阻斷PD-L1和MEK對(duì)非小細(xì)胞肺癌多細(xì)胞球體模型的治療作用

林吉興 云天洋 申磊磊 陳瑞驥 王柏霖 王鈺琦

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占所有肺癌的85%,多數(shù)患者被確診時(shí)已屬晚期;即使接受了根治性手術(shù)的患者,也很可能在幾年內(nèi)復(fù)發(fā)并全身轉(zhuǎn)移[1]。過(guò)去的20年中,化療一直是無(wú)基因突變的NSCLC患者唯一的治療方法[2]。近年來(lái),隨著對(duì)免疫系統(tǒng)與腫瘤細(xì)胞相互作用的進(jìn)一步認(rèn)識(shí),免疫制劑抗細(xì)胞程序性死亡-配體1(programmed cell death ligand-1,PD-L1)抗體藥物的療效已在多個(gè)不同的惡性腫瘤中得到證明[3]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路,可將多種增殖和分化的信號(hào)傳遞到細(xì)胞外環(huán)境,研究顯示,腫瘤細(xì)胞中的MAPK活性增強(qiáng)可通過(guò)miR-675-5p上調(diào)PD-L1表達(dá),而該通路的抑制可以通過(guò)抑制絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1,MEK1)和MEK2獲得[4-5]。本研究基于上述理論基礎(chǔ),探討抗PD-L1抗體阿特珠單抗(Atezolizumab)和MEK抑制劑司美替尼(Selumetinib)在NSCLC多細(xì)胞球體(multicellular spheroid,MTS)模型中的抗腫瘤作用。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

收集2019年1月～2020年1月在我院接受手術(shù)的NSCLC患者的腫瘤樣本,納入標(biāo)準(zhǔn):①有明確的NSCLC病理學(xué)診斷。②手術(shù)前未經(jīng)過(guò)放療、化療及其它免疫靶向治療。③通過(guò)酶消化法進(jìn)行處理,獲得體外MTS模型原代細(xì)胞培養(yǎng)。本研究方案經(jīng)醫(yī)院機(jī)構(gòu)評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn)(S2022-40);患者均于術(shù)前簽署書面知情同意書。

實(shí)驗(yàn)材料:10%優(yōu)級(jí)胎牛血清(GIBCO),司美替尼(AZD6244)和阿特珠單抗(MPDL3280A)均來(lái)自Med Chem Express,MEK、MAPK和PD-L1初級(jí)抗體(武漢普諾賽),山羊抗兔IgG、兔抗小鼠IgG和單克隆抗β肌動(dòng)蛋白抗體(武漢艾美捷)。

二、檢測(cè)指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)方法

1 定量實(shí)時(shí)PCR

使用Trizol試劑(Life Technologies)提取總RNA。按照制造商說(shuō)明使用SensiFAST(Bioline)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)將1μg分離的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。采用定量實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)方法分析PD-L1、IFN-γ、IL-12、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、TIM-3、CTLA-4、LAG-3基因的表達(dá)水平。利用PRIMER EXPRESS軟件(Applied Biosystems),所用引物(見表1)。使用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)進(jìn)行擴(kuò)增。熱循環(huán)條件為50℃升溫2 min(S1),95℃變性10 min(S2),然后在95℃升溫15s,60℃升溫1 min循環(huán)40次(S3)。所有樣本一式兩份,使用QuantStudio 7 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行,基因的相對(duì)表達(dá)量歸一至18S,作為內(nèi)控基因;用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)值。通過(guò)解離曲線分析和使用非模板對(duì)照排除引物二聚體引起的非特異性信號(hào)。

表1 引物序列

2 蛋白質(zhì)印跡分析

溶出物在RIPA緩沖液[0.1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS),0.5%脫氧膽酸鈉,1%NP-40裂解液,100mmol/L NaCl,10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(TRIS HYDROCHLORIDE,Tris-HCl)(pH=7.4),0.5 mmol/L二硫三醇,0.5%苯甲基磺酰氟,蛋白酶抑制劑(Hoffmann-La Roche)]中均勻化,離心15000 rpm/4℃,用Bio-Rad法測(cè)定蛋白質(zhì)樣品,用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑ECL+檢測(cè)免疫復(fù)合物。每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式三份。

3 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞儀表面染色,用染色緩沖液(staining buffer,SB)(2%FBS;0.1%硝基苯甲酸鈉)洗滌細(xì)胞,用20%SB+Ab血清阻斷10 min后,用小鼠單克隆抗體染色30 min。所用抗體為:抗MEK、MAPK和PD-L1(Miltenyi Biotec)。染色細(xì)胞洗滌2次,再懸浮于SB中,然后在FACS ACCURI C6(BD Biosciences)上獲得。使用Accuri C6軟件(BD Biosciences)進(jìn)行分析。用佛波醇-12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA,10 ng/mL)、放線菌素(500 ng/mL)和Brefeldin A(BFA 10 μg/mL)刺激6 h后,進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生分析,用小鼠單克隆抗體IFNG(Miltenyi Biotech)培育T細(xì)胞。

