殘留量大概范圍以及從液體石蠟+離心管中釋放的大概劑量，將化合物的標準樣品配制成1、10、50、200、500、1000 μg/mL共6個濃度梯度的正己烷溶液，利用氣相色譜儀(Agilent Technologies，GC 7890 A)進行定量分析，其升溫程序與Zhang等［21］的研究一致，進樣量1 μL；每個濃度重復3次，繪制化合物的含量-峰面積標準曲線方程（表2），用于測定揮發物在橡膠塞中殘留量及從液體石蠟+離心管中的釋放量。

表2 3種化合物含量-峰面積的標準曲線方程

甲醇溶劑中3種化合物含量-吸光率的標準曲線繪制：通過預實驗確定3種化合物在溶膠—凝膠中殘留量的大概范圍，將化合物的標準樣品配制成1、10、100、500、800、1000 μg/mL共6個濃度梯度的甲醇溶液，采用紫外分光光度計(GE/Biochrom 80-2112-21，Ultrospec 2100)先對3種化合物的吸收波長進行鑒定，再測定每種化合物對應6個濃度的吸光率，每個濃度3個樣品，每個樣品檢測3次吸光率，最終建立3種化合物的含量-吸光率標準曲線方程（表3），用于3種揮發物在溶膠—凝膠中殘留量的測定。

表3 3種化合物含量-吸光率的標準曲線方程

1.2.2 緩釋劑型的制備 橡膠塞緩釋劑型的制備：將d-檸檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯這3種化合物分別配制成濃度為20 mg/mL的正己烷溶液；各取配制的正己烷溶液100 μL分別置于橡膠塞凹槽內，等待溶劑完全吸收后使用。

液體石蠟+離心管緩釋劑型的制備：將d-檸檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯這3種化合物分別配制成濃度為4 mg/mL的液體石蠟溶液，取500μL置于1.5 mL離心管內，蓋緊蓋子，管蓋上有1個直徑為1.5 mm的圓孔。

溶膠—凝膠緩釋劑型的制備：參照Zada等［19-20］的溶膠—凝膠合成方法，加入194 μL HCl（pH值為2）和776 μL蒸餾水，化合物用量為2 mg；以不加化合物制作的溶膠—凝膠作為空白對照。

分別將制備的橡膠塞、離心管以及溶膠—凝膠柱(直徑1.5 cm，高4.5 cm)放置在室外陽臺，四面通風，每個處理之間間隔50 cm。

1.2.3 緩釋速率的測定 在放置后第0、1、2、3、4、5、6、7、10、13、16、19、22、25、28天，收集殘留的或者揮發到空氣中的揮發物；以溶劑剛好被橡膠塞完全吸收時視為第0天；離心管揮發物的收集從掛在陽臺1 d后開始；以溶膠—凝膠緩釋劑型制備完成時視為第0天。

橡膠塞緩釋劑的緩釋速率測定：采用有機溶劑浸提法。取下橡膠塞，用剪刀均勻剪成1～3 mm3的小方塊，放到5 mL容量的玻璃離心管內，取2.0 mL正己烷溶液加入離心管，密封；浸提24 h后，利用氣相色譜儀進行檢測，上樣量為1 μL，重復檢測3次，氣相色譜程序同1.2.1節。根據測定所得的3種化合物的峰面積，利用標準曲線方程（表2）計算出化合物的殘留量，并通過下列公式計算得出包埋率、殘留率、釋放速率：

包埋率(%)=第0天的殘留量/揮發物理論含量×100%

殘留率(%)=當天的殘留量/揮發物理論含量×100%

前7 d的釋放速率(%)=（前1 d的殘留量-當天的殘留量）/前1 d的殘留量×100%

7 d后的釋放速率(%)=（前3 d的殘留量-當天的殘留量）/3/前3 d的殘留量×100%

溶膠—凝膠緩釋劑的緩釋速率測定：采用有機溶劑浸提法。將溶膠—凝膠搗碎，放入5 mL容量的玻璃離心管內，取2.0 mL甲醇溶液放入離心管，密封。參照Zada等［19］的方法進行提取，將上清液在7500 r/min下離心5 min，然后利用紫外分光光度計檢測上清液的吸光率，以空白處理為對照，各重復測定3次；將測定得到的吸光率減去空白對照的吸光率后，根據標準曲線方程（表3）計算出3種化合物的殘留量，再利用上述公式計算包埋率、殘留率、釋放速率。

