顱內動脈瘤術后中樞神經系統感染患者腦脊液病原菌分布藥敏試驗及耐藥基因分析

祖向陽 馮 森 馬 鵬

新鄉醫學院第三附屬醫院，河南 新鄉 453000

顱內動脈瘤（intracranial aneurysm，IA）指腦動脈管壁因先天缺陷、動脈硬化或炎癥等異常膨出，是蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）常見原因，文獻報道SAH 發生后致殘和致死率可達40%～50%，因此早期診斷和干預對改善IA 患者預后極為重要［1-3］。隨著醫學發展，血管內介入治療已逐漸成熟并取代外科夾閉術成為IA 治療首選方案，可根據病灶位置、形態及供血區域等具體情況合理選擇器材和策略，其效果和安全性均已獲得普遍認可［4］。中樞神經系統（central nervous system，CNS）感染是IA 患者介入術后常見并發癥且治療難度較大，可對手術效果和患者預后造成不利影響，甚至威脅患者生命安全［5-6］。隨著顱腦手術大范圍開展和抗生素不合理應用，近年來術后院內感染患者數量快速增加，其中CNS感染發生率達2.1%～10%，因不同地區醫療水平差異而變化［7-9］。植入物污染、術后引流或長期臥床等因素均可引起IA 介入術后CNS 感染，因其可直接導致腦組織炎癥和損傷，CNS 感染相較其他院內感染病情進展迅速且相對更為嚴重，對患者預后造成不利影響［10］。既往研究表明細菌耐藥性是影響抗感染治療效果的重要原因，因此明確細菌耐藥性及其作用機制對提升治療效果極為重要［11］。本研究主要探討IA術后CNS感染患者腦脊液病原菌分布、耐藥性以及抗菌治療方案，為改善患者預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020-03—2022-03 新鄉醫學院第三附屬醫院的IA介入術后CNS感染患者64例，其中男34 例，女30 例；年齡37～82（63.18±10.24）歲；IA 位置：前循環35 例，后循環29 例；術前Hunt-Hess分級：Ⅰ級19 例，Ⅱ級27 例，Ⅲ級14 例，Ⅳ級4 例。根據2017 年《中國神經外科重癥患者感染診治專家共識》診斷標準［12］，滿足以下①～④項者為臨床確診：①患者出現意識障礙和顱內壓增高表現，伴神經局灶性功能障礙或全身感染癥狀、體征；②CT或MRI等影像學檢查顯示腦組織水腫、腦室擴張或腦膜增厚等異常征象或占位性病變；③血常規示白細胞計數（WBC）＞10×109個/L 或中性粒細胞占比＞80%；④腰椎穿刺檢查顱內壓＞200 mmH2O（1 mm H2O=0.009 8 kPa），腦脊液呈黃色、渾濁或膿性，腦脊液WBC＞100×106個/L，葡萄糖含量＜2.6 mmol/L 或蛋白含量＞4.5 g/L；⑤細菌培養結果為陽性。納入標準：①順利完成IA 介入手術；②滿足CNS 感染診斷標準；③年齡≥18歲；④患者及家屬知曉本次研究內容并簽署同意書。排除標準：①介入術前存在感染或此前6個月內CNS感染史者；②伴免疫功能障礙或此前6個月內接受免疫治療者；③伴重要器官功能不全者；④合并全身其他部位感染者；⑤伴精神疾病或認知功能障礙者。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器和試劑：Mastercycle Gradient PCR擴增儀（德國Eppendorf 公司），電泳級瓊脂凝膠（西班牙BioWest Agarose 公司），DYY-6D 電泳儀和QD-9413B凝膠成像分析儀（北京六一儀器廠），BACT/Alert 全自動微生物培養系統（荷蘭Organon Teknika 公司），VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定儀（法國生物梅里埃公司），DW-86L626 型—80 ℃超低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司），ST16R型高速冷凍離心機（美國Thermo Sorvall 公司），Multiskan FC 酶標儀（上海賽默飛世爾儀器有限公司），LB肉湯（杭州百思生物技術有限公司），DNA Marker（上海生工生物科技有限公司），Easy Taq 酶、10×buffer 和dNTPs（北京全式金生物技術有限公司），M-H 瓊脂平板（西班牙OXIOD公司），核酸染色劑（北京Solarbio公司），細菌DNA 提取試劑盒（北京天恩澤基因科技有限公司），金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922 和銅綠假單胞菌ATCC27853 質控菌株（衛生部臨床檢驗中心），引物序列合成（上海生物技術有限公司）。

