不同雌激素濃度對重組人骨形態發生蛋白2干預乳腺癌MCF-7細胞生長和遷移影響的體外研究

劉書中,姚思遠△,吳昀效,劉 勇*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 骨科,北京 100730;2.北京大學公共衛生學院,北京100191)

骨形態發生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)是生長因子β超家族成員之一,迄今已經發現了30多種BMP,其中應用最為廣泛的是骨形態發生蛋白2(BMP-2)[1-2]。自2002年,重組人骨形態發生蛋白-2(rhBMP-2)在美國已被廣泛應用于骨不連、骨缺損、脊柱融合的手術治療中且臨床效果滿意。但與此同時,rhBMP-2的臨床應用是否會增加包括乳腺癌在內的多種惡性腫瘤的患病風險也引發了學界的關注[3]。此外,越來越多的研究證實了BMP通路在乳腺癌微鈣化灶形成和上皮間質轉化過程中的關鍵作用[4-5]。

BMP-2參與多種生物學過程,如組織分化、細胞增殖與凋亡、細胞功能調節等,并且在腫瘤的發生發展中亦扮演著重要角色[6-7]。有證據表明BMP-2異常表達與乳腺癌發生和進展密切相關,BMP相關通路在調節乳腺腫瘤細胞生物學功能方面以及調節腫瘤間質和骨轉移微環境中發揮重要作用[8]。本團隊前期研究已證實在體外條件下,以不同濃度的rhBMP-2處理細胞可顯著抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖能力,并增加G1期細胞所占比例、促進p21表達、抑制cyclin E表達,并顯著抑制PI3K/Akt信號通路的磷酸化過程[9]。在體內實驗中rhBMP-2可減小瘤體體積,免疫組化檢測顯示rhBMP-2處理可顯著降低瘤體組織中ki-67的表達水平[9]。

值得注意的是,乳腺癌的發生和發展過程與人體內環境中的雌激素水平密切相關[10-11]。Al Saleh等的研究表明沉默ERα可使體內雌二醇增加伴隨BMP-2過表達,并與乳腺癌上皮-間質轉化(EMT)過程相關[12]。Wang等研究發現BMP-2對MCF-7和MDA-MB-231細胞生長的抑制作用可被三苯氧胺拮抗,提示該作用與雌激素受體有關[13]。不同的雌激素水平很可能在體內、體外條件下對rhBMP-2干預乳腺癌細胞的生物學行為產生進一步的影響,干擾甚至可能會逆轉rhBMP-2對乳腺癌細胞的生物學作用。目前尚缺乏不同濃度雌激素對上述過程影響的論證結果,本研究擬探究不同濃度雌激素對rhBMP-2干預乳腺癌MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲以及細胞周期的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌MCT-7細胞(由中國醫學科學院基礎醫學研究所提供)、rhBMP-2(Novoprotein,上海)、Noggin(PrimeGene,上海)、雌激素(17β-oestradiol)(BioGems,美國)。試驗中使用的青霉素/鏈霉素溶液、胰蛋白酶、PBS緩沖液、MTT試劑、總RNA提取試劑盒、通用反轉錄試劑盒、實時定量PCR熒光定量試劑盒均購自索萊寶公司,無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司),胎牛血清、RPMI 1640培養基及其他細胞培養試劑購自Gibco公司,Transwell嵌套、細胞培養板購自Corning公司,細胞周期檢測試劑盒購自4A Biotech公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 將人乳腺癌MCF-7細胞培養于含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養基中,所有細胞在體積分數5% CO2的37℃培養箱中常規培養,培養液每2 d或3 d更換1次,當細胞長至80%鋪滿時消化傳代。

1.2.2細胞處理 MCF-7細胞按適當密度鋪板(第二天達80%匯合度),第二天換無血清培養基培養24 h,然后加入BMP-2、雌激素或noggin處理24 h。BMP-2處理濃度為100 ng/ml;noggin處理濃度為100 ng/ml。

