骨關節炎模型中促炎癥因子及膝關節組織病理變化的研究

王嘉鵬,呂秋波,范冀緩,白晉平,林 霞

(1.吉林省一汽總醫院,吉林 長春130011;2.吉林大學第二醫院,吉林 長春130041)

骨關節炎(osteoarthritis,OA)是臨床上常見的一種漸進性、退行性關節病變[1-3]。OA發病的具體機制尚不是十分明確,對OA的治療只能局限于對癥處理。以往觀點認為 OA是一種退行性疾病,其病理改變主要為關節軟骨磨損、軟骨下骨硬化和關節周緣骨贅增生等。然而隨著研究的深入,炎癥反應在 OA 發病中的重要作用逐漸得到廣泛關注。為了探索骨關節炎中炎癥反應的變化及作用,通過采用弗氏完全佐劑復制OA動物模型[4],對骨關節炎模型血液中炎癥指標IL-1、IL-2、IL-6、TNF、MMP-9、Ts、Mφ、NO采樣檢測,觀察膝關節病理組織變化,對骨關節炎發病機制進行深入的探討和研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物wistar 大鼠,SPF級,雄性,體重180-200 g,合格證編號：201700017972,購自于長春億斯實驗動物技術有限責任公司,許可證號：SCXK(吉)-2016-0003在屏障系統內飼養并進行試驗。

1.1.2實驗藥品及試劑 結核桿菌(吉林省中醫藥科學院提供),戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限公司),玻璃酸鈉(25 mg/支,上海景峰制藥有限公司),MMP-9,(96T,美國BD公司),Mφ(96T,美國BD公司),IL-1(96T,美國BD公司),IL-2(96T,美國BD公司),IL-6(96T,美國BD公司),NO(96T,美國BD公司),TNF-α(96T,美國BD公司)。

1.1.3實驗儀器 T2000型電子稱(由美國雙杰兄弟有限公司),ELx800酶標儀(美國Bio Tek公司),DHG-9030A型電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司),GI54DWS型高壓滅菌鍋(致微儀器有限公司),FCC-2000型精密恒溫水浴箱(上海比朗儀器有限公司),RM2255型高精密全自動切片機 (德國徠卡儀器有限公司),Leica EG-1130型修切冷臺(德國徠卡儀器有限公司),zLxL-A型蠟塊修復儀(天津市久圣醫療電子儀器有限公司),DGH-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司),YT-7F型烤片展片機(湖北孝感亞光電子有限公司),YR-21型染色機(湖北孝感亞光電子有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1模型制備 將液體石蠟加熱致70℃,然后向其中加入結核桿菌至每毫升8 mg,最后加少量液體石蠟邊加邊研磨,然后用注射器來回抽、沖,充分混勻。高壓滅菌,封裝備用,做成福氏完全佐劑(FCA),每只大鼠于右后足跖皮內注射100 μl。

1.2.2分組給藥 取雄性Wistar大鼠30只,分為空白對照組,OA模型組,治療組(玻璃酸鈉皮下注射4 mg/kg),造模給藥前大鼠眼球后靜脈叢采血,第二天注射FCA造模,造模后治療組開始給藥(造模后第1、5、10、15天皮下注射玻璃酸鈉),在造模后的第8、10、12、14、16、18、20天大鼠眼球后靜脈叢采血,進行炎癥因子指標檢測。

1.2.3檢測指標 在造模后的第8、10、12、14、16、18、20天大鼠眼球后靜脈叢采血,檢測血液中MMP-9、Mφ、IL-1、IL-2、IL-6、NO、TNF-α的變化并進行組間比較。造模第20天結束后,戊巴比妥鈉麻醉處死動物取膝關節做組織病理學觀察。

1.2.4 統計學分析檢測結果采用t檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 促炎癥因子結果見表1-7。結果顯示,造模第8天OA模型組與空白對照組比較,IL-1、IL-2、IL-6 升高(P<0.05);造模第10、12、14天OA模型組與空白對照組比較,MMP-9、Mφ、NO 升高(P<0.05),IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α升高(P<0.01)。OA模型組與治療組比較IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α升高(P<0.05);造模第16、18、20天OA模型組與空白對照組比較,IL-6、MMP-9、Mφ、NO升高(P<0.01),IL-1、IL-2、TNF-α升高有顯著差異(P<0.001),OA模型組與治療組比較IL-1、IL-2、IL-6、MMP-9、Mφ、NO、TNF-α升高(P<0.05)。

