miR-526b-3p調控TROAP基因介導Wnt信號通路對非小細胞肺癌細胞增殖與侵襲遷移的影響

鄧科蘭 劉桂霞

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者目前預后并不理想,探究其發生機制具有積極臨床意義[1-2]。miR-526b-3p介導膠質瘤、NSCLC等多種癌細胞生物學行為[3],可抑制肝癌和NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲[4-5]。滋養素相關蛋白(trophinin-associated protein,TROAP)具有致癌作用,抑制其表達可減弱腎透明細胞癌和NSCLC細胞的存活、遷移和侵襲潛能[6-7]。Wnt信號在NSCLC發生發展過程中發揮著重要作用,抑制其激活可顯著抑制上皮間質轉化,誘導NSCLC細胞凋亡[8-9]。TROAP可通過激活Wnt/β-Catenin通路促進膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲[10]。查詢TargetScanHuman 7.2數據庫發現miR-526b-3p與TROAP間有結合位點,因此推測miR-526b-3p可能通過調控TROAP基因介導Wnt信號,進而影響NSCLC細胞的增殖與侵襲遷移過程。本文以miR-526b-3p模擬物干預處理體外培養的NSCLC細胞系A549,對以上推測進行驗證研討。

資料與方法

一、主要試劑與儀器

A549細胞(CL-0016)、人Ⅱ型肺泡上皮細胞(CP-H209)、NCI-H1299細胞(CL-0165)、HCC827細胞(CL-0094)、特級胎牛血清(164210-500)、人Ⅱ型肺泡上皮細胞完全培養基(CM-H209)、含EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液(PB180225)、RPMI-1640培養基(PM150110)、Ham′s F-12K培養基(PM150910)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;青霉素-鏈霉素雙抗溶液(YC-5008)、Opti-MEM I培養基(YC-3039A),購自上海語純生物科技有限公司;實驗所用miR-526b-3p模擬物、各種質粒及各基因引物購自上海吉瑪制藥技術有限公司;ANNEXIN V- FITC/PI凋亡檢測試劑盒(CA1020)、EdU細胞增殖檢測試劑盒(CA1170)、總RNA提取試劑盒(R1200)、Hoechst 33258染色液(10 μg/mL,C0020)、一步法實時熒光定量PCR試劑盒(T2210)、基底膠(356234)、LipofectamineTM2000(11668)、結晶紫染色液(G1062)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(D0010),購自北京索萊寶科技有限公司;兔抗人Anti-Cyclin D1一抗(ab134175)、兔抗人Anti-Bax一抗(ab182733)、兔抗人Anti-Caspase-3一抗(ab184787)、兔抗人Anti-Vimentin一抗(ab92547)、兔抗人Anti-β-actin一抗(ab8227),購自美國Abcam公司;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗(貨號A0208)、兔抗人Anti-E-cadherin一抗(AF6759)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG二抗(貨號A0216)、兔抗人Anti-β-tubulin一抗(AF1216)、兔抗人Anti-Wnt一抗(AF8349),購自上海碧云天生物技術有限公司;小鼠抗人Anti-TROAP一抗(H00010024-A01),購自艾美捷科技有限公司等。

超微量分光光度計(型號NanoDrop 2000)購自美國Thermo Fisher Scientific公司;生物顯微鏡(型號LW200)購自上海尖端光電科技有限公司;倒置熒光顯微鏡(型號NIB900-FL)購自上海悌可光電科技有限公司;熒光定量PCR儀(型號C1000)購自美國Bio-Rad公司等。

二、 檢測人肺泡上皮細胞及NSCLC細胞系A549、HCC827、NCI-H1299中miR-526b-3p及TROAP、Wnt基因的表達水平

于39.6℃水浴中快速解凍人肺泡上皮細胞及NSCLC細胞系A549、HCC827、NCI-H1299,離心洗滌細胞沉淀后,人肺泡上皮細胞以其購買的完全培養基重懸混勻,HCC827、NCI-H1299細胞以含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素溶液的RPMI-1640培養基重懸混勻,A549細胞以含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素溶液的Ham′s F-12K培養基重懸混勻,所有細胞均放入37.5℃,5%CO2培養箱中無菌培養,等細胞融合度達到約80%時傳代培養。