1.2.3細胞分組 根據處理MCF-7細胞的rhBMP-2、noggin以及不同雌激素濃度條件,將各處理組分為：(1)MCF-7細胞+rhBMP-2;(2)MCF-7細胞+rhBMP-2+雌激素10-9mol;(3)MCF-7細胞+rhBMP-2+雌激素10-8mol;(4)MCF-7細胞+rhBMP-2+雌激素10-7mol;(5)MCF-7細胞+rhBMP-2+雌激素10-6mol;(6)MCF-7細胞;(7)MCF-7細胞+noggin;(8)MCF-7細胞+rhBMP-2+noggin。

1.2.4MTT試驗 消化對數生長期細胞,在96孔板中接種細胞懸液(100 μL/孔),將培養板放在培養箱中預培養一段時間(37℃,5% CO2),并按以上分組進行處理。向每孔加入10 μL MTT反應液,將培養板在培養箱內孵育4 h;吸走上清液,每孔加入100 μL的DMSO振蕩10 min,酶標儀測定在490 nm處的吸光度。

1.2.5Transwell遷移試驗與侵襲試驗 首先細胞采用常規消化傳代方法,制成細胞懸液,計數,調整濃度為2×105個/ml。將含10%血清的培養基加入培養板底部,上室加入200 μL細胞懸液,繼續在孵箱培養24 h。4%多聚甲醛孔中進行固定。取出培養板,PBS清洗兩次。100%甲醇室溫固定20 min后移到預先加入約700 μL 2.5%結晶紫溶液中,室溫染色15 min。PBS清洗、晾干后,使用熒光倒置顯微鏡完成細胞計數并拍照保存。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞周期 收集細胞,加入1 ml冰浴預冷的PBS重懸細胞。1 ml細胞懸液與95%乙醇混勻后4℃固定12 h,1000 rpm離心3 min,棄上清。加入5 ml 冰浴預冷的PBS重懸細胞,1000 rpm離心3 min,棄上清,配置PI染色液。染色：每管加入400 μl PI染色液,渦旋,避光30 min。上機檢測(在激發波長488 nm波長處檢測紅色熒光)。

1.2.7qPCR試驗 ①RNA提取：收集細胞沉淀,加入1 ml Trizol,室溫放置5 min,使得核酸蛋白復合物完全分離。重復離心、去廢液操作萃取RNA。②逆轉錄反應：在冰浴的無RNase的離心管中加入反應成分。70℃保溫5 min后迅速在冰上冷卻2 min。將離心管置25 ℃溫浴10 min,42 ℃溫浴60 min。再于95 ℃條件下加熱。終止反應后用RNase Free ddH2O將反應體系稀釋到200 μl,取5 μl作為PCR反應模板。③qPCR：根據合適條件配置反應體系,進行qPCR反應。以2-ΔΔCt法(Livak法)進行定量分析。

1.3 主要觀察指標

①體外試驗中不同雌激素濃度對rhBMP-2干預下乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響及相關mRNA、蛋白的表達情況;②體外試驗中不同雌激素濃度對rhBMP-2干預下乳腺癌MCF-7細胞遷移、侵襲和細胞周期的影響。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 不同濃度雌激素對rhBMP-2作用下MCF-7細胞增殖能力的影響

MTT試驗結果表明rhBMP-2組、noggin組較對照組有統計學差異(P<0.05),提示rhBMP-2、noggin均可抑制MCF-7細胞增殖見圖1A。在不同濃度雌激素處理組與對照組的對比中,我們發現10-9mol與10-8mol濃度的雌激素對rhBMP-2干預后的MCF-7細胞增殖有抑制作用(P<0.05),10-7mol與10-6mol濃度的雌激素對rhBMP-2干預后的MCF-7細胞增殖有促進作用(P<0.05),見圖1B。

