長春市2016—2020監測年度甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因特征分析

崔 薇,初 秋,李晨光,龔云偉,趙春艷,孫 宇,隋天卓,孫炳欣*

(1.長春市疾病預防控制中心,吉林 長春130033;2.吉林大學基礎醫學院,吉林 長春130021)

流感病毒是有包膜的負鏈RNA病毒,其中甲型流感整個基因組分成8個節段,分別編碼PB2,PB1,PA,HA,NP,NA,M,NS等蛋白,每種蛋白在流感病毒感染、增殖、釋放、擴散及傳播過程中都行使不同的功能。其中血凝素(HA),它在流感病毒受體識別和入侵過程中起著重要的作用,同時能誘導機體產生中和抗體[1]。HA還是流感病毒容易發生變異的抗原,進而導致流感逃避宿主的免疫的識別與清除,從而引起流感的反復流行,因此對流感病毒抗原進化和疫苗選擇的研究也主要集中在HA重要的氨基酸位點上。

為了解長春市甲型H1N1血凝素(HA)基因特征,我們對2016-2020年度甲型H1N1血凝素(HA)變異情況及進化特征進行了分析,為長春市甲型H1N1流感防控及預測提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

按照《全國流感監測方案(2017版)》要求,長春市3家流感監測哨點醫院對發熱3天內流感樣病例(體溫≥38℃,伴咳嗽或咽痛之一)進行標本采集。長春市CDC流感網絡實驗室對這些流感樣病例標本進行核酸檢測,并對其中流感病毒陽性標本進行病毒分離,獲得流感病毒毒株。本次研究選取長春市2016-2020年期間共4個監測年度的流感毒株109株,所有毒株均由長春CDC流感網絡實驗室分離鑒定。

1.2 甲型H1N1流感病毒毒株核酸提取和HA基因擴增

用碩世病毒核酸快速提取試劑盒提取流感病毒毒株RNA,將提取到的病毒RNA先反轉錄成cDNA,再用設計的引物進行血凝素(HA)基因擴增,對PCR產物用毛細管電泳方法進行確認。

1.3 甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因序列測定及分析

血凝素(HA)基因PCR產物送至上海生工生物工程公司進行基因測序和拼接。拼接后的序列經NCBI中的GenBank數據庫Blast比對確認為甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因序列。選取WHO推薦2010-2017年疫苗株A/California/07/2009、2017-2019年北半球疫苗株A/Michigan/45/2015、2019-2020年北半球疫苗株A/Brisbane/02/2018、2020-2021年北半球疫苗株A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019(H1N1)、國內代表株A/Shanghai-Jiading/SWL1970/2015,國內分離的第1株甲型H1N1流感毒株A/Sichuan/1/2009(H1N1)作為參考序列,參考序列均來自GISAID網站。使用MegAlign軟件進行HA基因核苷酸和氨基酸序列同源性分析,使用Mega7.0軟件進行重要位點氨基酸突變分析。

2 結果

2.1 流感病毒流行情況及分析

2016年4月至2020年3月,長春地區共檢測流感樣病例樣本7930份,其中流感病毒核酸陽性樣本1061份,陽性率為13.38%。陽性樣本中甲型H1N1流感病毒陽性樣本475份,季節性H3N2流感病毒陽性樣本356份,乙型流感病毒陽性樣本230份。

從病原上分析,長春地區流感病毒在不同年份出現不同的優勢株：2016年4月以甲型H1N1和B型流感病毒共同流行,隨后的5-7月份甲型H1N1淡出,僅有B型流感病毒檢出;2016年8月至9月期間未有流感病毒陽性檢出;2016年10月至11月,僅零星有季節性H3N2流感病毒檢出。2016年12月至2017年3月期間,呈現季節性H3N2和甲型H1N1流感病毒共同流行的局面,并且甲型H1N1流感病毒逐漸成為主導的流行亞型;到2017年4月至6月期間,甲型H1N1流感成為唯一的流行株;而在2017年7月至11月期間,主要以季節性H3N2流行為主,偶爾會檢出甲型H1N1流感病毒。到了2017年12月至2月期間,又出現B型、季節性H3N2和甲型H1N1共同流行的局面,2018年3月到5月季節性H3N2流感病毒零檢出,出現甲型H1N1和B型流感病毒共同流行的局面;2018年6月至11月未有流感病毒陽性檢出。2018年12月至2019年1月主要以甲型H1N1流感流行為主,偶爾會檢出B型流感病毒。到2019年2月至4月期間,又出現B型、季節性H3N2和甲型H1N1共同流行的局面,并且B型流感病毒逐漸成為主導的流感亞型,至2019年5月,僅有B型流感病毒陽性檢出;2019年6月至9月未有流感病毒陽性檢出;2019年10月至12月,主要以季節性H3N2為流行優勢株,偶爾有甲型H1N1檢出。而至2020年1月至3月,則為季節性H3N2和甲型H1N1共同流行,偶爾有B型流感病毒檢出,見圖1。

