基于ITS 基因序列的我國東南沿海等邊淺蛤遺傳多樣性及遺傳結構研究

李重，黃繼，顧忠旗，葉瑩瑩

(1.浙江海洋大學國家海洋設施養殖工程技術研究中心，浙江舟山 316022；2.嵊泗縣海洋科技研究所，浙江嵊泗 202450)

等邊淺蛤Macridiscus multifarius俗稱沙蛤[1]。該物種生活于我國沿海潮間帶的中潮、低潮帶至淺海的泥沙海底，另外，其在日本、韓國、朝鮮、越南、印度和印度尼西亞也有分布[2]。等邊淺蛤貝殼呈三角卵圓形，殼質堅厚、重，其味道鮮美及營養豐富，由于具有一定的經濟和食用價值而成為我國廣泛養殖的海水貝類之一[3]。目前關于等邊淺蛤的分子生物學相關研究較少，其中夏立萍等[3]基于高通量測序技術對等邊淺蛤的線粒體全基因組進行了測序并進行了系統進化研究。徐鳴[4]利用線粒體16S rRNA 基因、Cytb基因、COX3基因作為分子標記分析了我國沿海等邊淺蛤的遺傳多樣性及遺傳結構。于瑞海等[5]取活的等邊淺蛤鰓組織為材料，對等邊淺蛤線粒體核型進行了分析研究。針對等邊淺蛤核糖體ITS基因標記的研究還未有報道。

核糖體DNA(nuclear ribosomal DNA,rDNA)由于種內基因的流動時常表現出非常高的同源性，在種群間仍保持著多種程度的變異[6]。在rDNA 基因中，5.8S rDNA 和28S rDNA 基因間隔序列(internal transcribed spacer)即ITS基因序列非常保守，且在種群間表現比較高的差異。近年來常被用于親緣關系鑒定[7]、系統進化[8]及種群遺傳結構[9]等方面的研究。此外，這一技術也廣泛應用于動植物病原菌檢測和診斷[10]。

近些年來，由于海洋污染與過度捕撈，等邊淺蛤野生資源的保護正面臨巨大挑戰。本研究以核糖體DNA的ITS基因序列為分子標記，對我國東南沿海4 個不同地理群體的等邊淺蛤進行了遺傳多樣性及遺傳結構分析，以補充等邊淺蛤群體遺傳相關領域研究的不足，為我國等邊淺蛤種質資源的保護研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究所用等邊淺蛤采集于4 個沿海地區，分別為浙江舟山(ZS)、浙江南麂島(NJ)、福建漳浦(ZP)、廣西北海(BH)，如圖1 所示。在每個地點選取多處采集點并隨機取樣，采集好的樣本放入冰盒保存，在實驗室內解剖，取其閉殼肌組織保存于無水乙醇中，并采用改良鹽析法[11]提取總DNA，用瓊脂糖凝膠電泳進行質量檢測，后置于-20 ℃下保存備用。

圖1 等邊淺蛤群體樣本采集點Fig.1 Collection locations of M.multifarius populations

1.2 核糖體ITS 序列的擴增

等邊淺蛤核糖體ITS 序列的擴增引物，來源于通用引物[12]，序列如下：ITS 5.8S：5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’，ITS 18S：5’-CGCCGTTACTAGGGGAATCCTTGTAAG-3’。PCR 體系：2×TaqMix 酶12.5 μL、模板DNA 0.5 μL、上下游引物各1 μL(引物濃度為10 mmol·L-1)與10 μL ddH2O(up to 25 μL)。PCR 反應條件：在96 ℃下完成2 min 的預變性，30 s 變性，53 ℃下復性30 s，73 ℃延伸90 s，在完成35 個循環反應后，在73 ℃延伸10 min。PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將質量符合后續實驗要求的PCR 產物送至杭州擎科生物技術有限公司進行雙向測序。

1.3 序列分析及系統發育樹構建

通過MEGA v7.0[13]軟件對測序獲得的ITS序列進行比對矯正，并對齊全部序列片段，為了進一步確定樣本的準確性，以及所得片段的準確位置，在NCBI 數據庫中的BLAST 工具上(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對比序列結果[14]。利用MEGA v7.0[13]基于Kimura 2-parameter 模型，采用鄰接法(neighbor-joining method)構建系統發育樹，設置參數自舉檢驗值(bootstrap)1 000 次重復檢驗各分支。利用軟件DNASP[15]計算各類遺傳學參數，包括單倍型數、單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)。利用Arlequin3.5[16]軟件計算遺傳分化系數(Fst)，并計算Fst的P值，同時使用Arlequinv3.5[16]進行分子方差分析(AMOVA)、并在Tajima′sD與Fu′sFs模型下，檢測數據是否符合中性進化理論。利用軟件Network v5.1[17]基于中介鄰接法(median-joining method)構建ITS序列標記的單倍型網絡圖。