圖注：A.rhBMP-2、noggin對MCF-7細胞增殖的影響;B.不同雌激素水平對rhBMP-2干預下MCF-7細胞增殖的影響

2.2 不同濃度雌激素對rhBMP-2作用下MCF-7細胞遷移能力的影響

圖注：A.NC組 B.rhBMP-2組 C.noggin組 D.rhBMP-2+noggin組E.統計分析顯示各組間無統計學差異

圖注：A.rhBMP-2組 B.rhBMP-2+10-9 mol雌激素組 C.rhBMP-2+10-8 mol雌激素組 D.rhBMP-2+10-7 mol雌激素組E.rhBMP-2+10-6 mol雌激素組 F.統計分析顯示部分濃度的雌激素水平對rhBMP-2干預下的MCF-7細胞遷移具有統計學意義

2.3 不同濃度雌激素對rhBMP-2作用下MCF-7細胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲試驗中,rhBMP-2、noggin具有減少MCF-7細胞侵襲的趨勢,但無統計學差異,見圖4。不同濃度的雌激素對于rhBMP-2干預后MCF-7細胞的侵襲能力有降低趨勢,但均無統計學差異,見圖5。

圖注：A.對照組 B.rhBMP-2組 C.noggin組 D.rhBMP-2+noggin組E.統計學分析結果顯示各組間無統計學差異

圖注：A.rhBMP-2組 B.rhBMP-2+10-9 mol雌激素組 C.rhBMP-2+10-8 mol雌激素組 D.rhBMP-2+10-7 mol雌激素組E.rhBMP-2+10-6 mol雌激素 F.統計學分析顯示各組間無統計學差異

2.4 不同濃度雌激素對rhBMP-2作用下MCF-7細胞周期的影響

流式分析結果顯示rhBMP-2可影響乳腺癌MCF-7細胞的G1期(P<0.05),noggin可影響MCF-7細胞的S期(P<0.05),兩者共同作用可進一步影響MCF-7細胞的S期(P<0.01),而對G2期均無顯著性影響,見圖6。10-9mol雌激素濃度可影響G1期(P<0.05),10-9mol、10-7mol、10-6mol雌激素濃度可影響S期(P<0.05),不同雌激素濃度對細胞G2期均無顯著性影響,見圖7。

圖6 rhBMP-2、noggin對乳腺癌MCF-7細胞周期的影響

圖7 不同濃度梯度的雌激素對乳腺癌MCF-7細胞周期的影響

2.5 不同濃度雌激素對rhBMP-2作用下MCF-7細胞周期相關蛋白轉錄情況的影響

2.5.1CDK2轉錄 相對于“MCF-7細胞+rhBMP-2”組而言,“MCF-7細胞+rhBMP-2+10-9mol雌激素”組、“MCF-7細胞+rhBMP-2+10-8mol雌激素”組、“MCF-7細胞+rhBMP-2+10-6mol雌激素”組基因CDK2轉錄水平顯著降低,而“MCF-7細胞+rhBMP-2+10-7mol雌激素”組則無統計學差異,見圖8A。相對于“MCF-7細胞”組而言,“MCF-7細胞+rhBMP-2+noggin”組的CDK2轉錄水平明顯降低,而“MCF-7細胞+ noggin”組、“MCF-7細胞+rhBMP-2”組CDK2轉錄水平并無統計學差異,見圖8B。

圖8 不同濃度雌激素對rhBMP-2干預下MCF-7細胞CDK2轉錄的影響

2.5.2CDK4轉錄 相對于“MCF-7細胞+rhBMP-2”組而言,“MCF-7細胞+rhBMP-2+10-7mol雌激素”組基因CDK4轉錄水平顯著降低,而其余各組(“MCF-7細胞+rhBMP-2+10-9mol雌激素”組、“MCF-7細胞+rhBMP-2+10-8mol雌激素”組、“MCF-7細胞+rhBMP-2+10-6mol雌激素”組)均無統計學差異,見圖9A。相對于“MCF-7細胞”組,“MCF-7細胞+rhBMP-2”組CDK4轉錄水平降低,“MCF-7細胞+noggin”組、“MCF-7細胞+rhBMP-2+noggin”組CDK4轉錄水平無顯著統計學差異,見圖9B。

