PFKFB4對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移侵襲能力的影響及其機(jī)制探討

艾登超,董竹林

(天津市泰達(dá)醫(yī)院 骨科,天津300457)

骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是最常見(jiàn)且最具侵襲性的骨腫瘤,患者多為兒童、青少年和青年,早期及出現(xiàn)頻繁復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其主要特點(diǎn)[1]。人群中OS的年發(fā)病率為每百萬(wàn)人中2-3人,15-19歲青少年發(fā)病率最高,為每百萬(wàn)人中8-11人。OS常見(jiàn)于長(zhǎng)骨,如股骨、脛骨和肱骨,而較少發(fā)生于顱骨、下頜和骨盆[2]。盡管手術(shù)可切除疾病的患者可能會(huì)存活很長(zhǎng)時(shí)間,但復(fù)發(fā)和不可切除疾病患者的預(yù)后仍不令人滿意。OS的總體預(yù)后在過(guò)去30年中沒(méi)有顯著改善[3]。因此,研究OS發(fā)生發(fā)展機(jī)制,開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

代謝重編程是癌癥進(jìn)展的主要標(biāo)志之一。即使在正常的氧合條件下,癌癥細(xì)胞仍然選擇通過(guò)糖酵解將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸,這一現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng),該效應(yīng)是代謝重編程的重要組成部分[4]。細(xì)胞內(nèi)果糖2,6-二磷酸(fructose 2,6-bisphosphate,F2,6BP)水平對(duì)控制細(xì)胞糖酵解速率起到重要作用,它可增強(qiáng)6-磷酸果糖-1-激酶(6-phosphofructo-1-kinase,PFK-1)與果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate,F6P)的結(jié)合,并克服ATP對(duì)PFK-1的抑制,促進(jìn)果糖-1,6-二磷酸(fructose-1,6-bisphosphate,F1,6P2)的合成,推動(dòng)糖酵解過(guò)程。F2,6BP的濃度由磷酸果糖激酶2/果糖-2,6-二磷酸酶(phosphofructokinase 2/fructose-2,6-bisphosphatase,PFKFB)控制[5]。

已有報(bào)道表明,PFKFB家族在多種腫瘤中存在異常表達(dá)并在促進(jìn)腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。盡管PFKFB(PFKFB1-4)的4種同工酶的核心催化域具有較高的序列同源性(85%),但它們的催化特性具有很大差異。因此,盡管對(duì)PFKFB4促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的相關(guān)機(jī)制已在包括骨肉瘤在內(nèi)的多種腫瘤中得到充分揭示,PFKFB4在骨肉瘤中的作用及其具體機(jī)制仍亟待探索。因此,本研究擬在兩種骨肉瘤細(xì)胞系中進(jìn)分別敲低或過(guò)表達(dá)PFKFB4,并探討其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響以及內(nèi)在機(jī)制,為骨肉瘤藥物靶點(diǎn)的鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人成骨細(xì)胞hFOB1.19和骨肉瘤細(xì)胞系MG63、Saos-2、U2OS和HOS均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection,ATCC)并進(jìn)行了STR鑒定,細(xì)胞傳代在20代以內(nèi);DMEM高糖培養(yǎng)基,1×PBS緩沖液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,Seahorse Assay kit購(gòu)自Agilent Technologies公司。Cell Counting Kit-8(CCK8)購(gòu)自日本同仁公司,RIPA蛋白裂解液,一抗二抗稀釋液、BCA蛋白定量試劑盒,化學(xué)發(fā)光ECL試劑,等均購(gòu)自武漢博士德公司,兔源GADPH抗體,兔源PFKFB4抗體,鼠源AKT抗體,鼠源p-AKT抗體,過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;胎牛血清、100×青霉素-鏈霉素混合物購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;PFKFB4敲低小干擾RNA和過(guò)表達(dá)病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人成骨細(xì)胞hFOB1.19和骨肉瘤細(xì)胞系MG63、Saos-2、U2OS和HOS培養(yǎng)基配制：10%胎牛血清+90% DMEM高糖培養(yǎng)基+1%青霉素-鏈霉素混合物,于37℃,5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。使用上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司設(shè)計(jì)并構(gòu)建的PFKFB4敲低小干擾RNA和過(guò)表達(dá)病毒,根據(jù)上述供應(yīng)商提供的說(shuō)明書在骨肉瘤細(xì)胞系中敲低或過(guò)表達(dá)PFKFB4基因。構(gòu)建成功后,Western印跡實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)敲低或過(guò)表達(dá)效率。

