TRAIP基因沉默對TNBC細胞增殖和侵襲遷移影響

鄭艷 王萍 王笑 劉俐彤 陳召旭 王成勤

［摘要］ 目的 研究腫瘤壞死因子受體相關因子相互作用蛋白（TRAIP）在人三陰性乳癌（TNBC）中的表達及其對細胞增殖和侵襲遷移的影響。

方法 應用免疫組化方法，檢測75例TNBC癌及癌旁組織中TRAIP的表達，并分析其與病人臨床病理特征的關系。采用Western blot技術檢測人TNBC細胞系MDA-MB-468、MDA-MB-231及HCC1937中TRAIP的表達水平。構建TRAIP慢病毒干擾載體并檢測干擾效率。應用3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯四唑溴化銨（MTT）和Celigo細胞計數方法檢測細胞增殖能力，Transwell侵襲實驗和創面愈合法檢測細胞的侵襲遷移能力。

結果 TNBC組織中TRAIP的表達水平明顯高于癌旁組織（Z=－6.460，P<0.001）；與原發灶相比，淋巴結轉移灶中TRAIP呈高表達（Z=－3.448，P<0.001），并且這種高表達水平與腫瘤的復發密切相關（Z=－2.077，P<0.05）。Western blot檢測顯示，MDA-MB-231和HCC1937細胞株TRAIP蛋白表達均顯著高于MDA-MB-468細胞（F=34.96，P<0.01）；TRAIP基因敲除后，MDA-MB-231和HCC1937細胞中TRAIP的蛋白表達水平被明顯抑制（t=15.66、19.39；P<0.01）。相較于對照組，TRAIP基因敲除組細胞的增殖能力明顯減弱（F=71.63～218.07，P<0.01）；Transwell侵襲及創面愈合實驗表明，TRAIP基因敲除顯著抑制細胞的侵襲遷移能力（t=7.39～32.16，P<0.01）。

結論 TRAIP在TNBC組織及淋巴結轉移灶中高表達并與腫瘤的復發密切相關，敲除TRAIP基因可顯著抑制細胞的增殖、侵襲遷移等生物學特性。

［關鍵詞］ 腫瘤壞死因子受體相關因子相互作用蛋白；三陰性乳腺癌；基因沉默；細胞增殖；腫瘤浸潤

［中圖分類號］ R737.9

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）01-0021-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.012

［網絡出版］ https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20230303.1118.006.html;2023-03-06 10：52：13

EFFECTS OF SILENCING TRAIP GENE ON PROLIFERATION， INVASION， AND MIGRATION OF TRIPLE-NEGATIVE BREAST CANCER CELLS

ZHENG Yan， WANG Ping， WANG Xiao， LIU Litong，? CHEN Zhaoxu， WANG Chengqin

（Department of Pathology，? School of Basic Medicine，? Qingdao University， Qingdao 266071，? China）

; ［ABSTRACT］ ?Objective ?To study the expression of tumor necrosis factor receptor-associated factor-interacting protein （TRAIP） in human triple-negative breast cancer （TNBC） and its role in cell proliferation， invasion， and migration.

Methods

We measured the expression of TRAIP in the cancer and paracancerous tissues from 75 cases of TNBC by immunohistochemistry， and analyzed its relationship with patients clinicopathological features. Western blot was used to determine the expression of TRAIP in human TNBC cell lines （MDA-MB-468， MDA-MB-231， and HCC1937）. We constructed a lentiviral vector targeting TRAIP， and measured its interference efficiency. Cell proliferation was determined using 3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide （MTT） and Celigo cell counting assays. Cell invasion and migration was measured by Transwell and wound healing assays.