圖1 2016—2020監測年度長春市流感病毒各亞型流行情況

在此期間,每年都有甲型H1N1流感病毒檢出,特別是2017年1月至2017年6月,2018年12月至2019年2月,2020年1月至2020年2月這三個時間范圍,甲型H1N1流感陽性樣本分別占同時間范圍陽性總數的70.27%(156/222),96.80%(212/219)和47.57%(49/103),甲型H1N1流感為流感流行的優勢株。

2.2 HA基因進化分析

甲型H1N1流感病毒HA基因系統進化分析顯示,長春地區2016—2020年4個監測年度甲型H1N1流行株的HA基因,均屬于6B.1大分支,與疫苗株A/California/7/2009相比,其HA蛋白存在S84N、S162N和I216T共同的變異位點。甲型H1N1流感病毒毒株HA基因之間核苷酸同源性在96.9%～100%之間,氨基酸同源性在97.2%～100%之間。

其中2016—2017 年甲型H1N1流行株,與疫苗株A/California/7/2009相比,HA蛋白有P83S、S84N、D97N、S162N、K163Q、S185T、S203T、I216T、A256T、K283E、E374K、S451N、E499K共同的位點突變,與同一時期推薦的疫苗株A/California/7/2009 核苷酸同源性在97.0%～97.4%之間,氨基酸同源性在96.8% ～97.5%之間。

2017—2018 年甲型H1N1流行株繼續進化,HA基因屬于6B.1A分支,HA蛋白新增 S74R、S164T、I295V 變異,與同一時期推薦的疫苗株A/Michigan/45/2015 核苷酸同源性在98.1%～98.5%之間,氨基酸同源性在98.1%～98.9%之間。其中一部分流行株HA蛋白還出現S183P、T256I氨基酸位點突變,屬于6B.1A1分支。另一部分流行株未出現S183P氨基酸位點突變,但出現A256T氨基酸位點突變。

2018—2019年甲型H1N1流感病毒繼續進化,一部分流行株HA蛋白出現N260D位點突變,屬于6B.1A5分支;另一部分流行株 HA蛋白未出現N260D位點突變,又分別分化為6B.1A2分支、6B.1A4分支、6A.1A6分支和6A.1A7分支。分別有L233I氨基酸位點突變(6B.1A2分支),A141E共同氨基酸位點突變(6B.1A4分支),T120A共同氨基酸位點突變(6A.1A6分支)和K302T、I404M、N496S、E506D共同氨基酸位點突變(6A.1A7分支),與同期疫苗株A/Michigan/45/2015的核苷酸同源性在97.5%～98.3%之間,氨基酸同源性為97.7%～98.9%。

2019—2020年甲型H1N1流行株是由上一年度6B.1A5分支的流行株進化而來,其HA 蛋白新出現D187A、Q189E位點突變,進化為6B.1A5A1分支,與同期推薦的疫苗株A/Brisbane/02/2018 的核苷酸同源性在98.4%～98.8%之間,氨基酸同源性為97.9%～98.5%。與2020—2021年推薦的疫苗株 A/Guangdong-Maonan/SWL1536/ 2019的核苷酸同源性在99.5%～99.9%之間,氨基酸同源性為99.4%～100%,見圖2。

圖2 2016-2020年度長春市甲型H1N1流感病毒HA基因系統進化樹

2.3 HA蛋白分子特征分析

2.3.1HA抗原決定簇位點分析 2016—2017監測年度的甲型H1N1流感病毒毒株與同期推薦的疫苗株A/California/07/2009相比,在HA蛋白抗原決定簇上都發生S162N和K163Q位點的共同突變,均位于HA蛋白抗原決定簇的Sa區;S185T的共同突變,位于HA蛋白抗原決定簇的Sb區;S203T位于HA蛋白抗原決定簇Ca區。除此之外,HA蛋白抗原決定簇還存在一些散在的突變位點,本研究中1株毒株出現S71F氨基酸位點突變,1株毒株出現S74R氨基酸位點突變,均位于HA蛋白抗原決定簇Cb區;1株毒株出現K160T氨基酸位點突變,位于HA蛋白抗原決定簇Sa區;1株毒株還出現K169R、S190R氨基酸位點突變,分別位于HA蛋白抗原決定簇Ca區和Sb區。

