核糖體蛋白S24對人頸動脈粥樣硬化的影響及機制

李卓 陳百強 孔祥一 秦臻 栗世方

［摘要］ 目的 研究核糖體蛋白S24（RPS24）對人頸動脈斑塊血管新生的作用以及對磷酸甘油酸激酶1（PGK1）的調控。

方法 采用免疫印跡（Western blot）方法檢測人體頸動脈穩定斑塊組織（穩定組）和易損斑塊組織（易損組）中的RPS24和PGK1蛋白表達水平。體外培養人臍靜脈內皮細胞（HUVEC），將細胞分為對照組和RPS24小干擾RNA（siRNA）組（siRNA組），進行成小管實驗，分別檢測兩組細胞形成小管的數量和總長度，采用Western blot法檢測兩組細胞培養上清液中RPS24和PGK1的蛋白表達量。

結果 易損組人頸動脈斑塊組織中RPS24蛋白表達水平明顯高于穩定組，而PGK1蛋白表達水平則明顯低于穩定組，差異具有統計學意義（t=47.50、39.06，P<0.05）。siRNA組細胞形成小管的數量和總長度明顯低于對照組（t=9.80、25.74，P<0.05）。siRNA組細胞培養上清液中RPS24蛋白表達量顯著低于對照組，而PGK1蛋白表達量則顯著高于對照組（t=36.15、28.18，P<0.05）。

結論 RPS24通過抑制PGK1的表達來促進頸動脈斑塊的新血管生成，抑制RPS24的表達可能是治療頸動脈易損斑塊的新選擇。

［關鍵詞］ 核糖體蛋白質類；斑塊，動脈粥樣硬化；新生血管化，病理性；磷酸甘油酸酯激酶

［中圖分類號］ R543.5;R364.3

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）01-0006-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.041

［網絡出版］ https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20230308.1034.003.html;2023-03-09 17：04：44

EFFECT OF RIBOSOMAL PROTEIN S24 ON HUMAN CAROTID ATHEROSCLEROSIS AND ITS MECHANISM

LI Zhuo， CHEN Baiqiang， KONG Xiangyi， QIN Zhen， LI Shifang

（Departments of Neurosurgery， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）

; ［ABSTRACT］ ?Objective ?To investigate the role of ribosomal protein S24 （RPS24） in angiogenesis of human carotid plaques and its regulatory effect on phosphoglycerate kinase 1 （PGK1）.

Methods ?Western blot was used to measure the protein expression of RPS24 and PGK1 in stable human carotid plaque and vulnerable plaque. Human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） were cultured in vitro and were then divided into control group and RPS24 small interfering RNA （siRNA） group; tubule formation assay was used to measure the number and total length of tubules formed in both groups， and Western blot was used to mea-

sure the protein expression levels of RPS24 and PGK1 in the culture supernatant of both groups.

Results ??Compared with the stable human carotid plaque group， the vulnerable plaque group had a significantly higher protein expression level of RPS24 and a significantly lower protein expression level of PGK1 （t=47.50，39.06;P<0.05）. The siRNA group had significantly lower number and total length of tubules formed than the control group （t=9.80， 25.74;P<0.05）. Compared with the control group， the siRNA group had a significantly lower protein expression level of RPS24 and a significantly higher protein expression level of PGK1 in supernatant （t=36.15，28.18;P<0.05）.

Conclusion ?RPS24 promotes neovascularization of carotid plaques by inhibiting PGK1 expression， and inhibition of RPS24 expression may be a new option for the treatment of carotid vulnerable plaques.

