苦味素激活苦味受體引起支氣管擴張的相關機制研究進展

陳宋程 卓懷蜜 周向東,2,3 李琪,2,3

哮喘和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是常見的呼吸系統慢性疾病,全球約3億人受其影響,氣流受限是慢阻肺、支氣管哮喘等阻塞性疾病的共同特征,急性發作時,常表現為持續氣道痙攣,可能導致呼吸衰竭、甚至窒息猝死,支氣管平滑肌主動收縮所致氣道阻塞是患者死亡的重要因素[1]。

G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptors,GPCRs)是人類基因組中最大的受體超家族,是真核生物中最大和最多樣化的膜受體組,能被光能、脂質、糖、肽和蛋白質形式的多種配體激活,將來自外部環境的信息傳遞到細胞中,以調節其相應的功能[2]。苦味受體是眾多G蛋白偶聯受體中的一員,其大約有25個功能性的編碼苦味受體蛋白的基因,這些編碼基因除了存在于口腔和咽喉,還存在于內分泌、循環、消化、呼吸等眾多系統[3]。苦味素是中草藥成分中除了生物堿和苷類以外具有苦味性質的一類化合物的通稱,是苦味受體的有效激動劑。研究證實了TAS2R受體在人類氣道平滑肌(airway smooth muscle,ASM)上的表達,并將苦味受體的表達與Ca2+信號傳導相聯系,發現苦味素可逆轉Ca2+變化引起的支氣管收縮從而擴張支氣管[4]。苦味素激動TAS2R受體可逆性的擴張慢性氣道炎癥引起的氣道收縮,這預示著TAS2R受體有著不可低估的支氣管擴張潛力,苦味素或許能成為一類用于治療哮喘和慢阻肺的具有強效擴張支氣管的新型藥物[5]。

一、TAS2R受體結構及其擴張支氣管的研究背景

TAS2Rs受體屬于G蛋白偶聯受體超家族中的一員:由一條多肽鏈形成的7個跨膜螺旋結構組成,包含相應的3個細胞外環和3個內環。外環較短,具有明顯的多態性[6],可結合多種苦味物質(即配體);內環高度保守,是細胞內G蛋白偶聯區域。與TAS2R受體偶聯的是一種特異性的苦味信號偶聯蛋白:味導素(gustducin),味導素由α、β、γ三條不同的多肽鏈組成,具有GTP酶活性和GTP結合位點[7](見圖1)。人們發現大多數TAS2R受體包含一個單一的結合位點,該結合位點以非選擇性方式廣泛調整多種苦味配體,因此不同的苦味食物結合TAS2Rs后可以引起相似的苦味覺。

圖1 苦味受體示意圖

起初,Einstein等人通過使用表達微陣列對來自五個不同個體的ASM細胞進行RNA分離和分析,發現在這五個不同個體的ASM細胞內都存在顯著的GPCR基因表達[8]。隨后,Deepak A. Deshpande及其團隊對人類氣道平滑肌細胞進行了廣泛的GPCR篩選工作,通過定量RT-PCR檢測,發現有多種TAS2R受體亞型在氣道平滑肌上存在表達,其中,TAS2R10、TAS2R14和TAS2R31是ASM細胞中表達量最高的亞型[9],與編碼β2腎上腺素能受體的ADRB2基因相比,表達量要高3～4倍。此外,研究者們也從豚鼠和小鼠ASM細胞中檢測到了TAS2Rs受體,這為研究TAS2Rs受體在ASM細胞中的作用提供了較好的體內和離體模型。研究發現,在ASM細胞中,利用苦味素激活TAS2R受體,可觀察到ASM細胞內Ca2+有明顯增加,且Ca2+瞬變的幅度與味導素α偶聯的支氣管收縮劑、組胺和緩激肽引起的幅度相當。證實了ASM細胞上苦味受體的表達[4],并將表達與苦味劑介導的細胞內Ca2+信號傳導聯系起來。

