CBA法檢測成人血清sCD25濃度及正常參考值范圍

強茂 孫青菊 李尚勇 許苗

［摘要］ 目的 應用流式微球分析（CBA）法測定表觀健康成年人血清中可溶性白細胞介素2受體（sCD25）濃度，初步建立應用CBA法檢測sCD25的正常參考值范圍。

方法 按照《臨床實驗室檢驗項目參考區間的制定》和《臨床化學檢驗血液標本的收集與處理》標準，篩選血常規和生化指標在正常參考區間內的健康體檢成年人（24～65歲）血清樣本204例。根據年齡和性別分成兩組，其中青年組（24～40歲）、中年組（41～65歲）各102例，兩組男性、女性各51例。應用CBA方法檢測各標本血清中sCD25水平，采用±1.96s方法計算雙側95%的正常參考值范圍。

結果 青年組和中年組血清中sCD25濃度比較差異無統計學意義（P>0.05），相同年齡段不同性別健康成人血清中sCD25濃度比較差異無統計學意義（P>0.05）。204例健康成人血清中sCD25濃度呈正態分布，平均值為（812.93±214.32）ng/L；雙側95%正常參考值范圍393.87～1 233.00 ng/L。

結論 本研究應用CBA方法初步建立了人血清sCD25濃度正常參考值，為sCD25指標在臨床相關疾病方面的應用奠定了基礎。

［關鍵詞］ 流式微球分析法；白細胞介素2；參考值

［中圖分類號］ R446.6

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）01-0047-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.034

［網絡出版］ https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20230308.1410.024.html;2023-03-10 10：12：43

CLINICAL APPLICATION OF CBA METHOD IN MEASURING ADULT SERUM SCD25 AND ESTABLISHMENT OF REFERENCE INTERVAL FOR HEALTHY PEOPLE

QIANG Mao， SUN Qingju， LI Shangyong， XU Miao

（School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］ ?Objective ?To determine the concentration of soluble interleukin-2 receptor （sCD25） in the serum of healthy adults by cytometric bead array （CBA）， and to preliminarily establish the normal reference interval of sCD25.

Methods ?Accor-

ding to the standards of “Formulation of Reference Interval of Clinical Laboratory Test Items” and “Collection and Processing of Blood Samples for Clinical Chemical Test”， 204 serum samples of healthy adults （24-65 years old） whose blood routine and biochemical indices were within the normal reference interval were screened. They were divided into two groups according to age and sex， including 102 subjects in 24-40 years group （youth group） and 102 subjects in 41-65 years group （middle age group）， with 51 males and 51 females in each group. The CBA method was used to measure serum sCD25 concentration， and the ±1.96s method was used to calculate the 95% normal reference interval on both sides.

Results ?There was no significant difference in serum sCD25 concentration between the youth group and the middle age group （P>0.05） and between males and females in the same age group （P>0.05）. The serum sCD25 concentrations of 204 healthy adults were normally distributed， with a mean of （812.93±214.32） ng/L， and the bilateral 95% normal reference interval was 393.87-1 233.00 ng/L.

Conclusion ?In this study， the CBA method is used to preliminarily establish a normal reference value of human serum sCD25， which lays a foundation for the application of sCD25 index in clinical related diseases.

［KEY WORDS］ ?cytometric bead array; interleukin-2; reference values

白細胞介素2受體（IL-2R）是由α（CD25）、β（CD122）和γ（CD132）3個亞基組成的復合型的糖蛋白，其中IL-2Rα除可以表達于T淋巴細胞表面，也可以經蛋白水解酶酶切釋放到血液中，以可溶性白細胞介素2受體（sCD25）存在［1-2］。目前研究發現，sCD25濃度檢測在血液病、感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤以及器官移植等診斷、病情監測及治療效果評價方面具有參考價值［1-10］。本文旨在建立流式微球分析（CBA）方法檢測成人血清sCD25的正常值范圍，為sCD25指標用于臨床相關疾病研究和病情評估提供參考價值。

1 資料和方法

1.1 樣本來源及分組

樣本來自青島大學附屬醫院黃島院區檢驗科，為當天體檢人群中篩選出的血清標本。樣本篩選參考《臨床實驗室檢驗項目參考區間的制定》和《臨床化學檢驗血液標本的收集與處理》規范［11］。納入標準為：血常規及生化、肝腎功能各項指標均在正常參考值范圍內；排除妊娠及有疾病史者；體檢報告最終結論健康者。將收集的樣本采用偏差法剔除離群樣本，最后篩選出204例樣本，年齡分布24～65歲，其中24～40歲（青年組）、41～65歲（中年組）各102例，兩組男性、女性各51例。