Results ?The expression level of TRAIP was significantly higher in TNBC tissues than in paracancerous tissues （Z=-6.460，P<0.001）， and significantly higher in lymph node metastases than in primary foci （Z=-3.448，P<0.001）. A high TRAIP level was closely associated with tumor recurrence （Z=-2.077，P<0.05）. The protein levels of TRAIP in the MDA-MB-231 and HCC1937 cell lines were significantly higher than that in the MDA-MB-468 cell line （F=34.96，P<0.01）. After knocking out the TRAIP gene， the protein expression of TRAIP in the MDA-MB-231 and HCC1937 cell lines were significantly inhibited （t=15.66，19.39;P<0.01）. Compared with the control group， the TRAIP knockout group showed significantly decreased cell proliferation （F=71.63-218.07，P<0.01） and significantly reduced cell invasion and migration （t=7.39-32.16，P<0.01）.

Conclusion ?TRAIP is highly expressed in TNBC tissues and lymph node metastases， and is closely related to tumor recurrence. Silencing the TRAIP gene can significantly inhibit cell proliferation， invasion， and migration.

［KEY WORDS］ ?tumor necrosis factor receptor-associated factor interaction protein; triple negative breast neoplasms; gene silencing; cell proliferation; neoplasm invasiveness

乳癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，是女性癌癥死亡的主要原因［1-2］。三陰性乳癌（TNBC）作為乳癌的一種亞型，是指人表皮生長因子受體2（HER2）、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）表達陰性的乳癌［3-4］。TNBC病人不能從內分泌治療和HER2靶向治療中獲益，導致更高的復發率、轉移率和死亡率［5-6］。因此，對TNBC新的治療靶點和靶向藥物的研究成為國內外研究的熱點［7］。腫瘤壞死因子受體相關因子相互作用蛋白（TRAIP）是一種大小為53 000的E3泛素蛋白連接酶，包含3個結構域，分別是N端附近的RING結構域、假定的卷曲螺旋結構域（coiled-coil）和亮氨酸拉鏈（leucine zipper）結構域［8-9］。相關研究表明，TRAIP參與多種細胞過程，包括細胞增殖、DNA損傷應答、有絲分裂和胚胎發育［10-14］。CHAPARD等［15］研究結果顯示，TRAIP位于有絲分裂染色體附近，通過紡錘體裝配檢查點調控有絲分裂過程。PARK 等［16］創建了TRAIP缺陷小鼠，發現由于早期胚胎發育遲緩，導致這些小鼠很快死亡。用慢病毒介導的shRNA沉默TRAIP，可強烈抑制人角質形成細胞的增殖并導致細胞周期阻滯［17］。此外，TRAIP的失活將導致核苷酸嚴重破壞，從而危及基因組的穩定性，表明TRAIP是哺乳動物復制應激反應網絡的重要組成部分［18-19］。因此，TRAIP在生物學過程中發揮著極其重要的作用，為腫瘤的發生發展奠定了細胞學基礎。然而，TRAIP基因在TNBC中的表達及潛在作用尚不清楚。本研究擬探討TRAIP在TNBC中的表達及其臨床意義，并探討TRAIP基因敲除對TNBC細胞增殖和侵襲遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 標本收集

收集青島大學附屬醫院2013—2015年外科手術切除的75例女性新鮮原發性TNBC組織及其癌旁非瘤組織（距腫瘤邊緣＞2 cm），石蠟包埋切片均來自青島大學附屬醫院病理科。所有病人術前均未接受化療或放療并且臨床病理資料完整。本研究經青島大學附屬醫院醫學倫理委員會審核通過，相關臨床資料獲取均獲得所有病人書面同意。