液體石蠟+離心管緩釋劑的緩釋速率測定：采用動態頂空吸附法。將離心管放在直徑為1.5 cm、高為4.5 cm的玻璃管中，再將玻璃管放入250 mL清潔、干燥的玻璃提取瓶中。參照謝興偉等［22］的方法進行提取，將大氣采樣儀改為真空泵（GAST Manufacturing Inc，DOA-P604-BN）。在收集時，真空泵氣流量為200 mL/min，連續吸附12 h（9:00~21:00），保持環境通風、無異味。收集完成后，用1.5 mL正己烷將吸附柱吸附的物質洗脫至2 mL棕色樣品瓶中，放入冰箱備用。將樣品濃縮至20 μL，利用氣相色譜儀進行檢測，上樣量1 μL，重復檢測3次，氣相色譜程序同1.2.1節。根據測定所得的3種化合物的峰面積，利用標準曲線方程（表2）計算其12 h的釋放量，并計算平均釋放速率。緩釋劑中揮發性化合物的釋放動力學規律符合一級動力學指數方程Ct=C0e-kt，其中Ct為緩釋劑中揮發物在時間t時的剩余量，e為自然對數，C0為緩釋劑中揮發物開始釋放時的理論初始總量，k為常數［23-24］。通過該方程可將揮發物的平均釋放速率轉換為緩釋材料中揮發物的殘留量。參照邊磊［25］的方法，將平均釋放速率轉化為Ct，相關計算公式為：

上式中：F(0, t)為時間t時揮發物的總釋放量；C0為整個釋放期間緩釋劑中揮發物的理論釋放總量；Ct為固定時間內緩釋劑中揮發物的理論殘留量；a、b為常數。

根據上述公式計算緩釋材料中揮發物的殘留量，再計算出殘留率和釋放速率。

1.3 數據處理

采用Excel 2010和IBM SPSS Statistics 21.0軟件對試驗數據進行統計分析，利用配對樣本t檢驗比較化合物在橡膠塞、溶膠—凝膠兩種緩釋材料中包埋率的差異；用Tukey法對3種化合物在不同緩釋材料中的包埋率、緩釋速率、最終殘留率進行多重比較（α=0.05）。

2 結果與分析

2.1 3種化合物在不同緩釋材料中的包埋率

從表4可以看出：d-檸檬烯、β-石竹烯在溶膠—凝膠中的包埋率極顯著高于在橡膠塞中的，而十四酸乙酯在2種緩釋材料中的包埋率差異不顯著；在橡膠塞中，十四酸乙酯的包埋率最高，d-檸檬烯的包埋率最低；在溶膠—凝膠中，d-檸檬烯的包埋率最高，十四酸乙酯的包埋率最低。

表4 3種化合物在不同緩釋材料中的包埋率 %

2.2 3種化合物在不同緩釋材料中的時間-殘留率關系

d-檸檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯在3種緩釋材料中的殘留率均隨著時間的增加而下降；除d-檸檬烯和β-石竹烯在橡膠塞中的時間-殘留率關系呈指數趨勢線外，其他3種化合物在不同緩釋材料中的時間-殘留率關系均呈線性趨勢線。除了d-檸檬烯在橡膠塞中、β-石竹烯在液體石蠟+離心管中、d-檸檬烯和β-石竹烯在溶膠—凝膠中的時間-殘留率公式的相關系數低于0.95外，其他校準公式的相關系數均大于0.95（表5）。

表5 3種化合物在不同緩釋材料中時間-殘留率的校準公式

2.3 3種化合物在不同緩釋材料中的最終殘留率

釋放28 d后，在橡膠塞中，十四酸乙酯的最終殘留率最高，d-檸檬烯和β-石竹烯的最終殘留率均低于1%；在液體石蠟+離心管中，β-石竹烯的最終殘留率最高，d-檸檬烯的最終殘留率最低；在溶膠—凝膠中，β-石竹烯的最終殘留率最高，d-檸檬烯和十四酸乙酯的殘留率較低，均小于6%（表6）。

表6 3種化合物在不同緩釋材料中的最終殘留率 %

2.4 3種化合物在不同緩釋材料中的釋放速率

2.4.1 d-檸檬烯在不同緩釋材料中的釋放速率 由表7可知：第1天，橡膠塞和液體石蠟+離心管中d-檸檬烯的釋放速率出現最大值，分別達189.32、249.35 μg/d；第2天，溶膠—凝膠中d-檸檬烯的釋放速率最大，達318.29 μg/d；在橡膠塞中，d-檸檬烯前5 d的釋放較快，釋放量逐漸降低，直到第19天時釋放速率為（0.00±0.02） μg/d，此時可以認為d-檸檬烯基本上不再釋放；在液體石蠟+離心管中，d-檸檬烯的釋放速率由大變小，第28天的釋放速率仍有31.66 μg/d；在溶膠—凝膠中，d-檸檬烯前5 d的釋放速率較大，之后釋放緩慢，第28天的釋放速率最小。

表7 3種緩釋材料中d-檸檬烯的釋放速率 μg/d

2.4.2β-石竹烯在不同緩釋材料中的釋放速率 如表8所示：第1天，溶膠—凝膠和橡膠塞中β-石竹烯的釋放速率較大，顯著高于在液體石蠟+離心管中的釋放速率（6.90 μg/d）；在橡膠塞中，β-石竹烯在前2 d快速釋放，此后逐漸緩慢釋放，第22天出現最小的釋放速率（0.55 μg/d）；在液體石蠟+離心管中，β-石竹烯在28 d內的釋放速率均較低，釋放速率在1.56~7.05 μg/d之間波動；在溶膠—凝膠中，隨著時間的延長β-石竹烯的釋放速率逐漸變小。

