宮頸高危型HPV感染者外周血T細胞亞群及其免疫因子變化分析

余曉鳳,曹德琦,徐曉明,姜巖松,王晶華

(承德市中心醫院 檢驗科,河北 承德067000)

宮頸癌(cervical cancer,CC)發病率居女性生殖系統惡性腫瘤第一位,近年來有發病率及死亡率升高和發病人群年輕化的特征,對女性的生命健康造成嚴重威脅[1-2]。宮頸高危型HPV感染與宮頸癌前病變及宮頸癌密切相關,研究發現在約99%的宮頸癌中能夠檢測到高危型HPV感染[3-4]。大約有80%的宮頸癌是由HPV16型和HPV18型感染所致[5]。其中絕大部分表現為一過性感染,大多數病損能夠自行消退。有相關數據顯示[6],在兩年內有約90%的HPV感染能夠進行自我清除,能發展為惡性腫瘤的HPV感染不足1%[7]。由此說明宿主自身免疫調節在抗HPV感染中發揮關鍵作用。干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)和白介素-4(Interleukin-4,IL-4)分別是Th1、Th2 細胞分泌的具有代表性的細胞因子,在機體的正常生理狀態下,Thl、Th2 處于動態平衡狀態,而HPV持續感染引起的特定細胞所介導的免疫反應會破壞這種平衡,導致宮頸上皮內病變甚至腫瘤的發生[8]。Th17 細胞是獨立的 CD4+T 細胞亞群,可合成并分泌促進炎癥反應發生的細胞因子 IL-17;Treg 細胞是調節性 T 細胞,具有強大的免疫抑制功能[9],其分泌的轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1) 主要參與細胞分化、增殖等多種病理生理過程,在腫瘤發展中具有雙重作用[10]。研究發現[11],Th17/Treg 細胞比例失衡在炎癥反應、自身免疫性疾病以及惡性腫瘤的發生中起重要介導作用。本研究旨在探討 Th1/Th2、Th17/Treg 細胞分泌相關細胞因子與宮頸高危型HPV 感染的關系,旨在進一步揭示宮頸病變與SCC 發病機制,從而為臨床高危型HPV感染的免疫干預及預后提供客觀依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對象 選取2020年5月至2021年12月于承德市中心醫院婦科門診及病房行宮頸癌篩查的患者,高危型 HPV-DNA 檢測陽性且分別行 TCT檢查及陰道鏡下病理活檢者共148例為病例組,其中CINⅠ 41例,CINⅡ38例,CINⅢ38例,宮頸鱗癌(SCC)31例;同時選取高危型HPV-DNA陰性健康者40例為對照組(Control Group,CG)。納入標準：年齡：21-65歲;高危型 HPV 感染：16型,18型,其他12種高風險亞型：31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66和68型。排除標準：妊娠或哺乳期的女性患者;近1年內使用過免疫抑制劑或增強劑治療,且伴有免疫性疾病者;經血清學或PCR法證實伴有其他病毒感染性疾病者;有重要臟器的器質性病變者;精神疾病患者;近半年內有重大手術、創傷等應急刺激者;近2月接受全身抗病毒治療者;患有除宮頸癌以外的其他惡性腫瘤者;處于生殖道急性感染期者;雙重或多重高危型 HPV感染者。

1.1.2主要試劑和儀器 由貝克曼庫爾特有限公司提供的四色淋巴細胞亞群劑：CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5(PN．6607013)CD45-FITC/CD16CD56-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5(PN．6607073);溶血素(OptilyseC,PN.A11895);流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司,FC500);酶標儀(型號：Multiskan FC)。

1.2 方法

1.2.1病例組分組 嚴格按照納入及排除標準將高危型 HPV-DNA 檢測陽性,有宮頸病變且根據宮頸多點活檢及P16/Ki67雙染結果判定病變級別分為CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組及SCC組。