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圖9 不同濃度雌激素對rhBMP-2干預下MCF-7細胞CDK4轉錄的影響

2.5.3cyclin D1轉錄 相對于“MCF-7細胞+rhBMP-2”組,“MCF-7細胞+rhBMP-2+10-9mol雌激素”組和“MCF-7細胞+rhBMP-2+10-6mol雌激素”組cyclin D1轉錄水平降低,另外2組(“MCF-7細胞+rhBMP-2+10-8mol雌激素”、“MCF-7細胞+rhBMP-2+10-7mol雌激素”)沒有顯著統計學差異,見圖10A。相對于“MCF-7細胞”組,另外3組(“MCF-7細胞+rhBMP-2”、“MCF-7細胞+noggin”、“MCF-7細胞+rhBMP-2+noggin”)cyclin D1轉錄水平無統計學差異,見圖10B。

圖10 不同濃度雌激素對rhBMP-2干預下MCF-7細胞cyclin D1轉錄的影響

2.5.4cyclin E轉錄 相對于“MCF-7細胞+rhBMP-2”組,“MCF-7細胞+rhBMP-2+雌激素10-6mol”組cyclin E轉錄水平降低,其他3組(“MCF-7細胞+rhBMP-2+雌激素10-9mol”、“MCF-7細胞+rhBMP-2+雌激素10-8mol”、“MCF-7細胞+rhBMP-2+雌激素10-7mol”)沒有統計學差異,圖11A。相對于“MCF-7細胞”組,其他3組(“MCF-7細胞+rhBMP-2”、“MCF-7細胞+noggin”、“MCF-7細胞+rhBMP-2+noggin”)cyclin E轉錄水平沒有統計學差異,見圖11B。

圖11 不同濃度雌激素對rhBMP-2干預下MCF-7細胞cyclin E轉錄的影響

2.5.5p21轉錄 相對于“MCF-7細胞+rhBMP-2”組,“MCF-7細胞+rhBMP-2+雌激素10-9mol”組p21轉錄水平降低,其他3組(“MCF-7細胞+rhBMP-2+雌激素10-8mol”、“MCF-7細胞+rhBMP-2+雌激素10-7mol”、“MCF-7細胞+rhBMP-2+雌激素10-6mol”)沒有統計學差異,見圖12A。相對于“MCF-7細胞”組,其他3組(“MCF-7細胞+rhBMP-2”、“MCF-7細胞+noggin”、“MCF-7細胞+rhBMP-2+noggin”)p21轉錄水平沒有統計學差異,見圖12B。

圖12 不同濃度雌激素對rhBMP-2干預下MCF-7細胞p21轉錄的影響

3 討論

2002年美國FDA率先批準rhBMP-2的臨床應用至今,其誘導骨骼形成及組織修復的功效已經得到國際上的普遍認可,并且在生物組織工程學領域展現出了廣闊的應用前景[2,14-15]。然而,多項體外和在體試驗證明腫瘤細胞中可表達BMP-2受體,并且發現rhBMP-2具有促進包括乳腺癌在內的多種惡性腫瘤發生及腫瘤細胞生長、增殖、侵襲和轉移的潛能[6-7]。這就使得rhBMP-2臨床應用的安全性問題成為學界關注的熱點議題[16-17]。

迄今為止,尚缺乏關于rhBMP-2的臨床應用與乳腺癌的發生、發展的相關性研究,Ghosh-Choudhury等以乳腺癌MDA-MB-231細胞系為研究對象,運用體外試驗證實了BMP-2對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用可通過調控Rb蛋白的CDK磷酸化過程而實現[18]。Katsuno等發現BMP-2可調控Smad通路促進乳腺癌MDA-231-D細胞的侵襲能力和骨轉移事件的發生[19]。在此基礎上,Ye等[20]進一步推測rhBMP-2是通過調節多種細胞周期蛋白表達及Smad、Wnt信號通路而抑制乳腺癌細胞增殖。

