無創(chuàng)DNA檢測對高齡孕婦胎兒染色體非整倍體疾病及染色體拷貝數(shù)變異篩查中的臨床價值

王 玲,王 珺,高玲霞,王曉紅

(空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院 婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學中心,陜西 西安710038)

我國新生兒出生缺陷的發(fā)生率為6%,相當一部分出生缺陷是染色體變異導(dǎo)致,主要包括染色體非整倍體異常和CNV[1-2],染色體非整倍體異常研究較多,而CNV作為引起出生缺陷的主要遺傳因素,近年來越來越受到人們的重視。

2001年我國母嬰保健法實施辦法及2002 年產(chǎn)前診斷技術(shù)管理辦法明確規(guī)定對高齡孕婦需進行產(chǎn)前診斷[3]。羊水穿刺作為常用的產(chǎn)前診斷項目,準確性高,但存在孕婦術(shù)后流產(chǎn)、羊水滲漏、宮內(nèi)感染等并發(fā)癥的風險。在臨床工作中,因單純高齡行侵入性產(chǎn)前診斷的孕婦較少[4],很多孕婦愿意選擇無創(chuàng)PNA產(chǎn)前檢測(NIPT)。而高齡孕婦作為NIPT的慎用人群,其準確性到底如何?本研究對高齡孕婦進行NIPT篩查,篩查高風險的孕婦通過羊水穿刺進一步診斷,通過對比檢測結(jié)果和隨訪妊娠結(jié)局,探究高齡孕婦DNA無創(chuàng)產(chǎn)前篩查對染色體非整倍體疾病及CNV的預(yù)測價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料納入2015年7月至2022年6月來唐都醫(yī)院生殖醫(yī)學中心就診的、在充分知情同意下自愿參加NIPT的孕12-22+6 周單胎孕婦,所有參加NIPT的孕婦均為非染色體異常患者、1年內(nèi)未接受過異體輸血、移植手術(shù)、免疫治療、非惡性腫瘤患者且胎兒超聲檢查正常。剔除唐篩高風險以及超聲軟指標異常孕婦后的12677例孕婦,按照孕婦預(yù)產(chǎn)期年齡分組,年齡≥35 歲為高齡組,年齡<35 歲為低齡組。本研究符合赫爾辛基宣言。

1.2 方法

1.2.1NIPT檢測 抽取孕婦靜脈血10 ml,分離血漿后,采用磁珠法提取血漿中胎兒游離DNA,采用 Illumina NextSeq CN500高通量測序儀對胎兒DNA片段進行測定,結(jié)合生物信息學分析,計算出胎兒患染色體非整倍體疾病以及CNV的風險。其中Z在(-3.0～3.0)內(nèi)為低風險,否則即為高風險。

1.2.2介入性產(chǎn)前診斷 對NIPT 檢測高風險的孕婦給予遺傳咨詢,并建議其進行羊水穿刺,取羊水30 ml,通過羊水細胞染色體核型分析和IonProton高通量測序(NGS)全基因組拷貝數(shù)變異分析進行驗證。

1.2.2.1染色體核型分析 在37℃條件下5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中進行羊水細胞培養(yǎng),依據(jù)人類細胞遺傳學國際命名體制(IscN2009)標準進行G顯帶染色體核型分析。

1.2.2.2羊水細胞染色體高通量測序 將羊水離心,棄上清,按照核酸提取試劑盒說明書提取羊水細胞全基因組DNA,IonProton二代測序技術(shù)行染色體拷貝數(shù)變異分析。

1.3 觀察指標記錄所有胎兒的 NIPT 檢測結(jié)果、妊娠結(jié)局以及 NIPT高風險胎兒的介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果,對比NIPT結(jié)果和產(chǎn)前診斷結(jié)果,分析NIPT對不同染色體異常類型的PPV、靈敏度和特異度。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。組間率的比較采用χ2檢驗或fisher確切檢驗,顯著性水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NIPT檢測結(jié)果分析

12675例孕婦中,高齡孕婦2093例,低齡10582例。共有染色體高風險孕婦177例(1.40%),其中21三體高風險40例,18三體高風險孕婦13例,13三體高風險7例,性染色體非整倍體高風險91例,CNV高風險孕婦26例。隨訪結(jié)果顯示,NIPT對21三體、18三體、13三體、性染色體非整倍體異常以及CNV的篩查中未發(fā)現(xiàn)假陰性病例,即陰性預(yù)測值為100%,漏診率為0。