1.2.2HPV 核酸分型檢測 (1)標本采集：使用專用宮頸刷在宮頸鱗-柱狀上皮交界處輕輕刷取數圈,獲得宮頸脫落細胞,放入保存液中及時送檢。(2)檢測方法：使用羅氏cobas 4800 全自動核酸提取及實時熒光定量PCR分析系統對標本行 HPV核酸檢測及分型。

1.2.3淋巴細胞亞群檢測 (1)標本采集：對符合標準的患者,在獲取其知情同意的情況下采集空腹靜脈血2 ml,EDTA 抗凝。(2)實驗操作：取流式管2只,將每個病人的樣本管分別標記為A管和B管,用加樣槍分別吸取10 μl四色淋巴細胞亞群試劑于A管 (CD45+/CD3+/CD4+/CD8+)和B管(CD45+/CD3-/CD16+CD56+/CD19+)中,再分別向A、B 兩管中加入100 μl新鮮EDTA抗凝靜脈血,渦旋混勻,室溫避光放置15 min,然后分別向兩管中加入 溶血素500 μl,渦旋混勻,室溫避光放置10 min,然后每管加500 μl PBS,室溫平衡5 min,充分渦旋混勻,2 h內上機檢測(計數10000 個細胞)。(3)結果判定：流式細胞儀計數每10000個細胞中標記細胞所占的百分比。

1.2.4細胞因子檢測 清晨空腹狀態下抽取受試者外周靜脈血3 ml至無菌試管,于室溫下自然凝固,3 500 r/min離心10 min,取血清貯存于-80℃冰箱以備用。采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測所有受試者血清IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β1的含量,試劑采用武漢純度生物,繪制標準曲線圖(以濃度標識為橫坐標,吸光度標識為縱坐標),計算相應濃度。

2 結果

2.1 各組間年齡比較各組間年齡比較差異無統計學意義,見表1。

表1 各組間年齡比較

2.2 HPV16/18型別及其他12種型別在各病例組間所占的比例從CINⅠ 到SCC,隨著宮頸病理分期進展,HPV16型及HPV18型所占比例逐漸升高,其他型別所占比例相對降低,差異有統計學意義(χ2=20.633,P<0.05),見表2。

表2 HPV16/18及其他12種高危型陽性率在各病例間比較(%)

2.3 外周血CD4+T細胞比例、CD8+T細胞比例及CD4+/CD8+比值在各組間比較情況與對照組相比,隨著宮頸病變進展,CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及SCC組外周血CD4+T細胞比例含量逐漸減低,CD8+T細胞比例逐漸升高,CD4+/CD8+比值逐漸減低,差異有統計學意義(P<0.05),見表3。

表3 CD4+T、CD8+T及CD4/CD8在各組間比較情況

2.4 血清IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β1在各組間比較與對照組相比,各組血清IFN-γ含量逐漸減低,IL-4、IL-17及TGF-β1含量逐漸升高,差異有統計學意義(P<0.05),見表4。

表4 各組血清IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β1比較

2.5 不同型別高危型HPV感染者血清IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β1水平比較高危型HPV16/18與其他型別感染組比較,血清IFN-γ含量減低,IL-4、IL-17及TGF-β1含量升高,差異有統計學意義(P<0.05),見表5。

表5 不同型別高危型HPV感染者血清IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β1水平比較

3 討論

高危型HPV感染是宮頸癌前病變及宮頸癌發生、發展的主要危險因素之一[12],大部分女性在其一生中都不止一次感染過HPV,其中絕大部分表現為一過性感染,大多數病損能夠自行消退。有相關數據顯示[13],兩年內有約90%的HPV感染能夠進行自我清除,能發展為惡性腫瘤的HPV感染不足1%。近年來研究表明機體的免疫系統尤其是CD4+T細胞介導的細胞免疫在抗HPV感染中發揮了重要作用,而Th1/Th2、Th17/Treg為Th細胞主要類型,成為高危型HPV感染導致宮頸病變及宮頸癌的免疫機制研究熱點之一。

