雷公藤甲素調控p53/SLC7A11 軸誘導結腸癌細胞鐵死亡

徐嘉韓 陸新剛

結直腸癌是常見且高發的惡性腫瘤，其發病率和死亡率居高不下[1]。2020 年全球新發結直腸癌病例超過188 萬例，居惡性腫瘤第三位[2]。結腸癌在中老年人群中發病率較高，已有超過直腸癌的趨勢[3]。目前結腸癌的治療策略是手術切除聯合術后輔助化療。隨著中醫藥在腫瘤領域的不斷發展，結腸癌手術聯合放化療期間適時介入中醫辨證施治，可減輕放化療毒副作用，提高手術療效[4]。雷公藤甲素作為傳統中藥雷公藤的主要有效成分，是一種三環氧二萜內酯類單體化合物，又名雷公藤內酯醇[5]。相關研究表明，雷公藤甲素具有免疫調節、抗炎、抗腫瘤等多種生物學活性[6]。在腫瘤應用領域，雷公藤甲素抗癌活性具有廣譜、高效的特點，可抑制包括宮頸癌、結腸癌、乳腺癌、白血病、胰腺癌及前列腺癌等多種惡性腫瘤細胞的生長[7-8]。而目前雷公藤甲素對結腸癌的抗癌機制尚未十分明確，本研究通過探討雷公藤甲素抗結腸癌的分子機制，為臨床應用提供理論依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 細 胞 人結腸癌細胞（HCT116）購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 主要試劑 雷公藤甲素（批號HY-32735）購自美國MCE 公司；胎牛血清（批號16140089）、McCoy's 5A 培養基（批號16600082）購自美國賽默飛公司；丙二醛（MDA）試劑盒（批號JL-T0761）、Fe2+離子檢測試劑盒（批號JL-T1118）和還原型谷胱甘肽（GSH）含量試劑盒（批號JL-T0906）均購自上海江萊生物；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）（批號M8650）購自北京索萊寶科技有限公司；一抗p53（批號2527S）、SLC7A11（批號98051S）、β-actin（批號4970S）抗體均購自美國CST 公司。

1.1.3 主要儀器 高速冷凍離心機（型號：Sorvall Legend Micro）、酶標儀（型號：LabServ K3）購自美國賽默飛公司；電泳儀（型號：165-8033）、轉印槽（型號：170-3930）購自美國Bio-Rad 公司；熒光倒置顯微鏡（型號：TiS）購自日本尼康公司；流式細胞儀（CytoFlex S）超速離心機（Optima XPN-100）購自美國Beckman 庫爾特公司。

1.2 細胞培養與分組 HCT116 細胞鋪于T25 細胞培養瓶中，使用含10%胎牛血清的McCoy's 5A 培養基，在5% CO2、37 ℃條件下培養。使用雷公藤甲素（0、1、2、5、10、20、40、80、160 nmol/L）干預HCT116細胞，分為對照組和雷公藤甲素組，每組設3 個復孔。

1.3 CCK-8 檢測 取對數生長期（80%細胞融合度）的HCT116 細胞接種于96 孔板中（5×103/孔），按實驗方案干預后加入CCK-8 溶液，CO2培養箱孵育2 h，去上清后加入二甲基亞砜（DMSO），最后使用酶標儀檢測450 nm 處的吸光度。數據分析，HCT116 細胞活力（%）=（OD450實驗組-空白組）/（OD450對照組-空白組）×100%。

1.4 EdU 細胞增殖檢測 取對數生長期的HCT116細胞接種于96 孔板中（5×103/孔）。采用胸腺嘧啶核苷類似物（EdU）試劑A 標記細胞，孵育2～4 h 后在4%多聚甲醛中固定30 min，并用0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）通透10 min，最后在Apollo 染色反應液中37 ℃避光條件下孵育30～60 min，熒光倒置顯微鏡下觀察細胞增殖活性。