1.2 試劑及儀器

sCD25 LEGENDplexTM檢測試劑盒購于美國BIOLEGEND公司；雙激光四色流式細胞儀來自杭州艾森生物（Novo Cyte D2040R）；渦旋儀和振蕩器來自美國賽洛捷克（SCILOGEX）。

1.3 CBA檢測方法

1.3.1 樣本預處理 采集符合納入標準的體檢人群血清樣本，使用無酶、低吸附、無熱源的EP管分裝（500 μL），以1 000? r/min離心10 min，取樣當天進行檢測。

1.3.2 流式細胞儀樣本檢測模板建立 首次使用sCD25 LEGENDplexTM檢測試劑盒，需要在流式細胞儀上建立實驗模板，繪制兩張散點圖和一張柱形圖。①第一張散點圖，橫坐標、縱坐標分別設置為前向散射光（FSC）和側向散射光（SSC），將空白微球渦旋混勻30 s后加入流式管中，在流式細胞儀采樣的過程中，通過調節FSC和SSC的電壓和增益將微球團塊調節出來，并且使其清晰地位于散點圖橫縱坐標8×104～32×104之間的位置，通過圈門和設置閾值的方式降低雜信號對目標微球的干擾。將柱形圖的橫坐標設置成別藻藍蛋白（APC），用以顯示E1門內成分。②第二張散點圖參數設置：因試劑中使用APC和藻紅蛋白（PE）熒光物質，故第二張散點圖的橫坐標、縱坐標分別設置為PE和APC，坐標軸采用對數函數的放大形式，將PE微球渦旋混勻30 s后加入流式管，在流式細胞儀采樣的過程中，通過調節APC和PE的電壓和增益，將APC和PE熒光強度的范圍顯示在散點圖的橫縱坐標10～106范圍之內。③根據軟件的分析要求，設置停止條件（事件數300個）并保存實驗模板。

1.3.3 標準曲線和待測樣本的制備 將sCD25試劑盒恢復至常溫（20～25 ℃），根據說明書將250 μL的實驗緩沖液加入標準品凍干粉瓶中，將標準品凍干粉充分溶解（液體澄清無肉眼可見顆粒）。根據試劑盒說明書中sCD25標準品濃度，設置標準品凍干粉溶解后sCD25濃度為50 000 ng/L。將sCD25最高濃度50 000 ng/L的標準品進行4倍梯度稀釋，經過6次稀釋，加上空白對照管，最后獲得8個濃度梯度。將5 mL的實驗緩沖液加入基質B凍干粉中，渦旋震蕩使其完全溶解。

1.3.4 標準曲線及樣本制備和分析 ①向8支標準品流式管中分別加入25 μL的基質B溶液，樣本管加入25 μL實驗緩沖液。②向8支標準品流式管和樣本管中分別加入25 μL濃度為1×的捕獲微球抗體懸液。③分別吸取標準曲線8個濃度標準液25 μL，按濃度順序加入8支流式管中，樣本管中加入25 μL的待測樣本（血清）。④上述步驟結束后，將所有流式管放在震蕩器上，室溫（20～25 ℃）、避光、200? r/min震蕩2 h。⑤孵育2 h以后，向所有流式管中加入500 μL濃度為1×洗滌緩沖液（Wash Buffer），渦旋流式管10 s后，將流式管置于室溫離心機中以500 r/min離心5 min，棄上清。然后再向上述所有的流式管中分別加入25 μL的檢測抗體，放在震蕩器上以200 r/min，室溫（20～25 ℃）避光震蕩1 h。⑥孵育1 h后，分別向所有流式管中加入25 μL的PE，放在震蕩器上以200 r/min，室溫下避光震蕩30 min。⑦避光孵育結束后，向所有流式管中加入500 μL的1×洗滌緩沖液（Wash Buffer），渦旋流式管10 s之后，將流式管置于室溫離心機中以1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入150 μL的1×洗滌緩沖液，將樣本管渦旋20 s后，打開流式細胞儀的實驗模板上機檢測。⑧將上機結果導出3.0版本的FCS文件，再通過LEGEND plex V8.0分析軟件來擬合標準曲線。

1.4 統計學處理

使用SPSS 17.0軟件進行統計學處理，符合正態分布的計量資料數據以±s形式表示，數據間比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。采用±1.96s方法計算血清sCD25雙側95%的正常參考值范圍。

2 結? 果

2.1 不同年齡健康成人血清sCD25濃度比較

青年組和中年組血清sCD25濃度差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 不同性別健康成人血清sCD25濃度比較

青年組和中年組男性和女性血清中sCD25濃度差異均無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 健康成人血清sCD25的參考區間