2017—2019監測年度的甲型H1N1流感病毒毒株與同期推薦的疫苗株A/Michigan/45/2015相比,在HA蛋白抗原決定簇上都發生S74R和S164T的共同突變,分別位于HA蛋白抗原決定簇的Cb區和Sa區。除此之外,與同期推薦的疫苗株A/Michigan/45/2015相比,HA蛋白抗原決定簇還存在一些散在的突變位點。本研究中的1株毒株出現A73S氨基酸位點突變,位于HA蛋白抗原決定簇Cb區;3株毒株出現H138Y氨基酸位點突變,1株毒株出現G140R氨基酸位點突變,2株毒株出現A141E氨基酸位點突變,1株毒株出現A141T氨基酸位點突變,均位于HA蛋白抗原決定簇Ca區;5株毒株出現L161I氨基酸位點突變,位于HA蛋白抗原決定簇Sa區;5株毒株還出現T185I氨基酸位點突變,2株毒株還出現S190I氨基酸位點突變,均位于HA蛋白抗原決定簇Sb區;1株毒株出現I166F和S190I氨基酸位點突變,分別位于HA蛋白抗原決定簇Ca區和Sb區;1株毒株還出現T185I和E235D氨基酸位點突變,分別位于HA蛋白抗原決定簇Sb區和Ca區。

2019—2020監測年度的甲型H1N1流感病毒毒株與同期推薦的疫苗株A/Brisbane/02/2018 相比,在HA蛋白抗原決定簇上都發生T185I、D187A和Q189E的共同突變,均位于HA蛋白抗原決定簇的Sb區。

2.3.2受體結合位點分析 甲型H1N1流感病毒位于HA蛋白頭部的受體結合位點由190螺旋(187～195：187-DQQSLYQNA-195位)、220環(218～225：218-PKVRDQEG-225位)和130環(132～135：132-VTAA-135位) 3個結構域以及口袋底部的Y91、W150、H180和Y192構成。通過軟件與A/California/07/2009對比,發現2019年12月以后分離到的毒株HA基因所編碼的氨基酸出現D187A、Q189E位點共同突變,均位于HA蛋白受體結合位點190螺旋上。

2.3.3糖基化位點分析 甲型H1N1流感病毒HA蛋白分子原有的糖基化位點有8個,分別是第10、11、23、87、276、287、481和540位。2016-2017監測年度的甲型H1N1流感病毒毒株與同期推薦的疫苗株A/California/07/2009相比,HA蛋白162位糖基化位點為162NQS。另外,1株毒株HA蛋白出現T278I位點突變,導致276位糖基化位點缺失。

2017—2019監測年度的甲型H1N1流感病毒毒株與同期推薦的疫苗株A/Michigan/45/2015相比,甲型H1N1流感毒株HA蛋白的第162位糖基化位點由NQS變異成NQT,雖未影響糖基化位點的增減,但是否有功能方面的意義還有待進一步研究。另外,1株毒株 HA蛋白出現T278A位點突變,導致276位糖基化位點缺失;1株毒株 HA蛋白出現G482E位點突變,但未影響糖基化位點的增減。

而2019—2020監測年度的甲型H1N1流感病毒毒株與同期推薦的疫苗株A/Brisbane/02/2018 相比,HA蛋白162位糖基化位點均為162NQT。另外,1株毒株HA蛋白出現G482E位點突變,但未影響糖基化位點的增減。

2.3.4致病性位點分析 2016—2020年4個監測年度甲型H1N1流感病毒HA蛋白裂解位點氨基酸序列為I(V)PSI(V)QSR↓GLFGAIA,只含有一個堿性氨基酸為精氨酸R,未出現多個堿性氨基酸(R、K、H)。