［KEY WORDS］ ?ribosomal proteins; plaque， atherosclerotic; neovascularization， pathologic; phosphoglycerate kinase

在中國，腦卒中是一個嚴重的公共健康問題，18%～25%的缺血性卒中可歸因于頸動脈粥樣硬化疾病引起的血栓栓塞，而頸動脈粥樣硬化病人的腦卒中預防是基于頸動脈血管的狹窄程度［1-2］。但現在越來越多的證據表明，某些類型的頸動脈斑塊，即所謂的易損斑塊，與狹窄程度無關，也極有可能引起缺血性卒中和血栓并發癥，與穩定斑塊相比更加危險［3］。頸動脈斑塊的易損性進展程度受多種因素的影響，如炎癥、細胞外基質降解、血脂異常、血壓異常、新生血管等［4-5］。近年來，斑塊內新生血管受到越來越多的重視，病理性新生血管與動脈粥樣硬化全程有關，其存在與斑塊破裂的風險直接相關［6-8］。所以通過對斑塊新生血管的干預來控制頸動脈斑塊易損性進展對腦卒中具有重要意義。

核糖體蛋白S24（RPS24）屬于S24E家族核糖體蛋白，參與了多種疾病發生、細胞增殖和凋亡、血管生成等過程［9-10］。磷酸甘油酸激酶1（PGK1）是一種糖酵解酶，除參與糖酵解反應外，還參與多種腫瘤的發生。據報道，肝癌微血管浸潤相關長鏈非編碼RNA（lncRNA）MVIH與PGK1相關，可通過抑制PGK1的分泌來激活血管生成［11-12］。而RPS24 mRNA可以與MVIH結合成為復合物，但它對頸動脈斑塊易損性的作用以及具體機制目前知之甚少［13］。根據上述研究，我們推測RPS24可能通過抑制PGK1的分泌來促進血管生成。為了驗證這一猜測，本研究利用國際公認的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）的成小管實驗來觀察人頸動脈斑塊組織內的血管生成情況［14］，探討RPS24對頸動脈斑塊新生血管的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

RPS24抗體以及PGK1抗體購自美國Affinity Biosciences公司；實驗用抗β-actin兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；苯甲基磺酰氟（PMSF，0.1 mol/L）、蛋白磷酸酶抑制劑混合物（100×）、高效RIPA裂解緩沖液、BCA試劑盒、二甲基亞砜（DMSO）、優級胎牛血清購自北京索萊寶科技有限公司；HUVEC購自上海賽百慷生物技術股份有限公司；RPS24小干擾RNA（siRNA）購自上海吉瑪基因公司；細胞培養試劑以及DMEM-H-Glucose、Trypsin-EDTA、glutaMax（100×）、青霉素-鏈霉素（100×）均購自美國Gibico公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本來源及分組 人頸動脈斑塊組織標本來自于2020—2021年在青島大學附屬醫院神經外科行頸總動脈分叉處內膜剝脫手術的12例頸動脈狹窄病人。本研究所進行的人體組織實驗獲得青島大學附屬醫院倫理委員會批準，并征得病人書面知情同意。每例標本離體后平均分為兩部分，分別用40 g/L中性甲醛和液氮保存，以備組織學觀察和免疫印跡（Western blot）法檢測。根據美國心臟協會制定的頸動脈易損標準［15］，將兩種不同方法處理的斑塊組織標本分為穩定組和易損組，每組6例。

1.2.2 斑塊組織學觀察 兩組用40 g/L中性甲醛固定的標本先進行常規石蠟包埋（脫鈣、脫水）、切片（5 μm，橫截面），接著進行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察人頸動脈斑塊組織的纖維帽厚度、脂質壞死核心、出血和鈣化等；隨后采用油紅O染色的方法測定斑塊內的脂質成分；最后進行Masson染色，檢測斑塊組織的纖維成分［16］。

1.2.3 Western blot法檢測RPS24和PGK1蛋白表達 兩組保存于液氮中的斑塊組織，分別在冰上添加RIPA細胞裂解緩沖液來裂解細胞，離心后提取組織總蛋白，接著用BCA試劑盒測定蛋白濃度。配制120 g/L SDS-PAGE凝膠，按每孔10 μg上樣量對蛋白質進行電泳分離，將蛋白轉移到PVDF膜上，用含有50 g/L脫脂牛奶的TBST溶液在室溫下封閉1 h，分別加入RPS24、PGK1和GAPDH一抗，放搖床上1 h后置-4 ℃冰箱中過夜，第2天室溫復溫后先用TBST溶液清洗PVDF膜3次，每次10 min，然后加入酶標二抗室溫孵育2 h，再次用TBST溶液清洗3次，隨后采用ECL化學發光試劑盒進行顯影，獲取蛋白條帶圖。最后采用Image J軟件對圖像進行灰度值分析，目的蛋白的表達水平以目的蛋白與GAPDH內參蛋白條帶灰度值的比值來表示。