1.2.3CCK8細(xì)胞檢測(cè) 當(dāng)細(xì)胞消化后計(jì)數(shù),在96孔板中每孔接種3000個(gè)細(xì)胞。將96孔板放于培養(yǎng)箱中,分別在細(xì)胞貼壁后0天、1天、2天、3天和4天加入CCK8試劑,避光培養(yǎng)2 h后測(cè)定吸光度。

1.2.4Transwell檢測(cè) 使用具有24孔聚碳酸酯膜(8 mm孔徑;美國(guó)康寧)的Transwell細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞遷移測(cè)定。將含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(500 μl)加入下腔后,置入Transwen小室。收集150 μl不含血清的細(xì)胞懸浮液(1×106細(xì)胞/ml)鋪入每個(gè)小室上層,并在37℃、5%CO2孵育24 h。以4%多聚甲醛細(xì)胞固定液固定,并用0.1%結(jié)晶紫染色。對(duì)于細(xì)胞侵襲測(cè)定,在加入細(xì)胞懸浮液之前,用Matrigel(BD Biosciences)涂覆Transwell室。

1.2.5Seahorse Assay 按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。在XFe24細(xì)胞培養(yǎng)板(102342-100,Agilent Technologies)中每孔接種20000個(gè)細(xì)胞,并在37℃下孵育過(guò)夜。第二天,將培養(yǎng)基改為含有1 mM谷氨酰胺的海馬XF DMEM培養(yǎng)基,然后將細(xì)胞在37℃下在無(wú)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min,以平衡培養(yǎng)基pH和溫度。在基線條件下監(jiān)測(cè)細(xì)胞外酸化率(ECAR),并用10 mM葡萄糖、1 μM寡霉素、50 mM 2-DG處理。

1.2.6ADP/ATP比值 使用購(gòu)自Sigma-Aldrich的ADP/ATP試劑盒測(cè)量ADP/ATP比率。實(shí)驗(yàn)操作后讀取熒光值,計(jì)算ADP/ATP比率。

1.2.7QPCR 采用takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒,按照說(shuō)明書進(jìn)行cDNA合成后,進(jìn)行PCR分析。引物序列為：PFKFB4：Forward：GATCCTGAGGTCATA-GCTGCCA;Reverse：CTATCCAGGTCCTCATCT-AGCG;GAPDH： Forward： GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG;Reverse：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用graphpad進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析,計(jì)數(shù)資料根據(jù)分組情況進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差檢驗(yàn),P< 0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PFKFB4在成骨細(xì)胞系及骨瘤肉細(xì)胞系的mRNA表達(dá)水平

提取人成骨細(xì)胞hFOB1.19和骨肉瘤細(xì)胞系MG63、Saos-2、U2OS和HOS總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,并檢測(cè)上述細(xì)胞中PFKFB4的相對(duì)表達(dá)量。QPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與人成骨細(xì)胞hFOB1.19相比,骨肉瘤細(xì)胞系MG63、Saos-2、U2OS和HOS內(nèi)PFKFB4的mRNA相對(duì)表達(dá)量均有升高,見(jiàn)圖1。

圖1 人成骨細(xì)胞hFOB1.19和骨肉瘤細(xì)胞系MG63、Saos-2、U2OS和HOS內(nèi)PFKFB4的mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.2 PFKFB4高表達(dá)增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的增殖及遷徙侵襲的能力