4 NSCLC MTS模型的制備

根據(jù)以往研究中NSCLC MTS模型的培養(yǎng)方案[6],將所有新鮮的腫瘤組織樣品保存在冰上,并在收集當(dāng)天在無(wú)菌條件下進(jìn)行處理。將組織碎片按DeRose所述[7]在37°C搖瓶中以低速至中速(200r/min)消化,培養(yǎng)12h～18h后通過(guò)連續(xù)離心分離細(xì)胞。將細(xì)胞接種在基質(zhì)凝膠中以保留三維結(jié)構(gòu)。

5 細(xì)胞生存能力分析

細(xì)胞活力采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)法測(cè)定,按照Morgillo所述進(jìn)行MTS培養(yǎng)[8],MTT染色后用PBS-EDTA冷溶液從基質(zhì)中提取細(xì)胞,根據(jù)說(shuō)明進(jìn)行裂解。通過(guò)劑量-響應(yīng)曲線插值確定IC50,每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)四次,使用三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的中位數(shù)作為結(jié)果,使用ComboSyn軟件計(jì)算協(xié)同作用。

三、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、MTS模型中的培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)共成功建立7個(gè)三維培養(yǎng)基,成功率為63.6%(7/11),患者特征及三維培養(yǎng)建立率(見表2),在基質(zhì)凝膠中接種一周后,最小直徑90μm,在接下來(lái)的兩周內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng),以便進(jìn)行藥物測(cè)試。通過(guò)使用三種不同的過(guò)濾器(S1>100μm;S2 30～100μm;S3<30μm)過(guò)濾分離細(xì)胞,其中S3過(guò)濾球體的尺寸為最佳,將這一部分用于后續(xù)研究(見圖1)。

表2 患者特征及三維培養(yǎng)建立率[n(%)]

圖1 每次離心(S1、S2、S3)獲得球體模型的代表性圖像

二、MTS模型MEK、MAPK和PD-L1表達(dá)

對(duì)7個(gè)MTS模型進(jìn)行MEK、MAPK和PD-L1的蛋白質(zhì)印跡分析顯示,所有MTS模型MEK、MAPK和PD-L1均呈高表達(dá)水平(見圖2)。

圖2 MTS模型進(jìn)行PD-L1、MEK和MAPK的蛋白質(zhì)印跡分析,β-肌動(dòng)蛋白作為對(duì)照

三、MTS模型對(duì)阻斷PD-L1和MEK的反應(yīng)

將7種MTS模型分為空白組、阿特珠單抗組、司美替尼組和阿特珠單抗+司美替尼聯(lián)合應(yīng)用組,結(jié)果阿特珠單抗組和司美替尼組產(chǎn)生中度抗增殖作用,司美替尼組組細(xì)胞死亡的中位數(shù)約為25%,阿特珠單抗組細(xì)胞死亡的中位數(shù)約為30%,聯(lián)合應(yīng)用組表現(xiàn)出高度抗增殖效果,細(xì)胞死亡的中位數(shù)約為45%(見圖3)。

四、阻斷PD-L1和MAPK MTS模型細(xì)胞因子表達(dá)

通過(guò)RT-PCR處理后,聯(lián)合組IFN-γ、IL-12和IL-6的表達(dá)顯著增加(P<0.05),IL-10、IL-1β和TNF-α無(wú)明顯變化(P>0.05),司美替尼和阿特珠單抗組所有細(xì)胞因子均無(wú)明顯升高(P>0.05)(見圖4)。

圖3 MTS模型對(duì)阻斷PD-L1和MEK的反應(yīng)

圖4 阻斷PD-L1和MAPK MTS模型細(xì)胞因子表達(dá)注:與未處理組比較,**P<0.01;***P<0.001

圖5 阻斷PD-L1和MAPKMTS模型免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)注:與未處理組比較,**P<0.01;***P<0.001

五、阻斷PD-L1和MEK的MTS模型免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)

RT-PCR處理后,聯(lián)合組PD-L1和CTLA-4表達(dá)顯著減少(P<0.05),TIM-3和LAG-3無(wú)明顯變化(P>0.05),司美替尼和阿特珠單抗組PD-L1表達(dá)顯著減少(P<0.05),CTLA-4、TIM-3和LAG-3表達(dá)均無(wú)明顯下降(P>0.05)(見圖5)。