收集傳代的人肺泡上皮細胞及NSCLC細胞系A549、HCC827、NCI-H1299細胞沉淀,采用總RNA提取試劑盒并遵照其說明指導提取各細胞中的總RNA,經超微量分光光度計測出其濃度后,采用一步法實時熒光定量試劑盒并遵照其說明指導做PCR擴增,反應后所得數據采用2-ΔΔCt分析計算,miR-526b-3p以U6做內參,TROAP、Wnt基因以GAPDH做內參,最終得出各基因相對表達,各基因引物序列如下:GAPDH上游引物:5′-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3′,下游引物:5′-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3′;TROAP上游引物:5′-GGCAGGCCTCAGCAATCTG-3′,下游引物:5′-GGCATCCTGCCATTCGAGTA-3′;miR-526b-3p上游引物:5′-CTCTTGAGGGAAGCACT-3′,下游引物:5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGAC-3′,下游引物:5′-AACGCTTACGAATTT-3′;Wnt上游引物:5′-CATCTTCGCAATCACCTCCG-3′,下游引物:5′-GTGGCATTTGCACTCTTGG-3′。

E-cadherin上游引物:5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′,下游引物:5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′;Vimentin上游引物:5′-GACGCCATCAACACCGAGTT-3′,下游引物:5′-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3′;Bax上游引物:5′-AGGATGCGTCCACCAAGAAGCT-3′,下游引物:5′-TCCGTGTCCACGTCAGCAATCA-3′;Caspase-3上游引物:5′-GGAGTCTGACTGGAAAGCCGAA-3′,下游引物:5′-CTTCTGGCAAGCCATCTCCTCA-3′;Cyclin D1上游引物:5′-TCTACACCGACAACTCCATCCG-3′,下游引物:5′-TCTGGCATTTTGGAGAGGAAGTG-3′。

三、細胞處理及增殖、凋亡檢測

取傳代A549細胞,接種在一個無菌的24孔板中,隨機分為對照組、miR-526b-3p mimic組、miR-526b-3p mimic陰性對照組、miR-526b-3p mimic+TROAP過表達組、miR-526b-3p mimic+Wnt過表達組,采用LipofectamineTM2000并遵照其說明指導對細胞進行轉染,miR-526b-3p mimic組、miR-526b-3p mimic陰性對照組細胞分別轉染miR-526b-3p mimic及其陰性對照,miR-526b-3p mimic+TROAP過表達組細胞轉染miR-526b-3p mimic和TROAP過表達質粒,miR-526b-3p mimic+Wnt過表達組細胞轉染miR-526b-3p mimic和Wnt過表達質粒,24 h后加入Edu染液孵育后固定細胞,具體步驟遵照Edu細胞增殖檢測試劑盒說明指導進行,在熒光顯微鏡下觀察細胞形態,以Edu陽性率=Edu陽性細胞數/總細胞數×100%反映各組A549細胞增殖情況。

取傳代A549細胞,接種在一個無菌的24孔板中,以上述同樣的方法分組并進行轉染24 h后,洗滌、固定細胞,以10 μg/mL的Hoechst 33258染色液孵育后,在熒光顯微鏡下觀察細胞形態,以此判斷各組A549細胞凋亡情況;取傳代A549細胞,接種在一個無菌的24孔板中,以上述同樣的方法分組并進行轉染24 h后,收集各組細胞并洗滌、計數,每組取約2×105個細胞采用ANNEXIN V- FITC/PI凋亡檢測試劑盒按照其說明指導孵育FITC、PI后,上機檢測其凋亡率。

四、檢測細胞遷移侵襲情況

細胞劃痕實驗:取傳代A549細胞,接種在一個無菌的6孔板中,每孔約2×105個細胞,以標題三中方法分組并進行轉染后24 h,以200 μL槍頭在每孔底部劃痕,以PBS清洗掉劃痕中的細胞,在顯微鏡下觀察測量此時劃痕寬度,記為A,細胞繼續培養24 h后再次在顯微鏡下觀察測量此時劃痕寬度,記為B,細胞遷移率(%)=(A-B)/A×100%。

Transwell小室侵襲實驗:取傳代A549細胞,以無血清的Ham′s F-12K培養基重懸后接種在經基質膠包被后的Transwell上室中,每孔約2×105個細胞,以標題三中方法分組并進行轉染后24 h,在Transwell下室中加入含血清的Ham′s F-12K培養基,細胞繼續培養24 h后擦掉上室細胞,以結晶紫染色液孵育下室細胞,然后洗滌、固定,在顯微鏡下觀察計數著色細胞,即為細胞侵襲數。

五、檢測細胞增殖相關基因(Cyclin D1)、凋亡相關基因(Bax、Caspase-3)、上皮間質轉化相關基因(E-cadherin、Vimentin)、TROAP基因、Wnt基因及miR-526b-3p表達