1.2 實驗材料

所用人TNBC細胞MDA-MB-468、 MDA-MB-231和HCC1937購自中國科學院（中國上海）；胎牛血清購自美國 HyClone公司，DMEM培養液購自美國Gibco公司；TRAIP抗體購自美國proteintech公司；β-actin抗體購自武漢云克隆科技股份有限公司；羊抗兔二抗購自上海翌圣生物科技股份有限公司；Sh-TRAIP病毒和Sh-NC病毒均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯四唑溴化銨（MTT）購自上海鼎國生物技術有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自上?；瘜W試劑有限公司；凋亡試劑盒購自上海賽默飛世爾科技有限公司；Caspase3/7試劑盒購自美國Promega公司；Transwell小室購自美國 Corning公司，Matrigel基質膠購自美國BD生物技術公司；結晶紫粉末購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 免疫組織化學染色檢測組織中TRAIP的表達 將石蠟標本切片脫蠟、梯度乙醇水化，加入體積分數0.03的過氧化氫溶液滅活內源性過氧化物酶，以微波加熱進行抗原修復，再使用山羊血清封閉15 min，加入TRAIP一抗（1∶300稀釋，4 ℃，過夜）和二抗（1∶100稀釋，37 ℃，30 min）孵育。切片用二氨基聯苯胺（DAB）染色，蘇木精復染。以PBS為陰性對照。根據染色強度和腫瘤細胞陽性比例之和進行半定量評分。染色強度評分：0分，無著色；1分，著色較弱；2分，著色中等；3分，著色較強。陽性細胞比例評分：0分，無陽性細胞；1分，陽性細胞＜1/100；2分，1/100≤陽性細胞＜1/10；3分，1/10≤陽性細胞＜1/3；4分，1/3≤陽性細胞＜2/3；5分，陽性細胞≥2/3。以染色強度評分和陽性細胞比例評分相加作為總分，總分為0～8分［20］。

1.3.2 細胞培養 將人TNBC細胞株MDA-MB-468、MDA-MB-231以及HCC1937置于含有體積分數0.10胎牛血清和10 g/L青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養液中，在37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱中常規培養，取處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.3 慢病毒感染和細胞篩選 LV3-NC和LV3-hsa-TRAIP-318慢病毒載體由吉瑪公司構建，取處于對數生長期的MDA-MB-231和HCC1937細胞接種至6孔板中常規培養，待細胞達到60%～70%融合時進行慢病毒轉染，

培養24～36 h后，用濃度為1 mg/L

的嘌呤霉素篩選穩定轉染的細胞。用于敲除TRAIP的目的序列為GGAGGAGAATGTC-TTGGATGC，對照組序列為TTCTCCGAACGT-GTCACGT。將轉染LV3-NC病毒的細胞作為Sh-NC組，將轉染LV3-hsa-TRAIP-318沉默病毒的細胞作為Sh-TRAIP組。

1.3.4 Western blot方法檢測細胞中TRAIP蛋白的表達 應用RIPA裂解液在冰上充分裂解細胞，提取MDA-MB-231細胞和HCC1937細胞蛋白，取25 μg蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，300 mA轉膜2 h將蛋白轉至PVDF膜上，室溫下用50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗TRAIP（1∶1 000）和β-actin（1∶4 000）4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗（1∶4 000）室溫孵育2 h，重復TBST洗膜步驟，最后加入ECL化學發光工作液室溫孵育1～2 min，暗室中顯影并用Image J軟件分析條帶灰度值。以灰度值表示蛋白表達量。

1.3.5 Celigo細胞計數 將感染慢病毒的MDA-MB-231和HCC1937細胞分別接種于96孔板，每孔2 000個細胞，每組設置6個復孔，培養體系為100 μL/孔。從第2天開始進行Celigo讀數，連續讀數5 d。

1.3.6 MTT實驗檢測細胞活性 將Sh-NC組和Sh-TRAIP組的細胞以每孔2 000個密度接種在96孔板上，每組重復6孔。細胞在37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱中常規培養1～5 d，每孔加入20 μL的MTT（5 g/L）溶液孵育2 h，棄去上清液，每孔中加入DMSO溶液150 μL，低速震蕩10 min，用酶標儀檢測490 nm波長處光密度（OD）值。以OD值表示細胞活性。