1.5 平板克隆實驗 取對數生長期的HCT116 細胞，胰蛋白酶消化并吹打成單細胞懸液，細胞計數后以500 個細胞/孔的密度接種于培養皿，繼續培養到14 d 后進行結晶紫染色，拍照。

1.6 鐵死亡相關指標檢測 取對數生長期的HCT116 細胞，根據實驗方案干預細胞，根據生化檢測試劑盒說明書步驟，測定細胞中Fe2+、GSH、MDA含量。

1.7 ROS 檢測 2'，7'-二氫二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）法檢測ROS 水平。取對數生長期的HCT116 細胞，使用DCFH-DA 熒光探針標記HCT116 細胞，DCFH 可被細胞中ROS 氧化生成熒光物質2'，7'-二氯熒光素（DCF），應用流式細胞儀檢測DCF 熒光強度。

1.8 線粒體膜電位檢測 配置JC-1 染色工作液，加入1 mL 工作液至6 孔板中，與鋪板細胞充分混勻，在CO2培養箱中37 ℃孵育20 min。孵育結束后，在熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.9 Western blot 檢測 使用RIPA（強效）裂解液裂解HCT116 細胞，收集細胞總蛋白進行2-2-聯喹啉-4、4 二甲酸二鈉（BCA）法蛋白定量。蛋白經過十二烷基？酸鈉-聚內烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠電泳分離后轉移至聚偏二氟乙烯（PDVF）膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后與一抗（p53，1 ∶1000，SLC7A11，1∶1000，β-actin，1∶1000，）在4 ℃搖床孵育過夜，最后與偶聯辣根過氧化物酶的二抗（1∶10000）反應1 h，通過ECL 增強型化學發光試劑顯影條帶。

1.10 統計學方法 應用SPSS 26.0 軟件統計分析，使用GraphPad Prism 9.0 制作統計圖。計量資料符合正態分布以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組間數據比較采用獨立樣本t 檢驗，若方差同質性檢驗發現方差不齊采用Tamhane's T2 檢驗進行兩兩比較。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 雷公藤甲素抑制HCT116 細胞活力 不同濃度雷公藤甲素處理HCT116 細胞24 h，發現細胞活力成梯度依賴性降低（P＜0.05），見表1；其半抑制濃度（IC50）為47.82 nmol/L。

表1 不同濃度雷公藤甲素對HCT116 細胞活力的影響（%，）

表1 不同濃度雷公藤甲素對HCT116 細胞活力的影響（%，）

注：0，1，2，5，10，20，40，80，160nmol/L 為不同濃度雷公藤甲素干預24h；IC50=47.82 nmol/L；IC50 為半抑制濃度；與0 nmol/L 組比較，aP＜0.05

2.2 雷公藤甲素抑制HCT116 細胞增殖與克隆能力EdU 細胞增殖實驗發現，雷公藤甲素處理后，細胞增殖活性較對照組顯著降低（P＜0.05）（見圖1A）；同時平板克隆形成實驗顯示，雷公藤甲素可顯著抑制HCT116 細胞克隆形成能力（P＜0.05），見圖1B。

圖1 HCT116 細胞增殖與克隆能力檢測

2.3 雷公藤甲素誘導HCT116 細胞鐵死亡 鐵死亡相關指標檢測發現，雷公藤甲素處理后HCT116 細胞中Fe2+離子、MDA 水平升高，GSH 含量降低（P＜0.05）（見表2）；流式細胞術顯示，雷公藤甲素可顯著增加HCT116 細胞ROS 水平（P＜0.05），見圖2。

圖2 HCT116 細胞活性氧自由基ROS 水平檢測

表2 HCT116 細胞鐵死亡相關指標檢測（）

表2 HCT116 細胞鐵死亡相關指標檢測（）

注：對照組為常規條件培養24 h；雷公藤甲素組為40 nmol/L 雷公藤干預24 h；Fe2+為亞鐵離子；MDA 為丙二醛；GSH 為谷胱甘肽；與對照組比較，aP＜0.05