2 結果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

對得到的81 個等邊淺蛤樣本進行PCR 擴增測序后，我們獲得了長度為420 bp的ITS基因序列(NCBI登錄號分別為：ON870718-ON870798)。數據分析顯示在獲得的ITS基因片段樣本中含有31 個單倍型(表1)。其中有8 個共享單倍型，Hap-1 被舟山、南麂島、漳浦群體共享，Hap-2 被舟山、北海、漳浦群體共享。Hap-13 被舟山和南麂島群體同時共享，Hap-12、Hap-16、Hap-19、Hap-18、Hap-20 被漳浦和南麂島群體同時共享。其余單倍型均為各個群體所特有的單倍型。

表1 基于ITS 標記的等邊淺蛤4 個群體的遺傳學參數Tab.1 Genetic diversity parameters of partical ITS gene in 4 populations of M.multifarius

等邊淺蛤4 個群體的ITS序列的遺傳學參數如表1 所示。其中平均單倍型多樣性處于中等偏高水平(h=0.733)，南麂島和漳浦群體單倍型多樣性相對較高(h=0.912和h=0.892)，舟山群體單倍型多樣性最低(h=0.368)。在核苷酸多樣性水平的數據上，4 個群體的平均值偏低(π=0.018 63)，其中舟山群體的核苷酸多樣性水平最低(π=0.001 19)。舟山群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性偏低，可能與樣本采集點過于集中有關。

2.2 群體遺傳結構的研究

如表2 所示，在ITS基因序列中遺傳分化系數Fst的范圍在0.033～0.254 之間，其中北海(BH)和舟山(ZS)之間Fst最大值為0.254(P＜0.05)，北海(BH)和南麂(NJ)之間Fst為0.234(P＜0.05)，北海(BH)和漳浦(ZP)之間Fst為0.214(P＜0.05)。表內數據顯示，北海(BH)群體與其他群體之間存在中等遺傳分化，其他群體間遺傳分化較小且不顯著(P＞0.05)。

表2 基于ITS 序列的等邊淺蛤群體遺傳分化Tab.2 Estimates of population genetic differentiation based on ITS gene for the M.multifarius

基于4 個等邊淺蛤群體的ITS基因構建的系統進化樹如圖2 所示，該系統進化樹總體分為2 大支，北海(BH)群體為單獨的1 支，其他群體在另1 大支上。

圖2 等邊淺蛤4 個群體ITS 序列的NJ 系統發育樹Fig.2 The NJ phylogenetic tree of four populations of M.multifarius based on ITS sequences

圖3 為等邊淺蛤群體的單倍型網絡圖，其中Hap-1 被舟山(ZS)、南麂(NJ)、漳浦(ZP)3 個群體共享，位于中央。北海(BH)群體的單倍型相比于其他群體的單倍型出現較為明顯的地理分支，這表明北海(BH)群體相較于其他群體發生了遺傳分化，這與系統發育樹和Fst值結果一致。

圖3 等邊淺蛤4 個群體的ITS 序列單倍型網絡圖Fig.3 The haplotype network of four populations of M.multifarius based on ITS sequences

2.3 群體歷史動態分析

表3 為AMOVA 結果，4 個等邊淺蛤群體間和群體內遺傳變異分別占31.13%和69.87%，表明群體內遺傳分化比例遠大于群體間遺傳分化比例。中性檢驗結果(表4)顯示，4 個等邊淺蛤群體的ITS序列的Tajima′sD值均不顯著(P＞0.05)，Fu′sFs值總體未達到顯著水平(P＞0.05)。這表明這4 個等邊淺蛤群體符合中性進化，無群體擴張現象發生。

表3 等邊淺蛤4 個群體ITS 序列遺傳差異的分子方差分析(AMOVA)Tab.3 AMOVA analysis among 4 populations of M.multifarius based on ITS sequences

表4 等邊淺蛤4 個群體基于ITS 序列的中性檢測結果Tab.4 Selective neutrality test analysis of 4 populations of M.multifarius based on ITS sequences