在乳腺癌發生、發展過程中,雌激素水平的調節發揮著極其關鍵的生物學作用。在MDA-MB-231細胞中,BMP-2誘導ER剪接變異體(ERα-36)的表達呈劑量依賴性,雌二醇可刺激MDA-MB-231細胞的生長,當BMP-2信號通路被si-BMPR IA和si-BMPR IB沉默時,ERα-36誘導即被解除[21]。袁霞等[22]研究發現BMP-2可阻滯雌二醇誘導的 MCF-7、T-47D以及ZR-75-1細胞系生長,提示BMP-2可有效抑制雌激素敏感乳腺癌細胞的增殖,研究表明BMP-2主要抑制細胞周期的G1期并與誘導p21蛋白相關。同時研究者探究了BMP-2對非雌激素依賴的乳腺癌細胞增殖的作用,發現BMP-2抑制了MDA-MB-231細胞增殖,而MDA-MB-468細胞系的增殖卻未受到抑制[22]。

張麗等證實rhBMP-2可促進乳腺癌細胞增殖并增強其遷移、侵襲能力,同時降低凋亡能力,反之noggin可抑制腫瘤增殖、侵襲及遷移能力,并可以促進細胞凋亡[23]。汪炬等的研究與本團隊先前的研究均支持rhBMP-2對乳腺癌MCF-7細胞增殖具有顯著的抑制作用,且呈濃度依賴性[9,24]。此外,張麗等發現BMP-2可以通過激活PI3K/Akt信號通路促進MCF-7細胞發生乳腺癌上皮-間質轉化,從而誘導腫瘤侵襲轉移,這也與本團隊先前的研究結果一致[9,23]。汪炬等[24]研究表明BMP-2可上調與遷移力正相關的ID1、Pail等基因表達,并通過激活BMP信號途徑,誘導細胞發生EMT轉化,從而促進乳腺癌細胞遷移及侵襲。李珍等[25]亦提出rhBMP-2可通過上調CD44表達來增加乳腺癌MCF-7細胞遷移能力。在本研究中,我們發現不同濃度的雌激素可影響rhBMP-2干預后MCF-7細胞的遷移,但并未發現rhBMP-2對MCF-7細胞的遷移和侵襲顯著的促進作用,這可能是由于本研究與先前研究中使用的rhBMP-2濃度與作用時間不同所致。

BMP能夠調節乳腺癌細胞的生長,BMP信號的抑制顯著降低有絲分裂檢查點組分BUB3、Hec1、TTK和MAD2的蛋白質水平,導致細胞分裂和腫瘤發生,而BMP信號通路的激活則可對乳腺癌細胞產生相反的影響[26]。在BMP-2作用的研究中,發現BMP-2在體外對腫瘤細胞有直接的抗增殖作用[9,27]。另外,有學者證明BMP-2能增加MCF-7細胞中PTEN的表達,從而導致增殖減少[28]。PTEN是一種通過調節PI3K/Akt途徑影響增殖的腫瘤抑制因子,PTEN突變者,乳腺癌的風險明顯增加。在BMP-2存在下,PTEN與泛素結合蛋白的結合減少,表明BMP-2可能降低PTEN的降解,從而抑制細胞增殖。本研究中MTT試驗結果提示較低濃度的雌激素對rhBMP-2干預后的MCF-7細胞增殖有抑制作用,而較高濃度的雌激素對rhBMP-2干預后的MCF-7細胞增殖則具有促進作用。

