CCL20/CCR6/Notch1信號通路影響卵巢癌CD44+/CD117+細胞亞群增殖能力和耐藥性的機制

計月敏,嚴 沁

(1.同濟大學附屬第一婦嬰保健院 放療科,上海201204;2.同濟大學附屬第一婦嬰保健院 婦科,上海201204)

卵巢癌在女性癌癥中死亡率排名第五位,超過半數的卵巢癌患者治療后復發并伴有遠處轉移[1-2]。化療是腫瘤治療中非常重要的一部分,無論術后輔助化療還是術前輔助化療,一些化療藥物在殺死腫瘤細胞的同時,還可能改變微環境,促進腫瘤細胞的轉移[3]。紫杉醇是一種用于卵巢癌的臨床化學治療藥物,CCL20是在紫杉醇刺激的經典活化的巨噬細胞(CAM)中上調以介導卵巢癌細胞遷移的關鍵細胞因子[4]。CCL20與趨化因子受體6(CCR6)結合激活卵巢癌細胞中上皮-間質轉化(EMT)以增強卵巢癌細胞的遷移[5- 6]。本文研究巨噬細胞和紫杉醇之間的串擾產生的促遷移作用,報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

小鼠抗人CD44抗體(Miltenyi Biotec公司,德國);小鼠抗人CD117抗體(Miltenyi Biotec公司,德國);流式細胞儀(Beckman Coulter公司,美國);小鼠抗人CCL20單克隆抗體(Abcam公司,英國);小鼠抗人CCR6單克隆抗體(Abcam公司,英國);小鼠抗Notch1單克隆抗體(Abcam公司,英國);小鼠抗人N-鈣黏蛋白單克隆抗體(Abcam公司,英國);小鼠抗人Snail單克隆抗體(Abcam公司,英國);小鼠抗人E-鈣黏蛋白單克隆抗體(Abcam公司,英國);TRIZOL試劑(Invitrogen公司,美國);PrimeScript RT試劑盒(Takara公司,日本);QuantStudioTM測試軟件(Thermo Scientific公司,美國);SYBR Green qPCR預混液(EZBioscience公司,美國);重組人CCL20蛋白(rhCCL20)(Abcam公司,英國);CCK-8試劑(Abcam公司,英國);酶標儀(Thermo Scientific公司);1%苯基甲磺酰基氟化物(上海碧云天公司);RIPA裂解緩沖液(上海碧云天公司);聚丙烯酰胺凝膠(上海碧云天公司);奧德賽成像系統(LI-COR公司,美國);Transwell板(8 μm;康寧公司,美國);Matrigel基質(BD公司,美國);IX71倒置顯微鏡(Olympus公司,日本);FACS染色緩沖液(上海碧云天公司);異硫氰酸熒光素膜聯蛋白V凋亡檢測試劑盒(BD公司,美國)。

1.2 研究對象

離體培養人EOC SKOV-3細胞系購自中國上海細胞研究所,保存在由RPMI 1640、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和10%胎牛血清組成的完全培養基中,每3天更換1次完整培養基。使用磁珠分選法(MACS)從SKOV3細胞株中分離出CD44+CD117+CSC。通過使用與磁性微珠偶聯的小鼠抗人CD44抗體分離CD44+亞群。然后通過使用與磁性微珠偶聯的小鼠抗人CD117抗體去除所得細胞的CD117亞型,所得的CD44+CD117+細胞標記為“EOC CD44+CD117+CSC”。根據制造商的說明,使用流式細胞儀(FCM,Beckman Coulter,美國)和抗人類/小鼠CD44 FITC和抗人類CD117 PE抗體(eBioscience,美國)進一步鑒定這些細胞。

1.3 實驗分組

培育的CD44+CD117+CSC隨機分為對照組和紫杉醇組,每組納入15個細胞培養皿。對照組：在具有CM或培養基的96孔板中培養卵巢癌細胞(4 000/孔),添加生理鹽水培養24 h;紫杉醇組：在具有CM或培養基的96孔板中培養卵巢癌細胞(4 000/孔),添加紫杉醇100 μg培養24 h。