3 討論

3.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性是衡量物種適應復雜環境的潛力的重要指標[18]。相對來講，遺傳多樣性水平越高的種群，其對環境的適應能力就越強。所以研究物種遺傳多樣性有助于我們了解物種的進化潛力，對于物種多樣性的保護具有重要的意義[19]。本研究基于核糖體DNA的ITS基因序列探究了我國東南沿海4 個不同地理位置等邊淺蛤群體的遺傳多樣性及遺傳結構。衡量物種遺傳多樣性是否豐富的重要的指標包括核苷酸多樣性和單倍型多樣性[20]，核苷酸多樣性和單倍型多樣性越高，遺傳多樣性越大[21]。在本研究中，4 個群體的等邊淺蛤一共檢測到31 個單倍型，其平均單倍型多樣性為0.733，核苷酸多樣性為0.018 63，4 個等邊淺蛤群體總體呈現較高的遺傳多樣性。等邊淺蛤通過體外受精的方式繁育個體、浮游幼蟲的生活范圍較大，且生殖能力比較強，這些都是等邊淺蛤遺傳多樣性比較高的原因[22]。這些現象在海洋貝類中也普遍存在[23]，倪剛[24]基于線粒體和核DNA 分子標記研究了4 種廣布性貝類系統地理學，同時發現青蛤Cyclina sinensis、泥蚶Tegillarca granosa、中國蛤蜊Mactra chinensis、四角蛤蜊Mactra veneriformis這4 種貝類遺傳多樣性都較為豐富。尤仲杰等[25]采用隨機擴增多態性(RAPD)技術，對5 個西施舌Mactra antiquata自然群體的遺傳多樣性進行了研究，發現我國5 個西施舌群體的多態位點比例平均值為78.97%，平均遺傳雜合度為0.309，處于較高的遺傳多樣性水平。

中性檢驗數據顯示4 個等邊淺蛤群體沒有發生過群體擴張，所以等邊淺蛤遺傳多樣性的高水平很可能與其體外受精以及生活環境周圍的洋流與潮流影響相關[26]。此結果與田云方等[27]利用線粒體COI基因研究麗文蛤Meretrix lusoria群體遺傳多樣性的結論相似。

3.2 群體遺傳結構

群體遺傳結構是生物多樣性的保護單元，在進化上具有重要意義。Fst值是衡量一個物種遺傳分化指數高低的指標，Fst值越大，說明群體之間的遺傳分化水平就越大[28]。一個物種近親繁殖程度的高低也可以通過Fst值來反映[29]。本研究中Fst值的研究數據顯示，北海群體與舟山、南麂島、漳浦群體之間存在顯著遺傳分化，而舟山、南麂島、漳浦群體間遺傳分化較小且不顯著。NJ 系統進化樹顯示，北海群體為單獨的1支，其他群體聚為另1 大支。單倍型網絡圖同樣可以反映群體的遺傳結構關系，從單倍型網絡圖來看，北海群體的單倍型相比于其他群體的單倍型出現較為明顯的地理分支，這與Fst值以及NJ 進化樹顯示的結果一致。

海峽隔離作用和洋流活動會影響海洋生物的遺傳結構[30]，王景博等[31]采用AFLP 分子標記對中國沿海的6 個野生縊蟶Sinonovacula constricta群體的遺傳多樣性和遺傳結構進行研究，發現由于海南島與雷州半島的地理隔離作用，北海的野生縊蟶群體與其他群體間存在顯著的遺傳分化[27]。本研究中等邊淺蛤樣本采樣地的4 個地理位置中北海位于北部灣海域，北海群體與其他群體間被瓊州海峽隔離。此外，等邊淺蛤在其幼蟲階段會以浮游方式生活[28]，其浮游期較短，為10 d 左右[32]，由于雷州半島的隔離作用，北海地區等邊淺蛤群體生活在較為單一的環流之中，所以北海群體與其他3 個群體間基因交流不大，與其他3 個群體間分化明顯。

4 小結

本文對我國東南沿海4 個地理群體的等邊淺蛤進行群體遺傳學研究，結果顯示北海群體和舟山、南麂島、漳浦群體間存在顯著遺傳分化，這與等邊淺蛤浮游幼蟲期較短、北海地區等邊淺蛤群體生活環境周圍的洋流影響以及海南島與雷州半島的地理隔離作用有關。目前隨著海洋經濟的發展，海洋污染及海洋生物多樣性衰減等問題愈發突出，等邊淺蛤作為我國沿海潮間帶的一種優質貝類，不僅是一個經濟物種，其作為食物鏈中的一環，在生態系統的物質循環和能量流動也扮演著重要的角色。對等邊淺蛤群體遺傳多樣性及遺傳結構的研究，將有助于更好的指導等邊淺蛤群體資源保護與開發利用，同時也對保護淺蛤屬的物種多樣性具有重要的意義。