1.2.4 細胞培養 將HUVEC置于含有體積分數0.10胎牛血清和青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養液中，在37 ℃、含體積分數0.05 CO2的細胞培養箱中培養。細胞每2 d傳代1次，采用對數生長期細胞進行實驗。將1 mL胰蛋白酶-EDTA消化液（2.5 g/L）加入到接近致密的單層細胞中，在室溫下消化2～3 min，得到后續實驗用的細胞消化液。所有實驗均采用第3～6代緊密融合的單層HUVEC。

1.2.5 siRNA慢病毒轉染 使用siRNA轉染來敲低RPS24的表達，按照試劑盒的說明書進行操作，HUVEC被慢病毒轉染12 h時換液，轉染48 h時，取被轉染的細胞進一步分析。

1.2.6 HUVEC成小管實驗 用RPS24 siRNA轉染HUVEC（siRNA組）。轉染48 h待細胞消化后，通過離心獲取上清液。在收集的培養上清液中培養細胞24 h（細胞密度2×108/L），接著以每孔50 μL細胞懸液的規格接種在已經在培養箱中凝固的Matrigel基質膠上，繼續在 37 ℃、含體積分數為0.05 CO2的培養箱中孵育8 h，用Olympus倒置顯微鏡觀察HUVEC的類毛細血管結構形成情況，同時拍照。使用亂序siRNA轉染作為陰性對照（對照組）。最后，用Image J軟件對兩組細胞形成小管的數量和總長度進行量化和比較。

1.3 統計學分析

應用GraphPad Prism 8.0軟件對所得數據進行統計學分析。計量數據以±s表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結? 果

2.1 兩組人頸動脈斑塊的組織學差異

取自頸動脈狹窄病人頸總動脈分叉處的粥樣硬化斑塊進行橫切面切片處理后，分別進行HE染色、油紅O染色和Masson染色，結果顯示，兩組斑塊有明顯差異，相較于穩定組人頸動脈斑塊，易損組斑塊有更薄的纖維帽，更加雜亂的脂質壞死核心和更加廣泛的纖維成分。見圖1。

2.2 RPS24和PGK1在兩組頸動脈斑塊組織中的表達差異

與穩定組人頸動脈斑塊相比較，易損組斑塊中RPS24蛋白的表達明顯增高（t=47.50，P<0.05），而PGK1蛋白表達明顯降低（t=39.06，P<0.05）。見圖2、表1。

2.3 RPS24在體外對微血管生成的影響

HUVEC孵育8 h后，對照組大部分細胞都參與生成環狀結構，而siRNA組幾乎全部細胞都呈零星分布，并且分布雜亂，沒有環狀結構出現，未參與小管生成。見圖3。對照組細胞生成的小管數量顯著高于siRNA組（t=9.80，P<0.05），生成小管的總長度也顯著高于siRNA組（t=25.74，P<0.05）。表明RPS24可以促進HUVEC小管形成。見表2。

2.4 RPS24對PGK1分泌的影響

Western blot檢測結果顯示，siRNA組細胞培養上清液中RPS24蛋白表達量顯著低于對照組，而PGK1蛋白表達量則顯著高于對照組（t=36.15、28.18，P<0.05）。見圖4、表3。

3 討? 論

頸動脈粥樣硬化是老年男性人群常見的血管疾病［17］。頸動脈斑塊作為中國最高致死率疾病腦卒中的關鍵病因，其治療顯得尤為重要。與普通的頸動脈穩定斑塊相比較，易損斑塊往往有更強的炎性反應［18］，更薄的纖維帽［5］，更廣泛、雜亂的新生血管［4］，更高含量且更為活躍的基質金屬蛋白酶［19］，這些因素都意味著頸動脈易損斑塊擁有不穩定、易碎、斑塊內出血等高危特點［3］。最近的研究發現，斑塊內出血是導致頸動脈斑塊破裂的一大重要因素，而斑塊內新血管的生成能夠增大斑塊內出血的風險［8］。所以本研究從新生血管入手探討影響斑塊內出血的因素。