取傳代A549細胞,接種在一個無菌的24孔板中,培養24 h后以標題三中方法分組并進行轉染后,繼續培養24 h后收集各組細胞,以標題二中實時熒光PCR實驗方法,檢測其中Cyclin D1、Bax、Caspase-3、E-cadherin、Vimentin、TROAP、Wnt mRNA及miR-526b-3p表達。

六、檢測細胞TROAP、Wnt、增殖、凋亡及上皮間質轉化相關蛋白表達

取傳代A549細胞,接種在一個無菌的24孔板中,培養24 h后以標題三中方法分組并進行轉染后,繼續培養24 h后收集各組細胞,提取出其中總蛋白并測出其濃度后每組取30μg總蛋白,經變性、電泳分析、濕轉轉膜后,將TROAP、Wnt、Cyclin D1、Bax、Caspase-3、E-cadherin、Vimentin、β-tubulin、β-actin蛋白自膜上剪下后,孵育相應一抗和二抗進行抗原抗體反應,化學發光法顯色后采集各組蛋白圖像,使用Image J軟件分析量化其相對表達。

七、檢測A549細胞中miR-526b-3p對TROAP的靶向調控

將處于對數生長期的A549細胞接種在一個無菌的24孔板中,放入37.5℃,5%CO2培養箱中無菌培養12 h,然后隨機分為TROAP無義序列+miR-526b-3p mimic組、TROAP無義序列+miR-526b-3p mimic陰性對照組、野生型TROAP+miR-526b-3p mimic組、野生型TROAP+miR-526b-3p mimic陰性對照組、突變型TROAP+miR-526b-3p mimic組、突變型TROAP+miR-526b-3p mimic陰性對照組,各組細胞以LipofectamineTM2000按照標題三中方法進行轉染:TROAP無義序列+miR-526b-3p mimic組細胞轉染TROAP 3′-UTR無義序列+miR-526b-3p mimic,TROAP無義序列+miR-526b-3p mimic陰性對照組細胞轉染TROAP 3′-UTR無義序列+miR-526b-3p mimic陰性對照,野生型TROAP+miR-526b-3p mimic組細胞轉染野生型TROAP 3′-UTR報告質粒+miR-526b-3p mimic,野生型TROAP+miR-526b-3p mimic陰性對照組細胞轉染野生型TROAP 3′-UTR報告質粒+miR-526b-3p mimic陰性對照,突變型TROAP+miR-526b-3p mimic組細胞轉染突變型TROAP 3′-UTR報告質粒+miR-526b-3p mimic,突變型TROAP+miR-526b-3p mimic陰性對照組細胞轉染突變型TROAP 3′-UTR報告質粒+miR-526b-3p mimic陰性對照,24 h后將各組細胞消化后收集沉淀,以雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒并參照其說明書指導步驟,檢測各組細胞的雙熒光素酶相對活性。

八、統計學分析

結 果

一、人肺泡上皮細胞與人非小細胞肺癌細胞系A549、HCC827、NCI-H1299中miR-526b-3p及TROAP、Wnt mRNA的表達

與人肺泡上皮細胞相比,人非小細胞肺癌細胞系A549、HCC827、NCI-H1299中miR-526b-3p表達水平顯著降低(P<0.05),TROAP、Wnt mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)(見表1)。

表1 各種細胞中miR-526b-3p及TROAP、Wnt mRNA的相對表達

二、各組A549細胞增殖、凋亡情況檢測結果

與對照組相比,miR-526b-3p mimic組細胞核大小不一且產生固縮,并被染為較強的藍色,呈現凋亡損傷狀態,Edu陽性率顯著降低(P<0.05),凋亡率顯著升高(P<0.05);miR-526b-3p mimic陰性對照組細胞與對照組相似,細胞核較大且形態圓潤,并被染為微弱的藍色,Edu陽性率、凋亡率無明顯差異(P>0.05)。與miR-526b-3p mimic組相比,miR-526b-3p mimic+TROAP過表達組和miR-526b-3p mimic+Wnt過表達組細胞核均變大變圓,藍色變淺,凋亡損傷得到明顯改善,Edu陽性率均顯著升高(P<0.05),凋亡率顯著降低(P<0.05)(見圖1,2,3,表2)。

圖1 Edu染色檢測A549細胞增殖(×200)

圖2 Hoechst 33258染色檢測A549細胞凋亡形態(×200)