2.4 雷公藤甲素抑制HCT116 細胞線粒體膜電位細胞鐵死亡早期可出現線粒體膜電位下降，本研究采用JC-1 熒光探針檢測HCT116 細胞線粒體膜電位。在熒光顯微鏡下成功觀察到線粒體JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉變，證實雷公藤甲素可引起細胞線粒體膜電位下降。見圖3。

圖3 HCT116 細胞線粒體膜電位檢測（200X）

2.5 雷公藤甲素調控HCT116 細胞p53、SLC7A11蛋白表達 Western blot 結果顯示，與對照組相比，雷公藤甲素干預后HCT116 細胞p53 蛋白表達增加，SLC7A11 蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 Western blot 檢測HCT116 細胞p53、SLC7A11 蛋白表達注：對照組為常規條件培養24 h；雷公藤甲素組為40 nmol/L雷公藤干預24 h

3 討論

雷公藤甲素從1972 年首次分離以來，因其具備較強的免疫調節、抗炎和廣譜高效的抗腫瘤等多種藥理學活性而備受關注[8]。隨著雷公藤甲素藥理學機制研究的深入，已證實它可通過調控細胞周期、凋亡與自噬平衡、細胞遷移與侵襲、介導腫瘤免疫逃避等多種方式發揮抗癌作用[9]。本研究通過CCK-8 檢測發現，雷公藤甲素可明顯抑制HCT116 細胞活力，且呈濃度梯度依賴性，其半抑制濃度IC50 為47.82 nmol/L。EdU 細胞增殖檢測與平板克隆形成實驗進一步證實了雷公藤甲素可抑制HCT116 細胞增殖克隆能力。

鐵死亡是一種在Fe2+離子參與下，因鐵依賴性ROS 的異常堆積而發生脂質過氧化，最終引起細胞死亡的新型死亡方式[10]。細胞鐵死亡的形態學特征主要表現為線粒體皺縮、線粒體嵴減少或消失、線粒體外膜破裂及膜電位破壞[11]。相關研究顯示，鐵死亡參與多種腫瘤的發生發展，誘導腫瘤細胞鐵死亡可抑制其持續激活的增殖信號，促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤轉移，有望作為癌癥治療中的一個可以靶向的弱點[12]。基于此，本研究推測雷公藤甲素可能可誘導HCT116 細胞鐵死亡，抑制腫瘤細胞增殖與克隆。通過鐵死亡相關指標檢測發現，經雷公藤甲素處理后，HCT116 細胞Fe2+離子、MDA 水平及ROS 水平顯著升高，GSH 含量降低；并通過JC-1 探針成功觀察到HCT116 細胞線粒體膜電位下降。

鐵死亡受到細胞內多條信號通路嚴密調節，主要受到胱氨酸/谷氨酸逆轉運體（System xc-）和谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的嚴格調控[13]。System xc-作為細胞內重要的抗氧化體系，是由SLC7A11 和SLC3A2 組成的異二聚體，其中SLC7A11 亞基負責主要的轉運活性[14]。當System xc-體系遭受破壞可引起胱氨酸吸收降低，影響GSH 的合成，最終導致GPX4 的失活和脂質過氧化積累，從而促進鐵死亡[15]。抑癌基因p53 可以通過抑制 SLC7A11 的表達來增強鐵死亡[16]。為進一步詮釋雷公藤甲素誘導HCT116細胞鐵死亡的分子機制，本研究通過Western blot 實驗初步證實，雷公藤甲素可上調 HCT116 細胞p53 蛋白表達，從而抑制SLC7A11 蛋白豐度，促進鐵死亡的發生。

綜上所述，雷公藤甲素可通過調控p53/SLC7A11 軸誘導HCT116 細胞鐵死亡，抑制腫瘤持續激活的增殖與克隆能力。本研究雖局限于體外實驗，缺乏體內實驗相互佐證。