表1 OA模型大鼠不同時間點IL-1(pg/ml)的變化

表2 OA模型大鼠不同時間點IL-2(ng/L)的變化

表3 OA模型大鼠不同時間點IL-6(pg/ml)的變化

表4 OA模型大鼠不同時間點MMP-9(ng/L)的變化

表5 OA模型大鼠不同時間點Mφ(ng/L)的變化

表6 OA模型大鼠不同時間點NO(ng/L)的變化

表7 OA模型大鼠不同時間點TNF-α(ng/L)的變化

2.2 病理組織學HE染色結果造模第12天,病理結果見圖1～3。圖1顯示空白對照組關節面軟骨連續,飽滿,較厚,軟骨細胞飽滿,分散分布;圖2顯示OA模型組較空白對照組關節軟骨層變薄,正常軟骨細胞消失,纖維組織與巨噬細胞成分增加,關節周圍纖維組織成分增生;圖3顯示治療組軟骨塌陷,關節軟骨層變薄,正常軟骨細胞消失,纖維組織與巨噬細胞成分增加,關節周圍纖維組織成分增生輕于OA模型組。

圖1 空白對照組HE染色結果(400×) 圖2 OA模型組HE染色結果(400×) 圖3 治療組HE染色結果(400×)

3 討論

促炎癥因子(pro-inflammatory cytokines,PIC)是炎癥反應的重要媒介,OA 中PIC水平顯著升高,加速關節軟骨的破壞,加重滑膜炎癥,促進 OA 的進展[5-6]。其中白細胞介素、腫瘤壞死因子和基質金屬蛋白酶作為經典的 PIC介導炎癥反應,引起 OA 進展的機制已被眾多研究所闡明[7-8]。近年來,新的 PIC 不斷涌現,以往認為與 OA 發病無關的 PIC被證實在疾病進展中扮演重要角色,一些 PIC 甚至可以通過調節上述經典 PIC 來參與 OA 的病理過程。其中軟骨破壞是OA發病的中心環節,主要由軟骨EMC降解與合成明顯失衡而引起[9],都涉及軟骨退行性變的發病機制[10-11]。

相關研究表明,OA血液中IL-1、IL-2、IL-6等炎癥因子表達明顯升高,也可干擾軟骨細胞的正常功能,與OA早期階段關節軟骨退行性病變密切相關,同時炎癥因子可以加快細胞外基質更新的速度,促進關節軟骨細胞退化和凋亡,在機體的多種免疫細胞分泌和誘導過程中發揮作用,參與免疫細胞的分化和增生,可導致體內慢性炎癥的長期存在,導致一系列代謝功能異常變化[13],其中IL-1在OA軟骨細胞炎癥反應及軟骨基質降解中起著核心作用[14]。TNF-α與OA病情程度密切相關,關節液中TNF-α的水平隨著 OA 嚴重程度的增加而升高[15-16]。TNF-α可誘導滑膜細胞合成和分泌前列腺素E2與膠原酶,參與炎癥反應,TNF-α在OA炎癥反應中還可介導白細胞的遷徙,其表達量可作為評估 OA 炎癥反應嚴重程度的可靠依據[17-18]。NO 是一種不穩定的氣態自由基,具有多種生理功能,同時也介導局部炎癥反應、組織損傷。其可傳遞神經信息,調節內皮細胞、平滑肌和神經等[19]。本研究結果可以看出,炎癥因子在發病和病情發展過程中起重要作用,其表達情況可作為評估病情嚴重程度的有效依據,并與病情程度呈正相關,部分作用機制是通過降低異常升高的炎癥因子的水平,減少機體炎癥因子的含量,減輕炎癥反應。

本研究組織病理學顯示骨關節炎正常軟骨細胞消失,纖維組織與巨噬細胞成分增加,關節周圍纖維組織成分增生,炎癥因子異常升高;治療組軟骨塌陷,關節軟骨層變薄,正常軟骨細胞消失,纖維組織與巨噬細胞成分增加,炎癥因子低于模型組,說明炎癥因子的變化與組織病理學成正相關。