以小干擾RNA或慢病毒分別轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系MG63及HOS,敲低或過(guò)表達(dá)細(xì)胞內(nèi)PFKFB4水平,Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,MG63細(xì)胞系內(nèi)的PFKFB4蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào),而HOS細(xì)胞系內(nèi)的PFKFB4蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)。接下來(lái),我們進(jìn)一步檢測(cè)了PFKFB4表達(dá)水平對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,在MG63細(xì)胞系敲低PFKFB4蛋白表達(dá)水平可顯著下調(diào)細(xì)胞增殖能力,而在HOS細(xì)胞系內(nèi)過(guò)表達(dá)PFKFB4蛋白表達(dá)后,其增殖能力得到顯著增強(qiáng)。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)則發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,PFKFB4敲低組遷移及侵襲能力得到顯著抑制,而PFKFB4過(guò)表達(dá)組的遷移及侵襲能力顯著增強(qiáng),見(jiàn)圖2。

圖2 PFKFB4表達(dá)水平與骨肉瘤細(xì)胞的增殖及遷徙侵襲的能力顯著相關(guān) A)B)CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低或過(guò)表達(dá)PFKFB4后兩種細(xì)胞的增殖能力; C)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低或過(guò)表達(dá)PFKFB4后兩種細(xì)胞的遷移能力;D)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低或過(guò)表達(dá)PFKFB4后兩種細(xì)胞的侵襲能力

2.3 PFKFB4介導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞糖酵解及ATP供應(yīng)增強(qiáng)

通過(guò)seahorse檢測(cè)試劑盒,檢測(cè)敲低或過(guò)表達(dá)PFKFB4后骨肉瘤細(xì)胞的糖酵解情況。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,敲低PFKFB4可以有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的糖酵解,而過(guò)表達(dá)PFKFB4則正相反。通過(guò)ADP/ATP檢測(cè)試劑盒,檢測(cè)敲低或過(guò)表達(dá)PFKFB4后骨肉瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)情況,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,敲低PFKFB4可以干擾制骨肉瘤細(xì)胞的能量供應(yīng),而過(guò)表達(dá)PFKFB4則可增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的能量供應(yīng),見(jiàn)圖3。

圖3 PFKFB4影響骨肉瘤細(xì)胞糖酵解及ATP供應(yīng)水平 A)seahorse實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低或過(guò)表達(dá)PFKFB4后兩種細(xì)胞的糖酵解;B)ADP/ATPassay檢測(cè)敲低或過(guò)表達(dá)PFKFB4后兩種細(xì)胞的能量供應(yīng)

2.4 PFKFB4介導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞AKT信號(hào)通路活化

Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在MG63細(xì)胞系敲低PFKFB4蛋白表達(dá)水平可顯著下調(diào)AKT蛋白磷酸化水平,而在HOS細(xì)胞系內(nèi)過(guò)表達(dá)PFKFB4蛋白表達(dá)后,細(xì)胞內(nèi)AKT蛋白磷酸化水平顯著升高,見(jiàn)圖4。

圖4 PFKFB4影響骨肉瘤細(xì)胞AKT信號(hào)通路活化水平

3 討論

近年來(lái)已有多篇文獻(xiàn)針對(duì)PFKFB4在腫瘤中的表達(dá)水平以及臨床意義進(jìn)行了研究。Zhou等的研究發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組織相比,PFKFB4在肺癌組織中的表達(dá)水平顯著增加;生存分析顯示,PFKFF4高表達(dá)的患者預(yù)后較差;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在非小細(xì)胞肺癌患者中,PFKFB4表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫檢查點(diǎn)表達(dá)顯著相關(guān)[6]。在胃癌中,Wang等的研究發(fā)現(xiàn),與鄰近正常組織相比,胃癌組織中PFKFB4的表達(dá)上調(diào)。PFKFB4的表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤T分期和TNM分期相關(guān),在<65歲、腫瘤直徑較大、T分期較晚和TNM分期較晚的患者腫瘤組織中,可觀察到PFKFB4表達(dá)水平顯著上調(diào)。KM生存分析表明,與PFKFB4高表達(dá)患者相比,PFKFB4低表達(dá)患者的總生存率、首次進(jìn)展生存率和進(jìn)展后生存時(shí)間顯著提高。此外,在T晚期和TNM晚期疾病患者中,PFKFB4的表達(dá)與OS時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[7]。此外,PFKFB4高表達(dá)與腫瘤患者預(yù)后不良顯著相關(guān)還可在膀胱癌和乳腺癌中觀測(cè)到[8-9]。上述研究不僅強(qiáng)調(diào)了PFKFB4異常表達(dá)在多種腫瘤中具有顯著的臨床意義,更提示我們PFKFB4可能通過(guò)多種機(jī)制推動(dòng)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