越來越多的證據表明，核糖體蛋白在人類腫瘤的發生和進展中起重要作用［20-21］。據報道，RPS24可以在體外促進結直腸癌細胞的遷移和增殖［22］。另有研究表明，RPS24異構體可通過增強結直腸癌

中LncRNA MVIH的穩定性促進腫瘤血管生成［23］。

LncRNA MVIH位于RPS24基因內，之前有研究報道，lncRNA MVIH可以促進肝細胞癌血管生成［24］。lncRNA是非編碼RNA，在多種生物過程中發揮著重要作用，包括染色質組織、轉錄和轉錄后控制［25］。而lncRNA MVIH可以與RPS24 mRNA結合形成異構體［13］。另有研究結果表明，lncRNA MVIH與PGK1相關，可以通過抑制PGK1的分泌來激活血管生成。所以，我們推測RPS24可以調控PGK1的表達和分泌。

本研究對來自于臨床的人頸動脈斑塊進行了Western blot檢測，結果顯示，相較于人頸動脈穩定斑塊，人頸動脈易損斑塊中RPS24的蛋白表達顯著升高。由于RPS24參與多種疾病的血管生成過程，并且有研究結果表明，PGK1可以促進細胞增殖并抑制細胞凋亡，以此介導動脈粥樣硬化的發展［26］，所以我們猜測，RPS24在人頸動脈斑塊易損性進展過程的血管新生環節中扮演了重要角色。為了探討RPS24對血管生成的影響，本研究進行了HUVEC小管形成測定，結果表明，經過RPS24 siRNA靶向處理的培養液可以抑制HUVEC的小管形成。隨后本研究又檢測了在敲低RPS24情況下PGK1的表達水平，發現敲低RPS24可以解除對PGK1的抑制，從而抑制血管生成。

綜上所述，本研究表明，RPS24通過抑制PGK1來促進人頸動脈斑塊內的血管生成。研究RPS24對血管的影響有助于更深入了解人頸動脈斑塊內血管新生的機制。通過抑制RPS24對新生血管進行調控或許會為頸動脈斑塊的非手術治療提供一種新的思路。

［參考文獻］

［1］NAGHAVI M， FALK E. From vulnerable plaque to vulnerable patient［J］. Asymptomatic Atherosclerosis， 2011：13-38. doi：10.1007/978-1-60327-178-0_2.

［2］BRETT A S， LEVINE J D. The case against identifying caro-

tid stenosis in asymptomatic patients［J］. JAMA Internal Me-

dicine， 2014，174（12）：2004-2008.

［3］LABADZHYAN A， CSIBA L， NARULA N， et al. Histopathologic evaluation of basilar artery atherosclerosis［J］. Journal of the Neurological Sciences， 2011，307（1-2）：97-99.

［4］ICHIBORI Y， NAKATANI D， SAKATA Y， et al. Cardiac allograft vasculopathy progression associated with intraplaque neovascularization［J］. Journal of the American College of Cardiology， 2013，61（9）：e149.

［5］SABA L C， ANZIDEI M， MARINCOLA B C， et al. Imaging of the carotid artery vulnerable plaque［J］. Cardiovascular and Interventional Radiology， 2014，37（3）：572-585.

［6］SCHINDLER A， SCHINNER R， ALTAF N， et al. Prediction of stroke risk by detection of hemorrhage in carotid plaques： meta-analysis of individual patient data［J］. JACC Cardiovascular Imaging， 2020，13（2 Pt 1）：395-406.

［7］ZHANG Y， CAO J， ZHOU J Y， et al. Plaque elasticity and intraplaque neovascularisation on carotid artery ultrasound： a comparative histological study［J］. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery， 2021，62（3）：358-366.

［8］MUJAJ B， BOS D， MUKA T， et al. Antithrombotic treatment is associated with intraplaque haemorrhage in the atherosclerotic carotid artery： a cross-sectional analysis of The Rotterdam Study［J］. European Heart Journal， 2018，39（36）：3369-3376.