1.3.7 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲及遷移能力 使用24孔板進行侵襲實驗，每孔7×104個細胞懸浮在無血清培養液中，并裝載到涂有基質凝膠的腔室的上腔室，下腔室裝載含有高濃度的血清培養液，光鏡下觀察到有細胞穿過終止培養，室溫下甲醛固定20 min，結晶紫染色5 min。顯微鏡隨機計數5個視野內入侵細胞數量。遷移實驗則是在小室上腔不涂基質凝膠。

1.3.8 創面愈合實驗檢測細胞遷移能力 當6孔培養板的細胞密度達到90%左右時，用200 μL的黃色無菌槍頭制造創面。用PBS輕輕沖洗細胞以去除脫落的細胞，加入無血清培養液進一步培養。分別于培養0、24 h后在顯微鏡下拍照計算創面相對寬度。

以上所有實驗均獨立重復3次。

1.4 統計學分析

采用Graphpad Prism 8.0和SPSS 23.0軟件進行統計學分析。正態分布計量數據以±s表示，兩組均數比較采用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析；Celigo細胞計數和MTT實驗結果的比較采用兩因素析因設計的方差分析；TRAIP與臨床病理資料的關系分析采用Wilcoxon檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結? 果

2.1 TNBC組織及其癌旁組織TRAIP表達比較

免疫組織化學染色顯示，TRAIP陽性染色主要定位于細胞核和細胞質，其在癌組織中的表達顯著高于相應的癌旁組織（Z=－6.460，P<0.001）。與對應的原發灶相比，TRAIP在淋巴結轉移灶中的表達水平較高（Z=－3.448，P<0.001）；TRAIP表達與病人的復發密切相關（Z=－2.077，P<0.05）。TRAIP的表達與病人年齡、腫瘤大小、組織學分級及血管侵犯無相關性（P>0.05）。見表1。

2.2 TNBC細胞系中TRAIP蛋白表達

Western blot檢測結果顯示，MDA-MB-231細胞和HCC1937細胞株的TRAIP蛋白表達水平均顯著高于MDA-MB-468細胞（F=34.96，P<0.01），而MDA-MB-231與HCC1937細胞株TRAIP蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。因此選擇MDA-MB-231和HCC1937來沉默TRAIP表達。Western blot檢測顯示，與對照組相比，MDA-MB-

231和HCC1937細胞中TRAIP的蛋白表達均被明顯抑制（t=15.66、19.39， P<0.01）。見圖1。

2.3 沉默TRAIP對TNBC細胞增殖能力的影響

Celigo細胞計數實驗結果顯示，沉默TRAIP對TNBC細胞系MDA-MB-231和HCC1937細胞株增殖能力影響的組別與時間之間存在交互效應（F=71.63、218.07，P<0.01）；單獨效應分析顯示，與Sh-NC組相比，Sh-TRAIP組MDA-MB-231和HCC1937細胞的數目明顯受到抑制（F=533.65、681.47，P<0.01）。MTT實驗結果表明，TRAIP敲降后對MDA-MB-231和HCC1937細胞增殖能力影響的組別與時間之間存在交互效應（F=149.40、146.28，P<0.01）；單獨效應分析顯示，Sh-TRAIP組MDA-MB-231和HCC1937細胞活力較Sh-NC組顯著降低，差異均具有統計學意義（F=823.52、487.25，P<0.01）。見表2～5。

2.4 TRAIP沉默對腫瘤細胞侵襲與遷移的影響

Transwell侵襲實驗結果顯示，MDA-MB-231細胞中Sh-NC組的細胞數量為839.74±69.54，Sh-TRAIP組為156.96±77.98；HCC1937細胞中Sh-NC組的細胞數量為1 183.96±184.41，Sh-TRAIP組為274.56±71.68，差異具有顯著性（t=32.16、24.61，P<0.01）。創面愈合實驗結果顯示，MDA-MB-231細胞中Sh-NC組的相對寬度為0.89±0.04，Sh-TRAIP組為0.48±0.03；HCC1937細胞中Sh-NC組的相對寬度為0.86±0.06，Sh-TRAIP組為