近年來(lái)的研究也開(kāi)始針對(duì)PFKFB4促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的詳細(xì)機(jī)制進(jìn)行探討,并發(fā)現(xiàn)PFKFB4以增強(qiáng)糖酵解或發(fā)揮激酶活性等多種方式實(shí)現(xiàn)。在乳腺癌中,PFKFB4可以發(fā)揮其激酶活性,在絲氨酸857處磷酸化SRC-3并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性,刺激腫瘤細(xì)胞增加嘌呤合成,從而增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的增殖能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力[10]。在惡性黑色素瘤中的研究將糖酵解相關(guān)酶PFKFB4與RAS-AKT信號(hào)聯(lián)系了起來(lái)。在惡性黑色素瘤中,ICMT可通過(guò)轉(zhuǎn)錄后修飾途徑控制RAS蛋白活性。該研究發(fā)現(xiàn)PFKFB4通過(guò)促進(jìn)ICMT/RAS相作,控制了質(zhì)膜上的RAS定位,激活了AKT信號(hào)并增強(qiáng)細(xì)胞遷移[11]。在另一篇關(guān)于乳腺癌的研究中,研究者發(fā)現(xiàn),在小鼠乳腺癌癥模型中,敲低PFKFB4表達(dá)可顯著抑制腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。從機(jī)制上講,低氧微環(huán)境可誘導(dǎo)PFKFB4出現(xiàn)核移位,推動(dòng)HIF-1α的異常轉(zhuǎn)錄激活。該研究結(jié)果表明,PFKFB4的表達(dá)對(duì)于缺氧微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞的適應(yīng)至關(guān)重要[12]。

我們的研究發(fā)現(xiàn),OS細(xì)胞系中PFKFB4的mRNA表達(dá)水平均高于正常成骨細(xì)胞系。與對(duì)照組相比,影響PFKFB4表達(dá)后骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力均收到顯著影響降低。我們的研究說(shuō)明,PFKFB4在骨肉瘤細(xì)胞中同樣存在異常高表達(dá),且其高表達(dá)對(duì)維持促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展具有推動(dòng)作用,我們的研究與上述研究得出的結(jié)論一致。不僅如此,我們的研究還發(fā)現(xiàn),PFKFB4可影響OS(骨肉瘤)細(xì)胞的糖酵解速率及能量供應(yīng)。

我們的數(shù)據(jù)表明,PFKFB4調(diào)節(jié)的糖酵解可以通過(guò)增強(qiáng)能量供應(yīng)從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。充足的ATP補(bǔ)充對(duì)于蛋白質(zhì)磷酸化是必要條件,也是以促進(jìn)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活所必須的[13]。我們的研究發(fā)現(xiàn),在OS細(xì)胞中,改變PFKFB4表達(dá)水平可顯著影響AKT通路的活化,這說(shuō)明PFKFB4可能通過(guò)推動(dòng)糖酵解途徑,持續(xù)增加細(xì)胞內(nèi)ATP供應(yīng),并影響了AKT信號(hào)通路的活化,從而刺激并維持骨肉瘤細(xì)胞的進(jìn)展。

綜上,在骨肉瘤中,PFKFB4可通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的糖酵解碼,增強(qiáng)能量供應(yīng),從而激活A(yù)KT通路,從而最終對(duì)腫瘤進(jìn)展起到推動(dòng)作用;PFKFB4有望成為治療骨肉瘤的新靶點(diǎn)。