2.2 不同年齡孕婦NIPT對21三體、18三體、13三體的準確性分析

NIPT結(jié)果提示21三體高風險孕婦中,低齡組31例,19例孕婦同意進行介入性產(chǎn)前診斷,確診11例,PPV為57.89%;高齡組9例,6例孕婦同意進行產(chǎn)前診斷,確診5例,PPV為83.33%,見表1。通過統(tǒng)計學分析,兩組間PPV無差異(P=1.000)。NIPT結(jié)果提示18三體高風險孕婦中,低齡組8例,5例同意進行介入性產(chǎn)前診斷,確診2例,PPV為40%;高齡組5例,4例孕婦同意進行介入性產(chǎn)前診斷,確診2例,PPV為50%。與低齡組相比,高齡組歲孕婦的PPV差異之間無統(tǒng)計學意義(P=1.000)。NIPT結(jié)果提示13三體高風險孕婦中,低齡組4例,2例孕婦同意進行介入性產(chǎn)前診斷,確診1例,PPV為50%;高齡組3例,2例孕婦同意進行介入性產(chǎn)前診斷,確診0例,陽PPV為0。通過統(tǒng)計學分析,兩組間PPV無差異(P=1.000)。

表1 不同年齡孕婦NIPT常染色體非整倍體異常的陽性預(yù)測值比較

2.3 不同年齡孕婦NIPT性染色體非整倍體異常的準確性分析

NIPT結(jié)果提示性染色體非整倍體高風險孕婦中,低齡組82例,49例孕婦同意進行介入性產(chǎn)前診斷,確診14例,PPV為28.57%,靈敏度為100.00%,特異度為99.70%;高齡組9例,8例孕婦同意進行介入性產(chǎn)前診斷,確診3例,PPV為37.5%,靈敏度為100.00%,特異度為99.76%,見表2。兩組間PPV差異無統(tǒng)計學意義(P=0.609)。

表2 性染色體高風險孕婦NIPT結(jié)果與介入性產(chǎn)前診斷比較

2.4 染色體拷貝數(shù)變異在NIPT檢測結(jié)果與介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果比較

NIPT結(jié)果提示CNV高風險孕婦中,低齡組21例,17例孕婦同意進行介入性產(chǎn)前診斷,確診7例,PPV為41.18%,靈敏度為100.00%,特異度為99.91%;高齡組4例,4例都進行產(chǎn)前診斷,確診1例,PPV為25%,靈敏度為100.00%,特異度為99.86%,見表3。與低齡組相比,高齡組孕婦的PPV差異之間無統(tǒng)計學意義(P=0.364)。

表3 CNV高風險孕婦NIPT結(jié)果與介入性產(chǎn)前診斷比較

3 討論

近年來,隨著我國社會經(jīng)濟發(fā)展,晚婚晚育人口增多以及生育政策的放開,高齡產(chǎn)婦逐漸增多,導(dǎo)致胎兒染色體異常的發(fā)生率增加[5],并且高齡孕婦發(fā)生不良妊娠結(jié)局的概率也明顯高于35歲以下孕婦[6]。迄今為止,針對染色體疾病還沒有有效的治療手段。通過產(chǎn)前檢測、診斷以及遺傳咨詢是降低生育染色體疾病患兒風險的最好方法。目前,傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷是檢測胎兒染色體異常和畸形的金標準,但該技術(shù)存在一定的風險,給孕婦本人和家屬帶來一定的心理壓力。而NIPT從1997年香港中文大學盧煜明教授發(fā)現(xiàn)孕婦外周血中存在游離的胎兒DNA[7],并發(fā)展出了一套準確分析母親血漿內(nèi)的胎兒DNA、利用二代測序技術(shù)檢測唐氏綜合征以來,隨著處理方法的優(yōu)化,生物信息學分析流程的完善,該技術(shù)越來越成熟,對于胎兒性染色體異常以及染色體微重復(fù)微缺失等其他染色體疾病的檢測能力和準確性也有所提升[8],被越來越多的人接受。

然而高齡作為NIPT的慎用人群,高齡孕婦與年齡<35歲孕婦之間的各染色體異常的陽性預(yù)測值是否有差異,以及高齡孕婦進行NIPT篩查的可行性。本研究表明NIPT 對21三體、18三體、13三體綜合征、性染色體非整倍體異常以及CNV的篩查效能在高齡組與低齡組之間無統(tǒng)計學差異。說明NIPT對高齡孕婦的檢測效能與年齡<35歲孕婦相當。但是NIPT檢測作為一項篩查技術(shù),有其局限性,篩查低風險不等于無風險,孕婦仍需按時進行產(chǎn)前檢查(比如胎兒排畸超聲等)[9];當結(jié)果提示高風險時,一定要告知患者該檢測存在誤診以及假陽性的可能,建議患者通過羊穿等技術(shù)進行產(chǎn)前診斷。

本研究結(jié)果表明NIPT對各染色體異常的陽性預(yù)測值是不同的,對21三體的陽性預(yù)測值較高,對18-三體、13-三體、性染色體數(shù)目異常以及CNV 的檢測陽性預(yù)測值較低。21-三體、18-三體和13-三體的陽性預(yù)測值比國內(nèi)外報道[10]較低,可能與高風險樣本量少有關(guān)。隨訪結(jié)果表明,無創(chuàng)DNA檢測的漏診率很低。因此,對于高齡孕婦可應(yīng)用無創(chuàng)DNA進行染色體非整倍體異常以及CNV篩查,篩查低風險的孕婦隨訪至妊娠結(jié)束,避免漏診,篩查高風險的孕婦通過羊穿進一步確診,這種思路是可行的。