青年組和中年組合計204例健康成人血清中sCD25的濃度呈正態分布，其平均值為（812.93±214.32）? ng/L，SCD25濃度的95%雙側正常參考值范圍為393.87～1 233.00 ng/L。

3 討? 論

sCD25作為免疫監測的重要指標，與多種疾病的診斷、治療和預后關系密切。王穎超等［12］對兒童噬血細胞性淋巴組織細胞增生癥（HLH）外周血中sCD25的表達研究顯示，血清sCD25表達水平對于HLH具有診斷意義。LUN 等［10］研究顯示，外周血sCD25濃度或可成為肝移植術后識別排斥的診斷指標。ZHANG 等［1］研究表明，血清sCD25是系統性紅斑狼瘡病人疾病活動性的標志和腎臟疾病的預測指標。這些研究表明，人血清中sCD25的表達水平與多種疾病的發病、病情進展及治療效果都具有密切的關系。因此，建立sCD25正常參考值在臨床應用方面具有重要的意義。

CBA方法以微球作為載體，其免疫反應原理與“雙抗夾心”或“三明治夾心”法相似［13-14］。CBA檢測時，將捕獲微球抗體與待測物質共同孵育后再加入生物素標記的檢測抗體，從而形成“雙抗夾心”復合物，再加入鏈霉素標記的PE熒光素，借助于鏈霉素和生物素結合的方式實現PE對檢測抗體標記，應用流式細胞儀對檢測抗體上標記的PE熒光信號進行檢測，通過PE熒光強度可間接反映待測物的濃度［14］。近年來CBA方法在免疫指標檢測領域正逐漸得到推廣和使用。相比傳統的免疫檢測方法ELISA方法來說，CBA方法具備以下優勢：樣本制備步驟少，可減少人為操作步驟，降低人為操作失誤［15］；CBA試劑批間和批內的變異系數小［13，16-17］，精密度和準確度高；CBA方法檢測靈敏度高而且線性范圍廣［14-15，18］；檢測所需的樣本量少，只需要25～

50 μL血清或者血漿，樣本容易獲取而且適用范圍廣［14-15，17，19-20］；檢測借助于流式細胞儀，無需配備專門的儀器，應用成本相對低［21］；樣本制備時間短，可實現多指標同步檢測，檢測效率高，更適用于臨床樣本等處理［13，17-18］。

本文對成年健康人群血清中的sCD25檢測顯示，青年和中年人群sCD25濃度差異無統計學意義，男性和女性sCD25濃度差異也無統計學意義，成年健康人群血液中sCD25的95%正常參考值范圍為393.87～1 233.00 ng/L。ZHANG等［1］應用ELISA方法檢測92例年齡>16歲的健康人血液中sCD25的水平，結果顯示其95%參考值為448.5～1 279.9? ng/L。本文檢測結果顯示，青年組和中年組204例健康成人血清中sCD25的95%雙側正常參考值范圍（393.87～1 233.00? ng/L）與其結果相近。CABRERA? 等［8］應用ELISA方法對美國蓋恩斯維爾市血庫30例年齡不詳、男女數量各半的正常血樣檢測顯示，正常對照組sCD25數值為（2 953±378）ng/L，高于本文成年健康人群的sCD25數值。DOWNES 等［22］應用ELISA方法檢測來自Cambridge BioResource （CBR）的80例成年健康人血中sCD25平均值為3 356? ng/L，高于本文成年健康人群血清sCD25濃度。以上研究成年健康人血清中sCD25水平差異較大，原因除了檢測方法差異外，可能主要是由于種族和地域差異較大所致。因此，建立和使用本地區成年健康人群sCD25參考區間對疾病輔助診斷和病情監測具有參考價值。

本文研究由于體檢人群中未成年人群（＜18歲）和老年人群（>66歲）的樣本較少，未對未成年人和老年人群sCD25數據進行分析。有研究顯示，老年人血液中sCD25濃度較其他年齡段人群高［23］。本文研究結果顯示，不同性別和年齡正常人群血液中sCD25濃度差異無統計學意義，但是由于本文樣本數量及人群分布所限，所得結論不能完全反映年齡及性別因素對健康人血清sCD25的影響。后續研究繼續收集健康體檢人群的樣本，以對sCD25的正常參考值范圍做進一步研究。

綜上所述，不同年齡段（青年組和中年組）健康成人血清中sCD25濃度差異無統計學意義，相同年齡段不同性別健康成人血清中sCD25濃度差異也無統計學意義；青年組和中年組204例健康成人血清中sCD25的95%雙側正常參考值范圍393.87～1 233.00? ng/L。本文使用CBA方法檢測sCD25的正常值范圍，為sCD25指標在臨床相關疾病研究和病情的判斷方面初步奠定了基礎。

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（本文編輯 黃建鄉）