本研究中隨著宮頸病變進展,高危型HPV感染者CD4+T淋巴細胞逐漸減低,而CD8+T淋巴細胞逐漸上升,這提示患者體內存在T淋巴細胞亞群偏移現象,且CD4+/CD8+逐漸降低,SCC組CD4+/CD8+比值<1,提示患者可能處于免疫抑制狀態,這將會使宿主不能將腫瘤細胞有效地清除,從而有利于腫瘤細胞在機體內增殖而導致癌癥擴散。

Th1/Th2、Th17/Treg型細胞因子通過表達相關轉錄因子來參與細胞免疫。Th1 細胞通過表達轉錄因子T-bet、STAT-4 分泌IFN-γ、TNF-β、IL-2 等細胞因子來參與細胞免疫[14]。其中IFN-γ主要是Th1細胞產生的一種重要要的免疫調節因子,在激活細胞免疫、刺激抗腫瘤免疫反應中起關鍵作用[15]。Th2 細胞通過表達轉錄因子GATA-3 和STAT-6 分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-13 等細胞因子參與細胞免疫[16]。其中IL-4被稱為“典型的免疫調節細胞因子”,在抗腫瘤免疫、調節抗體產生以及效應性T細胞反應的發展中起著重要作用[17]。本研究結果顯示：從CINⅠ 到SCC,隨著宮頸病理分期的進展,血清IFN-γ含量逐漸降低,而IL-4含量逐漸升高,說明高危型HPV感染可以促進Th2 細胞因子表達,并降低Th1 細胞因子表達,破壞Th1/Th2之間平衡,從而導致機體免疫力下降和宮頸病變程度加重,與Deligeoroglou[18]研究結果一致。

Th17 細胞是介導炎癥反應的主要炎癥細胞,IL-17 是其分泌的重要炎癥介質。研究表明[19],IL- 17 在感染性疾病、自身免疫性疾病發生發展過程中發揮重要作用;研究表明Th17細胞分泌的白細胞介素17(IL-17)與腫瘤生長和病毒感染的持續性有關,高危型HPV感染主要刺激系統性IL-17的產生,同時減少局部表達[20]。Treg 細胞具有免疫抑制性,是抑制反應性 T 細胞免疫反應的細胞,Treg 細胞參與了CC、乳腺癌等惡性腫瘤的發生發展過程,可作為惡性腫瘤病情進展的評估指標[21-22]。TGF -β1 是由 Treg 細胞分泌產生的細胞因子,作為多功能細胞因子參與細胞的增殖、分化、免疫功能等細胞調節,其主要通過免疫細胞介導下調機體免疫應答反應。高危型HPV癌基因E7通過TGF-β/Smad途徑上調宮頸癌中miR-182的表達[23]。有研究顯示 TGF-β1 表達的改變是 HPV 相關宮頸癌形成的重要機制,同時在多種癌癥疾病中均有高表達[24]。Chatterjee S等研究表明TGF-β1通過轉錄因子STAT1調節途徑增加高危型HPV感染致宮頸癌進展的敏感性[25]。本研究結果表明：隨著宮頸病理分期進展,IL-17、TGF -β1含量逐漸升高,尤其SCC組TGF -β1含量顯著高于正常,可見高危型HPV感染伴宮頸病變及SCC會導致Th17/Treg 細胞相關炎癥細胞因子之間動態平衡破壞,導致高危型HPV在機體出現免疫逃逸。本研究HPV16/18型在SCC中的比例為61.29%,隨著宮頸病變程度的加重,HPV16/18型別所占比例越來越高,其他型別所占比例相對減低,且與其他型別高危型HPV感染相比,HPV16/18感染者血清IFN-γ含量減低,而IL-4、IL-17、TGF-β1含量增高,這可能與HPV16/18型致癌蛋白的致癌能力的強弱有關,HPV16/18感染是導致宮頸癌的主要原因。

總之,Th1/Th2、Th17/Treg 免疫因子在CIN及宮頸癌發生、發展的多個環節中發揮著重要的調節作用,通過本研究以期為宮頸高危型HPV感染伴宮頸病變及宮頸癌的免疫治療提供一個新的思路。