1.4 方法

1.4.1蛋白質印跡法檢測CCL20、CCR6、Notch1以及間充質標記物N-鈣黏蛋白和Snail的表達 使用含有1%苯基甲磺酰基氟化物的RIPA裂解緩沖液從待測細胞中提取總蛋白。將含有等量蛋白質的提取物在10%或12%聚丙烯酰胺凝膠電泳,采用濕法將蛋白條帶電轉至Immun-blot PVDF膜上,加入濃度為50 g/L的脫脂奶粉在20 ℃的條件下封閉震蕩處理3 h,加入一抗(小鼠抗人CCL20單克隆抗體;小鼠抗人CCR6單克隆抗體;小鼠抗Notch1單克隆抗體;小鼠抗人N-鈣黏蛋白單克隆抗體;小鼠抗人Snail單克隆抗體;小鼠抗人E-鈣黏蛋白單克隆抗體),4℃孵育過夜,用TBS緩沖液(Tris 50 mmol/L,NaCl 100 mmol/L,pH7.5)沖洗3次,每次10 min。使用經過辣根酶標記的IgG(1∶1 000),在溫度為37℃的條件下孵育2 h,漂洗3次,每次10 min。使用ECL化學發光試劑盒進行顯影操作。

1.4.2細胞遷移實驗和細胞侵襲實驗 (1)細胞劃痕平面遷移實驗：細胞接種于玻片,常規培養后,無菌Eppendorf Tip 在玻片上劃出直徑為3 mm的直線劃痕。PBS緩沖液反復沖洗刮下的細胞,玻片于培養箱孵育24 h。隨機選取5個高倍視野,評估細胞的遷移活性。(2)細胞侵襲實驗：將30 μL Matrigel基質(用無血清培養基按1∶5預先稀釋)(BD公司,美國)放入transwell板的上腔中,并添加卵巢癌細胞(200 μL,4×104細胞/孔)2 h后。將700 μL補充有10%FBS的相應培養基添加到下部腔室。在37℃下孵育24 h或48 h后,小心除去上腔室中的細胞。將遷移的細胞用4%多聚甲醛固定,用0.1%結晶紫染色,并使用IX71倒置顯微鏡以×200放大倍數進行定量。

1.4.3流式細胞儀分析 CD44+CD117+CSC細胞在FACS染色緩沖液中重懸,繼而進行固定和通透性處理,在洗滌緩沖液中洗滌2次,與FITC標記的CD68抗體孵育30 min,再次洗滌后重懸于FACS緩沖液,使用異硫氰酸熒光素膜聯蛋白V凋亡檢測試劑盒評估卵巢癌細胞的凋亡。

1.4.4細胞集落形成實驗 收集生長狀態良好的細胞,按每孔200個細胞接種于6孔板中;細胞培養箱中培養2周,培養板中有細胞集落時停止培養;4%多聚甲醛固定20 min;0.1%結晶紫水染色10 min;PBS洗去非細胞染色,晾干后10倍物鏡下拍照。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 紫杉醇誘導CD44+CD117+CSCs分泌的CCL20激活CCR6- Notch1軸

與對照組相比,紫杉醇組CD44+CD117+CSCs細胞中CCL20、CCR6和Notch1上調,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1、表1。

圖1 紫杉醇誘導CD44+ CD117+ CSCs分泌的CCL20激活CCR6- Notch1軸

表1 紫杉醇誘導CD44+ CD117+ CSCs分泌的CCL20激活CCR6- Notch1軸

2.2 紫杉醇促進CD44+CD117+CSCs細胞的EMT水平

與對照組相比,紫杉醇組CD44+CD117+CSCs細胞中的間充質標記物N-鈣黏蛋白和Snail蛋白上調,差異有統計學意義(P<0.05),上皮標記物E-鈣黏蛋白下調,差異有統計學意義(P<0.05),見圖2、表2。

圖2 紫杉醇促進CD44+ CD117+ CSCs細胞的EMT水平

表2 紫杉醇促進CD44+ CD117+ CSCs細胞的EMT水平

2.3 紫杉醇刺激的CD44+CD117+CSCs卵巢癌細胞遷移侵襲能力上調

與對照組相比,紫杉醇組CD44+CD117+CSCs細胞中的遷移侵襲能力上調,差異有統計學意義(P<0.05),見圖3、圖4、表3、表4。

圖3 紫杉醇刺激的CD44+ CD117+ CSCs卵巢癌細胞遷移能力上調

圖4 紫杉醇刺激的CD44+ CD117+ CSCs卵巢癌細胞的侵襲能力上調

表3 紫杉醇刺激的CD44+ CD117+ CSCs卵巢癌細胞劃痕愈合率(n=15)