討 論

針對(duì)PD-L1的免疫抑制劑改善了NSCLC患者的生存率,然而PD-L1表達(dá)和治療獲益之間的差異也經(jīng)常出現(xiàn)。有研究表明,肺腺癌細(xì)胞中生長(zhǎng)因子依賴的MAPK信號(hào)在IFN-γ誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)中起重要作用,MEK1/2抑制劑可降低IFN-γ誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá),增加肺腺癌細(xì)胞的免疫原性[6-7]。多項(xiàng)針對(duì)不同惡性腫瘤的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,抑制MEK可通過(guò)防止T細(xì)胞凋亡,降低骨髓抑制細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平來(lái)增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng),當(dāng)與PD-L1/PD-1阻斷治療結(jié)合時(shí),可造成持續(xù)性的腫瘤抑制[8-9]。

在抗PD-L1藥物中,阿特珠單抗是一種工程化IgG抗體,其修飾的FC結(jié)構(gòu)域可防止抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性,已被FDA批準(zhǔn)用于NSCLC的二線治療[10]。有研究顯示[11],阿特珠單抗相比多西他賽化療延長(zhǎng)了治療組和PD-L1陽(yáng)性患者的生存率,說(shuō)明無(wú)論P(yáng)D-L1表達(dá)如何,阿特珠單抗均能顯示出一定的臨床療效。MAPK通路是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路,能夠?qū)⑸砩隙嘀卦鲋澈头只男盘?hào)傳遞至細(xì)胞外環(huán)境。在腫瘤疾病中MAPK常會(huì)上調(diào),導(dǎo)致不受控制的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成。臨床前模型表明,靶向MAPK途徑能在更廣泛的程度上影響腫瘤生長(zhǎng)。抑制MEK1和MEK2可抑制MAPK通路[12],司美替尼是一種強(qiáng)效和高選擇性的MEK抑制劑,目前與BRAF抑制劑威羅菲尼聯(lián)合應(yīng)用于晚期BRAF突變的黑色素瘤患者[13]。此外,MAPK與免疫抵抗有關(guān),抑制MEK可通過(guò)向腫瘤部位召集免疫細(xì)胞來(lái)轉(zhuǎn)化其它耐藥腫瘤[14]。

本研究使用體外多細(xì)胞培養(yǎng)物證明MEK抑制劑和抗PD-L1藥物在NSCLC細(xì)胞死亡方面具有顯著的協(xié)同作用。這種協(xié)同作用是MEK抑制劑對(duì)癌細(xì)胞的直接作用的結(jié)果,以及所有能夠維持免疫反應(yīng)和炎癥微環(huán)境的細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用。有研究證明[15-16],在KRAS突變細(xì)胞中PD-L1上升,但對(duì)造成這種情況的下游途徑?jīng)]有完全闡明。Gao等[17]通過(guò)ERK信號(hào)證實(shí)KRAS突變背景下PD-L1的上調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn),STAT 3參與了RAS/MEK引起的PD-L1轉(zhuǎn)錄調(diào)控,為MEK抑制劑和抗PD-L1抑制劑的結(jié)合提供了另一個(gè)機(jī)制[18]。Liu等[19]研究顯示,在KRAS突變的NSCLC中,在蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄譜方面存在不同的亞組,包括對(duì)抗PD-1/PD-L1免疫治療耐藥的KRAS/LKB1突變患者,免疫和炎癥標(biāo)志物表達(dá)低的KRAS/LKB突變患者,以及對(duì)單一免疫治療更敏感的KRAS/TP53突變患者。我們推測(cè),在抗PD-1/PD-L1的基礎(chǔ)上加入MEK抑制劑對(duì)KRAS突變的患者也有幫助,也可以提高他們對(duì)免疫治療的敏感性。

使用患者特異性衍生MTS模型可以研究腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞之間的相互作用,識(shí)別概括人類白細(xì)胞抗原和T細(xì)胞受體的特異性[20],此外,通過(guò)類器官模型可對(duì)不同細(xì)胞成分的蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)進(jìn)行研究,鑒定參與治療敏感性或抗性的分子途徑[21]。本研究證實(shí),體外腫瘤類器官培養(yǎng)物可用于建立個(gè)體化模型以評(píng)估MEK抑制劑和抗PD-L1抗體治療的效果,說(shuō)明MTS是一個(gè)可重復(fù)、簡(jiǎn)單和廉價(jià)的模型,可以復(fù)制和預(yù)測(cè)體內(nèi)臨床數(shù)據(jù),用于在臨床前環(huán)境中測(cè)試任何免疫治療藥物的效果。MEK抑制劑和抗PD-L1抗體在全球范圍內(nèi)廣泛用于惡性腫瘤的治療,本研究為今后相似的聯(lián)合實(shí)驗(yàn)提供了思路和理論依據(jù)。

綜上所述,腫瘤的免疫治療需要新的組合策略來(lái)預(yù)防和克服對(duì)單一療法的耐藥性,并尋找能夠預(yù)測(cè)其敏感性的腫瘤標(biāo)記物。本研究確定了抗PD-L1抗體與MEK抑制劑聯(lián)合應(yīng)用的基本原理,在NSCLC的MTS模型中,雙重阻斷MEK與PD-L1具有優(yōu)于單一抑制的療效。