［9］LINDSTRM M， ZHANG Y P. Ribosomal protein S9 is a novel B23/NPM-binding protein required for normal cell prolife-

ration［J］. Journal of Biological Chemistry， 2008，283（23）：15568-15576.

［10］LI C， GE M， YIN Y， et al. Silencing expression of ribosomal protein L26 and L29 by RNA interfering inhibits proliferation of human pancreatic cancer PANC-1 cells［J］. Molecular and Cellular Biochemistry： An International Journal for Chemical Biology， 2012，370（1-2）：127-39.

［11］PARK M K， ZHANG L， MIN K W， et al. NEAT1 is essential for metabolic changes that promote breast cancer growth and metastasis［J］. Cell Metabolism， 2021，33（12）：2380-2397.e9.

［12］LIANG J S， LIU C T， XU D Z， et al. LncRNA NEAT1 facilitates glioma progression via stabilizing PGK1［J］. Journal of Translational Medicine， 2022，20（1）：80.

［13］YUAN S X， YANG F， YANG Y， et al. Long noncoding RNA associated with microvascular invasion in hepatocellular carcinoma promotes angiogenesis and serves as a predictor for hepatocellular carcinoma patients poor recurrence-free survival after hepatectomy［J］. Hepatology （Baltimore， Md）， 2012，56（6）：2231-2241.

［14］THORNTON C C， AL-RASHED F， CALAY D， et al. Me-

thotrexate-mediated activation of an AMPK-CREB-dependent pathway： a novel mechanism for vascular protection in chronic systemic inflammation［J］. Annals of the Rheumatic Diseases， 2016，75（2）：439-448.

［15］STEFANADIS C， ANTONIOU C K， TSIACHRIS D， et al. Coronary atherosclerotic vulnerable plaque： current perspectives［J］. Journal of the American Heart Association， 2017，6（3）：e005543.

［16］GANGULY R， KHANAL S， MATHIAS A， et al. TSP-1 （thrombospondin-1） deficiency protects ApoE-/- mice against leptin-induced atherosclerosis［J］. Arteriosclerosis， Thrombosis， and Vascular Biology， 2021，41（2）：e112-e127.

［17］ZHAN C Q， SHI M， YANG Y， et al. Prevalence and risk factors of carotid plaque among middle-aged and elderly adults in rural Tianjin， China［J］. Scientific Reports， 2016，6：23870.

［18］CUI Y， WAN Q. NKT cells in neurological diseases［J］. Frontiers in Cellular Neuroscience， 2019，13：245.

［19］MOLLOY K J， THOMPSON M M， JONES J L， et al. Unstable carotid plaques exhibit raised matrix metalloproteinase-8 activity［J］. Circulation， 2004，110（3）：337-343.

［20］LOHRUM M A， LUDWIG R L， KUBBUTAT M H， et al. Regulation of HDM2 activity by the ribosomal protein L11［J］. Cancer Cell， 2003，3（6）：577-587.

［21］MACIAS E， JIN A W， DEISENROTH C， et al. An ARF-independent c-MYC-activated tumor suppression pathway me-

diated by ribosomal protein-Mdm2 Interaction［J］. Cancer Cell， 2010，18（3）：231-243.

［22］WANG Y， SUI J K， LI X， et al. RPS24 knockdown inhibits colorectal cancer cell migration and proliferation in vitro［J］. Gene， 2015，571（2）：286-291.

［23］WANG Y， WU Y J， XIAO K， et al. RPS24c isoform facilitates tumor angiogenesis Via promoting the stability of MVIH in colorectal cancer［J］. Current Molecular Medicine， 2020，20（5）：388-395.

［24］PONTING C P， OLIVER P L， REIK W. Evolution and functions of long noncoding RNAs［J］. Cell， 2009，136（4）：629-641.

［25］GEISLER S， COLLER J. RNA in unexpected places： long non-coding RNA functions in diverse cellular contexts［J］. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2013，14（11）：699-712.

［26］ZHANG X， GUAN M X， JIANG Q H， et al. NEAT1 knockdown suppresses endothelial cell proliferation and induces apoptosis by regulating miR-638/AKT/mTOR signaling in atherosclerosis［J］. Oncology Reports， 2020，44（1）：115-125.

（本文編輯 馬偉平）