表8 3種緩釋材料中β-石竹烯的釋放速率 μg/d

2.4.3 十四酸乙酯在不同緩釋材料中的釋放速率 從表9可以看出：第1天，溶膠—凝膠中十四酸乙酯的釋放速率最大（197.04 μg/d），顯著高于在橡膠塞和液體石蠟+離心管中的；在橡膠塞中，十四酸乙酯隨時間的延長而穩定釋放，釋放速率在14.81~82.72 μg/d之間波動；在液體石蠟+離心管中，十四酸乙酯在28 d內的釋放速率均較低，釋放速率在2.54~7.94 μg/d之間波動；在溶膠—凝膠中，十四酸乙酯的釋放速率總體呈現從快到慢的趨勢，在第2天的釋放速率最大（262.22 μg/d），第13天的釋放速率最小，僅8.40 μg/d。

表9 3種緩釋材料中十四酸乙酯的釋放速率 μg/d

3 討論

筆者首次制備了d-檸檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯這3種植物揮發物的凝膠—溶膠緩釋劑，并與橡膠塞、液體石蠟+離心管緩釋劑進行了比較，結果表明：3種植物揮發物在液體石蠟+離心管和溶膠—凝膠中的持效期均大于或等于28 d，在橡膠塞中的持效期分別為d-檸檬烯19 d、β-石竹烯25 d、十四酸乙酯大于28 d。其中，包埋率高、釋放速率穩定、持效期長的劑型有：橡膠塞中的十四酸乙酯，液體石蠟+離心管內3種化合物，溶膠—凝膠中的β-石竹烯。但是，液體石蠟+離心管中的十四酸乙酯和β-石竹烯的釋放速率較低。

d-檸檬烯在橡膠塞中持效期最短，主要原因是包埋率太低（僅14.56%）和揮發太快。將d-檸檬烯溶液注入到橡膠塞凹槽后，由于其揮發性強，可被橡膠塞吸收的較少。有研究表明，在沒有緩釋載體的情況下，d-檸檬烯的釋放速率高達260 μg/min［12］。在本研究中，被橡膠塞吸收的d-檸檬烯在前5 d便釋放了94%，因此橡膠塞不適合作為d-檸檬烯的緩釋材料。在液體石蠟+離心管和溶膠—凝膠中，d-檸檬烯的包埋率較高，持效期較長，釋放也較穩定，這2種材料均適合作為d-檸檬烯的緩釋材料。但是，與溶膠—凝膠相比，d-檸檬烯在液體石蠟+離心管中的最終殘留率更高，釋放速率也更穩定。因此，我們認為d-檸檬烯的最適緩釋材料為液體石蠟+離心管。

β-石竹烯和d-檸檬烯均為萜烯類化合物，同樣出現了在橡膠塞中包埋率較低（僅44.60%）和揮發性較強的情況，因此橡膠塞不合適作為β-石竹烯的緩釋材料。β-石竹烯在液體石蠟+離心管中的釋放速率太低，可能是由于受濕度影響過大。總之，液體石蠟+離心管也不適合作為β-石竹烯的緩釋材料。本研究中的溶膠—凝膠材料由低于10%的硅氧化物和高于90%的空氣構成，這種特殊的多空材質可以包埋更多的β-石竹烯，使其能保持更長的時間，且被包埋的β-石竹烯隨著溶膠—凝膠材料的降解可以緩慢而穩定地釋放，因此β-石竹烯的最適緩釋材料為溶膠—凝膠；另外，溶膠—凝膠的降解產物主要是水和二氧化硅，對環境友好和安全。

本研究結果表明，十四酸乙酯在橡膠塞中的包埋率較高（68.31%），并且釋放速率較穩定。這可能是因為十四酸乙酯的分子量和功能團與一些蛾類昆蟲性信息素組分十四醇乙酸酯的相同，橡膠塞一直是蛾類昆蟲性信息素的最適緩釋材料。因此，橡膠塞適合作為十四酸乙酯的緩釋材料。十四酸乙酯在溶膠—凝膠中的包埋率雖然高（77.83%），但釋放速率較橡膠塞而言更不穩定。因此，我們認為溶膠—凝膠不適合作為十四酸乙酯的緩釋材料。

植物揮發物在緩釋材料中的持效期和釋放速率除受揮發物本身性質和緩釋材料特性的影響外，還會受到溫度、濕度、光照、風速等諸多外界因素的影響［26］。本研究將緩釋劑放置在室外，處于變溫條件下，白天（6：00~18：00）的氣溫為21.5~39.4 ℃，晚上（18：00~次日6：00）的氣溫為17.0~23.2 ℃，實驗過程也受到了日照、降雨、刮風等因素的影響，這些因素對研究結果也有一定的影響。本研究初步篩選出了適合d-檸檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯田間應用的緩釋材料，但其在田間的應用效果還需要通過田間害蟲誘捕試驗進行驗證。

4 結論

用于植物揮發物的良好緩釋材料必須具有包埋率高、持效期長、釋放緩慢而穩定的特點。本研究結果表明：十四酸乙酯的最適緩釋材料是橡膠塞，d-檸檬烯的最適緩釋材料是液體石蠟+離心管，β-石竹烯的最適緩釋材料是溶膠—凝膠。