另外,甲型H1N1流感病毒的HA1蛋白第222位氨基酸位點突變也被證實與病毒致病性密切相關。HA1第222位為D時,病毒主要識別人上呼吸道α-2,6-半乳糖唾液酸受體,HA1蛋白第222位一旦出現D222E、D222N或D222G突變,病毒就會更容易與下呼吸道α-2,3-半乳糖唾液酸受體結合,增加感染人下呼吸道的可能,從而使患者出現肺炎等嚴重的下呼吸道癥狀。經分析,發現2018年1株樣本來源為長春市中心醫院的甲型H1N1流感病毒分離株A/Jilin-Nanguan/SWL1204/2018(H1),其HA蛋白出現D222N的突變,我們后續還對此毒株進行了全基因組序列分析。

3 討論

一般認為,甲型H1N1流感病毒的HA蛋白內部有4個抗原決定簇[2],分別是(不計信號肽)：Sa(124、153～157、159～164)、Sb(184～195)、Ca(137～142、166～170、203、221、235) 以及 Cb(70～75),這44個氨基酸是甲型H1N1流感病毒與宿主細胞受體相互作用的重要位點,因此突變可能使病毒具有免疫逃逸的能力,從而引起流行。以上位點若出現4個以上氨基酸位點突變,且突變涉及到2個及以上抗原決定簇位點;或一個涉及到抗原決定簇,另一個涉及到受體結合位點,就可以認為是具有流行病學意義的抗原變異株[3-4]。對長春地區2016—2020年4個監測年度甲型H1N1流行株的HA蛋白抗原決定簇分析,發現2016—2017年流行株相對于同期推薦的疫苗株A/California/07/2009,有4個共同突變涉及到了3個不同的抗原決定簇區域,因此提示2016—2017監測年度的甲型H1N1流感流行株與同期的疫苗株匹配度不理想,一定程度上也說明需要更換當時的疫苗組分,根據流行株的情況重新篩選甲型H1N1疫苗株,使疫苗株更好地匹配流行株,以保證流感疫苗對接種者的保護作用,從而預防甲型H1N1流感病毒大流行。

血凝素HA蛋白識別并結合宿主細胞表面的受體是流感病毒感染的關鍵步驟[12]。甲型H1N1流感病毒HA蛋白受體結合位點上關鍵氨基酸的變異可能會改變其受體結合的特異性,從而會影響流感病毒的傳播。分析發現2019年12月以后分離到的毒株HA基因所編碼的氨基酸出現D187A、Q189E位點共同突變,均位于HA蛋白受體結合位點190螺旋上,這很可能就會改變甲型H1N1流感病毒受體結合的特異性,從而會影響流感病毒在宿主間的傳播。

糖基化所形成的寡糖側鏈會影響蛋白質的折疊,結構的穩定性和生物活性。因此糖基化位點的改變或數目的增減會影響病毒的穩定性、傳染性和致病性。通過軟件與早期疫苗株A/California/07/2009對比,發現2016—2020年長春地區甲型H1N1流感病毒HA基因所編碼的氨基酸新增了一個162位糖基化位點。

除此之外,其它因素也會影響甲型H1N1流感病毒的致病性。流感病毒HA的前體是未成熟的HA0,只有HA0被水解成由二硫鍵連接的HA1和HA2兩個亞基后才可以感染宿主細胞。許多研究發現,HA蛋白中HA1和HA2裂解位點的堿性氨基酸的數量會影響HA蛋白對宿主蛋白酶的敏感性,從而影響流感病毒的致病性[5-6]。流感病毒HA裂解位點氨基酸序列中如果含有多個堿性氨基酸,則表現為高致病性,比如高致病性禽流感H5N1、H7N9等;如果只含有一個堿性氨基酸位點則表現為低致病性。經分析,發現2016—2020年4個監測年度甲型H1N1流感病毒HA蛋白裂解位點氨基酸序列只含有一個堿性氨基酸為精氨酸R,未出現多個堿性氨基酸。另外,HA1蛋白第222位出現D222E、D222N或D222G突變,會引起患者下呼吸道癥狀,已經在國際上引起共識[7-11]。經分析,發現2018年1株樣本來源為長春市中心醫院的甲型H1N1流感病毒分離株,其HA蛋白出現D222N的突變,提示此毒株可引起患者嚴重的下呼吸道癥狀。

目前,流感病毒和新冠病毒仍是引起全球大流行的重要呼吸道病原。隨著北半球流感季的到來,未來可能會出現流感病毒和新冠病毒疊加流行的風險。我們在警惕和監測新冠病毒持續變異的同時,還應繼續加強對流感病毒的抗原性、致病性、耐藥性等方面的監測,防止由于流感病毒的變異和重組,引起新冠和流感合并感染,從而加大患者出現重癥和死亡的風險。