0.56±0.03，差異有顯著性（t=16.97、7.39，P<0.01）。

3 討? 論

根據美國癌癥協會2019年的統計數據，乳癌是

女性最常見的癌癥，是僅次于肺癌的第二大癌癥相關死亡原因［21］。基因表達譜分析顯示，大約有56%的TNBC和基底樣乳癌基因表達譜重疊，因此通常認為TNBC是基底樣乳癌的一種亞型［22］。與激素受體陽性或HER2陽性乳癌相比，TNBC病人的生存時間較短，診斷后5年內病死率為40%［23］。不

同于其他類型乳癌主要轉移到骨骼和軟組織，TNBC最重要的特點是高度增殖以及頻繁地轉移到肺和腦［24］?？傮w來說，TNBC具有侵襲性更高、發病年齡更早、轉移潛能更大、臨床結局更差、復發率更高、生存率更低等特點［25］。靶向治療因具有特異性高、副作用小等獨有的優越性已經成為乳癌治療領域的研究熱點［26-27］。但是由于導致TNBC復發的分子機制尚未完全闡明，所以目前尚無明確的內分泌及靶向治療方案。因此，研究TNBC的新治療靶點和靶向藥物已成為國內外亟待解決的熱點問題。

泛素化被認為是一種保守的翻譯后蛋白修飾，主宰蛋白質的命運，參與增殖、分化、凋亡或炎癥等多種生物學功能［28-29］。TRAIP是一種復制體相關的E3泛素蛋白連接酶［30］，研究發現TRAIP定位于DNA損傷位點，缺乏TRAIP的細胞會表現出典型的DNA損傷反應缺陷表型［31］。GUO等［32］首次發現TRAIP在肝細胞癌病人中表達上調，并在肝癌細胞中表現出致癌性特征，與預后呈負相關。本文研究結果顯示，TRAIP在TNBC組織中高表達，在淋巴結轉移灶中的表達明顯高于原發灶；分析TRAIP在TNBC中的表達與臨床病理特征之間的關系發現，TRAIP表達與腫瘤復發和淋巴結轉移呈正相關。因此推測TRAIP可能促進TNBC的增殖及侵襲遷移。

以往研究表明，TRAIP在調節腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移中發揮了重要的作用。促進TRAIP的表達，會增強肺癌細胞的增殖、遷移以及侵襲能力［33］。HARLEY等［34］認為TRAIP是有效的細胞周期進展所必需的，TRAIP的突變限制了細胞增殖，可能是小頭癥和侏儒癥潛在的發病機制。在人表皮角質形成細胞中，TRAIP可抑制細胞增殖，并誘導細胞周期G1/S期阻滯［17］。TRAIP可通過多聚泛素化促進骨肉瘤細胞KANK1的降解，下調IGFBP3并激活AKT通路來調節骨肉瘤細胞的增殖和侵襲［35］。本文研究MTT和Celigo細胞計數實驗結果表明，MDA-MB-231和HCC1937細胞中TRAIP基因敲除可以顯著抑制TNBC細胞的增殖能力；Transwell侵襲和創面愈合實驗表明，敲低TRAIP基因可顯著抑制細胞的侵襲和遷移。提示TRAIP可能與TNBC的發生發展密切相關。但是其分子機制尚待進一步探討。

綜上所述，TRAIP在TNBC組織及淋巴結轉移灶中高表達，其高表達與腫瘤的復發等不良預后密切相關；敲低TRAIP能夠顯著抑制TNBC細胞的增殖、侵襲及遷移能力，其具體的作用機制有待進一步深入探究。TRAIP可能成為評估TNBC發生發展的重要生物標志物，也有可能成為治療TNBC的新型分子靶標。

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（本文編輯 黃建鄉）