圖3 流式細胞實驗檢測A549細胞凋亡注:Annexin V-FITC為熒光素異硫氰酸酯標記的膜聯蛋白V;PI為碘化丙啶

表2 各組A549細胞Edu陽性率、凋亡率

三、各組A549細胞遷移侵襲情況檢測結果

與對照組相比,miR-526b-3p mimic組細胞遷移率、侵襲數顯著降低(P<0.05);miR-526b-3p mimic陰性對照組細胞遷移率、侵襲數無明顯差異(P>0.05)。與miR-526b-3p mimic組相比,miR-526b-3p mimic+TROAP過表達組和miR-526b-3p mimic+Wnt過表達組細胞遷移率、侵襲數均顯著升高(P<0.05)(見圖4,5,表3)。

圖4 細胞劃痕實驗檢測各組A549細胞遷移情況(×200)

圖5 Transwell侵襲實驗檢測各組A549細胞侵襲情況(結晶紫染色,×200)

表3 各組A549細胞遷移率、侵襲數

四、各組A549細胞增殖、凋亡及EMT相關基因表達檢測結果

與對照組相比,miR-526b-3p mimic組細胞Cyclin D1、Vimentin mRNA表達顯著降低(P<0.05),Bax、Caspase-3、E-cadherin mRNA表達顯著升高(P<0.05);miR-526b-3p mimic陰性對照組細胞Cyclin D1、Vimentin、Bax、Caspase-3、E-cadherin mRNA表達無明顯差異(P>0.05)。與miR-526b-3p mimic組相比,miR-526b-3p mimic+TROAP過表達組和miR-526b-3p mimic+Wnt過表達組細胞Cyclin D1、Vimentin mRNA表達均顯著升高(P<0.05),Bax、Caspase-3、E-cadherin mRNA表達均顯著降低(P<0.05)(見表4)。

表4 各組A549細胞增殖、凋亡及EMT相關基因相對表達

五、各組A549細胞增殖、凋亡及EMT相關蛋白表達檢測結果

與對照組相比,miR-526b-3p mimic組細胞Cyclin D1、Vimentin蛋白表達顯著降低(P<0.05),Bax、Caspase-3、E-cadherin蛋白表達顯著升高(P<0.05);miR-526b-3p mimic陰性對照組細胞Cyclin D1、Vimentin、Bax、Caspase-3、E-cadherin蛋白表達無明顯差異(P>0.05)。與miR-526b-3p mimic組相比,miR-526b-3p mimic+TROAP過表達組和miR-526b-3p mimic+Wnt過表達組細胞Cyclin D1、Vimentin蛋白表達均顯著升高(P<0.05),Bax、Caspase-3、E-cadherin蛋白表達均顯著降低(P<0.05)(見圖6,表5)。

六、各組細胞中miR-526b-3p及TROAP、Wnt mRNA及蛋白表達檢測結果

與對照組相比,miR-526b-3p mimic組細胞miR-526b-3p表達水平顯著升高(P<0.05),TROAP、Wnt mRNA表達水平顯著降低(P<0.05);miR-526b-3p mimic陰性對照組細胞miR-526b-3p及TROAP、Wnt mRNA表達水平無明顯差異(P>0.05)。與miR-526b-3p mimic組相比,miR-526b-3p mimic+TROAP過表達組細胞miR-526b-3p表達水平無明顯差異(P>0.05),TROAP、Wnt mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。與miR-526b-3p mimic組相比,miR-526b-3p mimic+Wnt過表達組細胞miR-526b-3p及TROAP mRNA表達水平無明顯差異(P>0.05),Wnt mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)(見圖7、表6)。

表5 各組A549細胞增殖、凋亡及EMT相關蛋白表達

表6 各組A549細胞中miR-526b-3p及TROAP、Wnt mRNA相對表達

圖6 免疫印跡檢測各組A549細胞增殖、凋亡及EMT相關蛋白表達

七、A549細胞中miR-526b-3p對TROAP的靶向調節情況

通過Target Scan Human 7.2數據庫預測到miR-526b-3p與TROAP之間存在結合位點(見圖8)。與野生型TROAP+miR-526b-3p mimic陰性對照組(1.02±0.14)相比,野生型TROAP+miR-526b-3p mimic組(0.26±0.05)相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05);TROAP無義序列+miR-526b-3p mimic陰性對照組(1.01±0.13)、TROAP無義序列+miR-526b-3p mimic組(0.96±0.18)、突變型TROAP+miR-526b-3p mimic陰性對照組(0.98±0.17)、突變型TROAP+miR-526b-3p mimic組(1.03±0.21)四組之間相對熒光素酶活性無明顯差異(P>0.05)。