多項研究表明BMP-2可在體外和體內促進MCF-7和MDA-MB-231細胞的運動性和侵襲性[29,30]。BMP-2對腫瘤微環境、腫瘤細胞遷移和侵襲的影響對乳腺癌的發生和進展具有重要意義[8]。通過BMP信號通路激活刺激成纖維細胞可促進乳腺腫瘤細胞侵襲并增加炎性細胞因子的產生[31-32]。在三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞中,上調的BMPR IB顯示出BMP-2作用下的細胞遷移能力增加,BMPR拮抗劑可消除上述現象[33]。BMP-2可能通過在腫瘤周圍基質中誘導細胞外基質糖蛋白Tenascin-W的形成而促進腫瘤細胞的侵襲和遷移,乳腺癌間質中Tenascin-W的過度表達通過與α8整合素的相互作用促進癌細胞的侵襲和遷移[34]。在乳腺癌中,BMP信號對干細胞群的影響尚不明確,并且因實驗條件而異。BMP2/7異二聚體在體外顯著降低乳腺癌干細胞群的大小,在體內能夠抑制骨轉移的形成[35]。本實驗中Transwell遷移試驗提示不同濃度的雌激素均可促進rhBMP-2干預后MCF-7細胞的遷移,其中部分濃度具有統計學意義。

在細胞周期方面,多種BMPs在乳腺癌中具有直接或間接的抗腫瘤增殖作用,但這可能與BMP受體平衡或功能異常有關。BMP-2可通過上調細胞周期蛋白激酶抑制劑p21抑制雌二醇誘導的乳腺癌細胞增殖,進而抑制雌二醇誘導的細胞周期蛋白D1相關激酶活性[36]。有研究證實rhBMP-2可通過Rb和CD44信號通路誘導乳腺癌細胞EMT和干細胞凋亡,進而促進乳腺癌轉移[37-38]。BMP-2促進MCF10A乳腺細胞產生管腔祖細胞,而BMP-4則可阻止分化,表明BMP-2和BMP-4之間的平衡決定了乳腺細胞的命運[39]。有研究提示BMPs可誘導干細胞靜止,當腫瘤抑制因子ΔNp63α在MCF-7細胞中表達時,BMP靶基因ID-1上調,增殖顯著減少。祖細胞樣細胞比例增加,細胞處于可逆G0期。因而,研究者認為BMP信號誘導MCF7細胞靜止是由ΔNp63α介導[40]。我們的研究發現10-9mol雌激素濃度可影響乳腺癌MCF-7細胞的G1期,10-9mol、10-7mol、10-6mol雌激素濃度可影響MCF-7細胞的S期,并且不同濃度的雌激素水平處理下細胞周期相關基因CDK2、CDK4、cyclin D1、cyclin E、p21的轉錄水平亦發生相應改變。本研究首次通過實驗證實不同濃度雌激素對rhBMP-2干預乳腺癌MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲以及細胞周期的影響。

本研究尚存在諸多不足之處：(1)本研究僅以MCF-7細胞系為研究對象,乳腺癌分子表型多樣,研究結論是否適用于其他乳腺癌細胞亞型尚需進一步探索;(2)雌激素于人體內存在不同的活性類型,不同類型雌激素及其組合對于MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲及細胞周期的影響有待進一步實驗加以論證;(3)本實驗未進行細胞周期蛋白表達水平的Western blot檢測及分析,不同濃度梯度的雌激素對于乳腺癌MCF-7細胞周期蛋白表達的影響有待進一步深入探討。

綜上所述,不同濃度雌激素對重組人骨形態發生蛋白2干預乳腺癌MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲及細胞周期存在一定影響。本項研究的意義在于：一方面為rhBMP-2的臨床應用并發癥與安全性提供了一定的理論依據,另一方面則為乳腺癌及乳腺癌骨轉移的預防和治療靶點的選擇提供了新的思路。我們需要開展更為深入的研究來闡明BMP-2及其相關通路在乳腺癌發生發展中的作用及不同濃度雌激素對乳腺癌發生及疾病進展的影響及其作用機制。