二、苦味素激活苦味受體舒張支氣管的研究進展

環境污染物中可能含有苦味化合物,其可能與氣道中的TAS2R結合,通過引發跨物種的先天厭惡反應來防止攝入有毒物質[10],起初人們認為,ASM細胞內Ca2+在TAS2R被苦味化合物激活后內流增加會導致ASM收縮,從而對吸入的有毒物質產生生理排斥,但Di Pizio等人卻發現了不一樣的結果。他們運用卵清蛋白致敏,建立慢性氣道炎癥和氣道高反應性的小鼠模型,通過吸入氯喹、糖精和地那銨等幾種已知的苦味受體激動劑后,發現小鼠ASM細胞內Ca2+增加,在運用免疫熒光共聚焦成像、膜電位測定、Q-PCR、小鼠肺功能檢測、WestBlot等方法檢測后,結果顯示吸入苦味受體激動劑后小鼠出現了顯著的氣道擴張,其氣道擴張效果比傳統的β-激動劑在同種模型氣道中的擴張作用高約3倍[11]。苦味受體激動劑激活 ASM 細胞上的TAS2R會導致強烈的支氣管擴張這一現象,引起了學術界和制藥業研究人員的注意以及對其內在機制的探索。

1 ASM上TAS2R受體的信號傳導蛋白

先前的研究已經明確苦味素可通過激活ASM細胞上的苦味受體引起氣道擴張,但其信號轉導級聯中是依靠何種G蛋白來介導激動劑與苦味受體結合仍需探討。典型的TAS2R信號轉導級聯分子在苦甜和鮮味受體之間共享,包括異源三聚體G蛋白亞基(Gα,Gβ3,和Gγ13)、磷脂酶C(Phospholipaseβ2,PLCβ2)、肌醇1,4,5-三磷酸受體(Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor 3,IP3R3)和TRPM5離子通道[12]。許多苦味激活物被認為與味覺細胞上特定的G蛋白偶聯膜受體結合,如苦味受體的同源G蛋白α-味覺誘導素。α-味覺誘導素是一種獨特的G蛋白,在約30%的II型味覺受體細胞(Taste receptor cell,TRC)中選擇性表達[13],與視網膜蛋白α-味覺誘導素有80%的同一性,研究認為其在甜味和苦味受體信號轉導中扮演重要角色。通過結合Ca2+成像和免疫組織化學,發現小鼠味蕾中大約一半的苦味敏感味覺細胞表達α-味覺誘導素,而G蛋白α-味覺誘導素敲除的小鼠的苦味敏感味覺細胞減少40到100倍,其苦味反應細胞對苦味激動劑的敏感性也降低8到10倍[14]。在人類ASM細胞中,通過G蛋白α-味覺誘導素的耦合來實現氣道平滑肌苦味受體在細胞內的信號傳導和松弛[15]。

2 ASM上TAS2R的信號傳導機制

ASM上TAS2R被激活后的信號傳導機制尚未完全明確,Deshpande等人提出苦味物質激活典型途徑:TAS2Rs激活G蛋白-味覺誘導素的β、γ亞基,形成Gβγ-復合物,Gβγ-復合物激活磷脂酶C異構體β2,然后誘導肌醇 1,4,5-三磷酸和二酰基甘油(DAG)的產生。IP3通過反向結合細胞內離子通道IP3受體[16],從而釋放內質網(endoplasmic reticulum,ER)中的Ca2+[17]。另有研究者認為,苦味素逆轉了支氣管收縮劑引起的細胞內Ca2+的增加,這種逆轉效應是通過抑制l型電壓依賴性鈣通道(voltage dependent calcium channels,VDCCs)介導的。TAS2R被苦味素刺激后,激活G蛋白α-味覺誘導素及效應磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDEs),引起鈣調蛋白(calmodulin,Cam)水平下降和蛋白激酶A(protein kinases A,PKA)活性降低[18],使三磷酸肌醇受體3對Ca2+通道的抑制作用削減,致內質網中Ca2+釋放。以上兩種機制均可引起內質網上Ca2+的釋放,增加的細胞內Ca2+激活基底外側質膜中的瞬時受體電位陽離子通道亞家族M成員4和5(Transient receptor potential M4/5,TRPM4/5),導致膜去極化,觸發Na+動作電位放電,以及誘導ATP釋放。反過來,ATP作為主要的神經遞質刺激傳入顱神經上的嘌呤能受體2和3(P2X2和P2X3 Purinergic P2 Receptor)[18-19],激活觸發動作電位,隨后激活大腦中的味覺皮層。

通過探索苦味素刺激TAS2R引起氣道擴張的機制,有研究者在上述兩種經典途徑的基礎上發現,由苦味劑引起的人ASM細胞內Ca2+的增加不依賴于細胞外 Ca2+的存在,并觀察到苦味素預處理幾乎消除了MCh誘導的ASM細胞內鈣濃度的升高,從而抑制了鈣誘導的收縮效應[20],但該反應可被Gβγ抑制劑、PLCβ抑制劑消除,并被3-磷酸肌醇受體拮抗劑部分抑制(見圖2)。