圖7 免疫印跡檢測各組A549細胞TROAP、Wnt蛋白表達

圖8 Target Scan Human 7.2數據庫預測到miR-526b-3p與TROAP存在之間結合位點

討 論

隨著醫療科技的發展進步,免疫治療、靶向治療等新型治療手段逐漸進入NSCLC的臨床治療中,但對患者預后的提升還不夠高,因而深入發掘NSCLC發病機制對其治療手段的改進具有重大價值[11-12]。miR-526b-3p是一種抑癌因子,在多種腫瘤中表達失調,研究顯示,上調miR-526b-3p可抑制膠質瘤細胞增殖和遷移侵襲,并誘導其凋亡[13]。miR-526b-3p還可抑制肺癌細胞的順鉑耐藥性及晚期肺癌轉移[14],并減弱NSCLC細胞的增殖、遷移、侵襲活性[5]。本研究結果顯示,與人肺泡上皮細胞相比,miR-526b-3p在人非小細胞肺癌細胞系A549、HCC827、NCI-H1299中表達顯著降低,以miR-526b-3p mimic干預處理A549細胞,可顯著降低細胞Edu陽性率、細胞遷移率、細胞侵襲數、細胞Cyclin D1、Vimentin mRNA及蛋白表達水平,上調細胞miR-526b-3p表達、Bax、Caspase-3、E-cadherin mRNA及蛋白表達水平,改善細胞核固縮、大小不一等凋亡損傷形態,表明過表達miR-526b-3p可抑制細胞周期相關基因表達,升高促凋亡基因表達,增強上皮間質轉化,減弱A549細胞增殖與侵襲遷移活性,揭示miR-526b-3p可成為治療膠質瘤的新靶點。

TROAP在各種腫瘤中具有致癌功效,沉默TROAP表達可減弱肝細胞癌的體內外增殖活性,阻滯其細胞周期進程,TROAP高表達預示著肝癌患者的生存率較低[15],并可作為肺腺癌患者生存率低的獨立預后生物標志物[16]。研究顯示TROAP在NSCLC腫瘤發生過程中表達逐漸增加[17],敲除NSCLC中TROAP可顯著抑制其癌細胞增殖、侵襲和遷移[7]。Wnt信號可調控癌細胞增殖及上皮間充質轉化過程,與肺癌的發生及進展密切相關,Wnt/β-Catenin信號通路的失活可顯著抑制NSCLC細胞上皮間充質轉化,大大降低其侵襲活性,并誘導其細胞周期阻滯和凋亡,阻斷腫瘤的體內生長,進而延緩NSCLC的進展[18-19]。另有研究顯示,Wnt/β-Catenin是TROAP的下游信號,TROAP可通過促進Wnt/β-Catenin信號傳導加快膠質瘤進展[10]。且在Target Scan Human 7.2數據庫中查詢到miR-526b-3p與TROAP之間有結合位點,因此推測通過TROAP基因調控Wnt信號可能是miR-526b-3p抑制NSCLC細胞增殖與侵襲遷移的分子機制。本研究結果顯示,與人肺泡上皮細胞相比,TROAP、Wnt基因在人非小細胞肺癌細胞系A549、HCC827、NCI-H1299中表達顯著升高,以miR-526b-3p mimic和TROAP過表達質粒聯合、miR-526b-3p mimic和Wnt過表達質粒聯合分別干預處理A549細胞,相比miR-526b-3p mimic組,均可明顯減弱過表達miR-526b-3p對細胞凋亡的改善作用及對上皮間質轉化的抑制作用,最終逆轉其對細胞增殖與侵襲遷移活性的降低功效。通過雙熒光素酶報告基因檢測實驗可證實在A549細胞中miR-526b-3p可靶向下調TROAP的表達,且過表達TROAP,可逆轉上調miR-526b-3p對Wnt基因表達的抑制作用,表明miR-526b-3p抑制A549細胞上皮間質轉化、減弱NSCLC增殖與侵襲遷移活性的作用,是通過靶向下調TROAP的表達進而下調Wnt基因表達實現的。

綜上所述,miR-526b-3p可通過靶向下調TROAP而抑制Wnt信號,進而降低細胞周期相關基因表達,增強促凋亡基因表達,抑制A549細胞上皮間質轉化,最終減弱NSCLC增殖與侵襲遷移活性。本研究有利于進一步深入闡述NSCLC發生機制,為NSCLC的臨床分子靶向治療提供了新的見解和策略。