表4 紫杉醇刺激的CD44+ CD117+ CSCs卵巢癌細胞的侵襲細胞數

2.4 紫杉醇刺激的CD44+CD117+CSCs卵巢癌細胞凋亡水平下調

與對照組相比,紫杉醇組CD44+CD117+CSCs細胞中的凋亡水平下調,差異有統計學意義(P<0.05),見圖5、表5。

圖5 紫杉醇刺激的CD44+ CD117+ CSCs卵巢癌細胞細胞凋亡水平下調

表5 紫杉醇刺激的CD44+ CD117+ CSCs卵巢癌細胞凋亡水平

2.5 紫杉醇刺激的CD44+CD117+CSCs卵巢癌細胞集落形成數目上調

與對照組相比,紫杉醇處理CD44+CD117+CSCs細胞中的細胞集落形成數目水平上調,差異有統計學意義(P<0.05),見圖6、表6。

圖6 紫杉醇刺激的CD44+ CD117+ CSCs卵巢癌細胞集落形成數目上調

表6 紫杉醇刺激的CD44+ CD117+ CSCs卵巢癌細胞集落形成數目

3 討論

研究發現,常用的化療藥物紫杉醇和多柔比星可促進腫瘤釋放外泌體,改變肺部的微環境,促進乳腺癌肺轉移[3]。紫杉醇治療縮小乳腺癌模型小鼠原發腫瘤,同時增加腫瘤肺轉移,增大轉移瘤的大小[7]。最新的研究發現,化學療法編程的CAM可發揮促腫瘤作用,改變癌細胞的行為或活性,使其更具致癌性和轉移性;同時其抑制細胞毒性CD8+T細胞,導致腫瘤部位血運重建和淋巴生成[7- 8]。

CCL20是在紫杉醇刺激下上調的細胞因子,調節細胞的激活、趨化和遷移,參與形態發生、組織穩態、固有和獲得性免疫以及許多疾病的炎癥病理過程[9-10]。CCL20與趨化因子受體6(CCR6)特異性結合,可引起白細胞的遷移,介導炎癥反應的發生[11- 12]。

趨化因子通過廣泛的蛋白質-蛋白質界面與其G蛋白偶聯受體(GPCR)結合,該界面包括細胞外表面的結構域和N端跨膜結構域內的深袋(正構位點)。天然趨化因子屬于A類GPCR激動劑,可引起細胞內應答,包括通過異源三聚體G蛋白的激活和β-抑制素介導的信號轉導途徑進行定向細胞遷移。CCR6是七跨膜結構域GPCR,可與其唯一的配體CCL20結合,并以相同的方式使活化淋巴細胞遷移到炎癥部位。這些趨化因子可作為小分子GPCR拮抗劑的替代品,通過改變趨化因子的低聚狀態來改變其信號轉導特性。腫瘤細胞分泌的CCL20強烈影響免疫抑制性調節性Treg細胞和TH17種群的頻率[13-14]。因此,CCR6激活支配了Notch通路,介導了CCL20的轉錄,從而導致腫瘤的發生[15]。研究發現,若下調CCR6可減少免疫缺陷小鼠模型中的轉移,而CTCL細胞顯示IL-22上調,這與CCL20的刺激性增強及其與CCR6的結合有關,從而增強了它們的多向遷移潛力[16-18]。因此,CCR6/CCL20軸通過自分泌或旁分泌機制參與癌細胞的增殖和遷移。

本研究證明,CCL20是在紫杉醇刺激的CAMs中上調的關鍵因素。此外,在紫杉醇刺激的CAM上阻斷CCL20則有效地消除了由紫杉醇驅動的卵巢癌遷移,這表明CCL20是紫杉醇介導卵巢癌細胞遷移的關鍵因素。CCL20募集Treg,Th17和Th22細胞來維持炎癥和免疫抑制的微環境,從而間接促進癌癥的進展[19-20]。此外,CCL20可直接介導各種腫瘤細胞的遷移。CAM是活化巨噬細胞的一種形式,其特點在于增加IL-1β表達。IL-1β通過激活MAPK和PI3K信號通路來刺激腫瘤細胞中CCL20的產生,并通過NF-κB的活化來促進胰腺β細胞中CCL20的分泌。因此,IL-1β促進CCL20表達可能解釋了紫杉醇對CAM的特異性作用。本研究發現,紫杉醇可促進腫瘤細胞中CCL20的表達,這表明CCL20的表達增加可能是活化巨噬細胞的影響因素。本研究的局限性在于沒有干預信號通路中的關鍵基因的表達,該部分的研究將在后繼實驗中進一步完善。

綜上所述,紫杉醇和CAM之間的串擾驅動的促遷移活性,CCL20-CCR6軸可能是減少化療引起的晚期卵巢癌轉移的潛在治療靶標。