三、苦味受體激動劑的篩選及擴張潛能

與其他GPCR相比,苦味受體與多種結構不同的物質相互作用的能力非常顯著,包括多種藥物/抗生素、多酚、細菌代謝物、鹽和金屬離子[21],因此,探索尋找具有顯著選擇性的高度異質苦味化合物是目前研究的重點方向和主要挑戰。2019年有研究者首次使用電子細胞基質阻抗傳感器(Electric Cell-substrate Impedance Sensing,ECIS)建立了檢測ASM收縮/松弛效應的方法,篩選出的奎寧、諾比列素和苦味菌素IA均能有效抑制平滑肌收縮,且呈濃度依賴性[22]。盡管已鑒定出上千種苦味物質,但迄今為止研究的其他苦味物質中,多數的支氣管舒張效果及安全性并不理想。典型的氯喹和其類似化合物被認為對TAS2R無特異選擇性。denatonium(地托丹寧)會誘導氣道上皮細胞(airway epithelial cell,AEC)的凋亡,這可能損害上皮完整性,甚至增加了冠狀病毒及其他有害顆粒物入侵機體的風險[23],故需仔細評估其對氣道上皮的潛在毒性。另有研究表明柚皮苷對16HBE細胞的增殖作用可能與細胞周期的增強、細胞周期素E mRNA的表達和鈣信號的激發有關,使用特異性阻斷劑抑制TAS2R表達和TAS2R信號通路均可減弱柚皮苷的促增殖作用[24]。柚皮苷對氣道上皮有足夠的安全性,但至少需在幾百微摩爾濃度下發揮作用,這限制了其在臨床上的應用。

圖2 苦味素激動苦味受體的信號傳導通路

2020年有研究者發現體外低濃度的血根堿SA(低于1μM)能夠以劑量依賴的方式舒張大鼠ASM,通過抑制Gβγ、PLCβ、3-磷酸肌醇受體可減弱ASM的舒張反應,表明SA可能依賴于TAS2R/Gβγ/PLCβ信號途徑誘導ASM松弛[25]。但目前已知SA對心肌中的Na+,K-ATP酶具有抑制作用,在大鼠心房中引起正性肌力作用,表明SA可能對心肌細胞存在毒性作用[26],這可能也是引起ASMC損害的危險因素,故在將來的研究中需要仔細評估SA在臨床應用中的安全性。

苦丁苷(KE-A)是從苦丁茶中提取的一類具有典型五環三萜和內酯結構的苦味化合物[27],是一種有效的TAS2R激動劑。有研究者建立了大鼠ASM原代細胞TAS2R10和TAS2R14細胞模型,用30μM氯喹和30μM KE-A培養,可觀察大鼠ASM原代細胞內鈣離子增加,KE-A組的鈣離子增加程度與氯喹組相類似[7,28],再用Mch刺激,發現細胞內Ca2+的升高被明顯抑制,結果表明,TAS2R激活誘導細胞內鈣水平輕微升高,但不足以誘導味覺受體細胞磷酸化,而顯著抑制了MCh介導的鈣釋放[29]。但目前研究僅限于KE-A對體外大鼠ASMC的影響,需要進一步在體外測定KE-A對人ASMC的影響以及在體內的作用,以確定KE-A在擴張支氣管作用上的潛在價值。

四、結語

本文對代表性苦味中藥組分介導支氣管舒張的相關分子機制做了詮釋,同時淺析目前具有代表性的中藥組分在舒張支氣管方面的潛能,有助于從傳統中藥中尋找有效的單體成分,為拓展其科學應用提供新的思路,也為慢性氣道炎癥性疾病的防治提供了新思路。

隨著研究的深入,苦味受體激動劑舒張支氣管的機制將會逐漸明晰,TAS2R激動劑作為治療阻塞性氣道疾病的新型高效支氣管擴張劑顯示出良好的前景,但也存在巨大的挑戰。TAS2R亞型之間存在高度同源的序列,篩選出具有高度特異性的化合物是目前急需解決的難題,有日本學者運用實時定量PCR(qPCR)方法來確定每種TAS2R亞型的基因表達,但其量化的基因亞型有限,且會受到來自其他亞型的干擾[30];此外,尋求更加高效的苦味化合物、如何避免藥物脫靶以及更合適的給藥形式仍需要進一步探索。