1.2.2 CNS 感染耐藥性分析：患者入院后詳細采集病史，完成體格檢查、影像學及實驗室檢查，臨床確診后給予腰大池持續引流，150～250 mL/d，并應用美羅培南聯合萬古霉素進行經驗性抗感染治療，腦脊液培養明確病原菌后換用敏感抗生素，若培養為陰性則在用藥72 h后觀察病情變化，好轉者保持用藥3周，無效者立即更換抗菌藥物，至腦脊液檢查顯示WBC 正常后鞏固治療2 周。病原菌培養方法：采集患者入院第1 天腦脊液并接種于專用瓶內，采用BACT/Alert全自動培養系統在37 ℃環境下進行振搖培養，提示細菌生長時轉接種于血瓊脂平板，35 ℃培養18～24 h，然后采用VITEK-2 Compact 全自動微生物鑒定儀分析病原菌類型，同時采用K-B 紙片法進行藥敏試驗，質控菌株分別為金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922 和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.2.3 金黃色葡萄球菌耐藥基因檢測：將菌株采用LB液態培養基在37 ℃條件下搖床培養24 h，采集1.5 mL菌液以12 000 r/min 離心2 min 后去上清，然后加入Buffer BS 500 μL重懸細胞，采用50 μL溶菌酶37 ℃溫育60 min，12 000 r/min離心5 min后去除上清，依次加入Buffer GL 180 μL，蛋白酶K 20 μL和核糖核酸酶A 10 μL，56 ℃溫育10 min，與Buffer GB和100%乙醇各200 mL充分混勻后以12 000 r/min離心5 min，去除濾液后加入無菌蒸餾水100 μL并室溫靜置5 min。采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測金黃色葡萄球菌van、erm、msr、aac（6＇）/aph（2″）、mec、fem、gyr、par以及emc等常見耐藥基因表達情況，所用引物序列及產物長度見表1。PCR 反應體系包括Premix Taa 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板4.0 μL，dNTP 2.0 μL，然后補充雙蒸餾水至25 μL。反應條件為94 ℃預變性5 min，然后于94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環40 次，最后72 ℃延伸10 min并于4 ℃保持。將PCR產物采用瓊脂凝膠進行電泳，參數設置為電壓110 V，電流100 mA，40 min后進行拍照和分析，與GenBank比對后明確基因型。

1.3 統計學方法數據分析使用SPSS 22.0 統計學軟件，計數資料以率（%）形式表示，組間比較采用χ2檢驗，計量資料采用（±s）表示，2組比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IA 術后CNS 感染者腦脊液病原菌分布64 例CNS 感染患者中58 例腦脊液培養結果陽性，占90.63%，共分離出病原菌58 株，其中革蘭陽性菌35株（60.34%），革蘭陰性菌23株（39.66%）。見表2。

表2 IA術后CNS感染者腦脊液病原菌分布Table 2 Distribution of pathogenic bacteria in cerebrospinal fluid of patients with CNS infection after IA

2.2 革蘭陽性菌常見抗生素耐藥性分析藥敏試驗顯示革蘭陽性菌中青霉素G、克林霉素、紅霉素、苯唑西林和頭孢西丁耐藥發生率較高，萬古霉素、呋喃妥因、左氧氟沙星和利奈唑胺耐藥發生率較低，且凝固酶陰性葡萄球菌和表皮葡萄球菌整體耐藥率高于金黃色葡萄球菌。見表3。

表3 革蘭陽性菌常見抗菌藥物耐藥性分析Table 3 Analysis of drug resistance of common antibacterial drugs to Gram-positive bacteria

2.3 革蘭陰性菌常見抗生素耐藥性分析藥敏試驗顯示革蘭陰性菌中阿莫西林、頭孢類抗生素、氨曲南和慶大霉素耐藥發生率較高，環丙沙星、美羅培南和亞胺培南耐藥發生率較低，且肺炎克雷伯菌和鮑氏不動桿菌整體耐藥率高于大腸埃希菌。見表4。

表4 革蘭陰性菌常見抗生素耐藥性分析Table 4 Analysis of drug resistance of common antibiotics to Gram-negative bacteria

2.4 金黃色葡萄球菌耐藥基因檢測結果20株金黃色葡萄球菌中ermA、ermB、ermC、msrA、msrB、aac（6＇）/aph（2″）、mecA、femB 和gyrA 檢出率分別為30.00%、10.00%、45.00%、40.00%、20.00%、30.00%、55.00%、45.00%和20.00%，見表5。與耐藥性進行對應分析顯示，mecA/femB 與青霉素G 符合率為75.00%，與苯唑西林符合率為85.00%；erm/msr與克林霉素符合率為70.00%，與紅霉素符合率為90.00%；aac（6＇）/aph（2″）與慶大霉素符合率為90.00%；gyrA 與左氧氟沙星符合率為85.00%，與環丙沙星符合率為75.00%；mecA與頭孢西丁符合率為80.00%。

表5 金黃色葡萄球菌耐藥基因檢測結果Table 5 Detection results of drug resistance genes in staphylococcus aureus

3 討論

血管介入治療是現階段IA 的主要干預手段，可有效防止瘤體破裂，預防SAH 發生，并改善患者預后，治療效果已獲得學術界普遍認可，但術后CNS感染近年來明顯增多［6］。腦脊液培養和藥敏試驗是確診CNS 感染的重要參考依據，同時對抗感染治療也具有良好指導意義，本研究對64例IA介入術后CNS感染患者腦脊液進行培養分析，其中58例結果陽性，陽性率90.63%，共分離出病原菌58 株，革蘭陽性菌35 株，占60.34%，檢出率從高到低依次為金黃色葡萄球菌20 株（34.48%），凝固酶陰性葡萄球菌7 株（12.07%）和表皮葡萄球菌6 株（10.34%）；革蘭陰性菌23 株，占39.66%，包括大腸埃希菌9 株（15.52%），肺炎克雷伯菌7 株（12.07%），鮑曼不動桿菌3 株（5.17%），可見CNS 感染病原菌以革蘭陽性菌更常見，與文獻［13］報道結果一致，因此經驗性抗感染治療應首選頭孢類抗生素或萬古霉素等對革蘭陽性菌作用較強的藥物。

近年來由于抗菌藥物不合理應用，細菌耐藥性明顯增加，常用抗菌藥物殺菌效果逐漸降低，而CNS感染病情進展迅速，易引起神經功能損傷，造成后遺癥，甚至威脅患者生命安全，及時進行病原學檢查和藥敏分析可為針對性應用抗菌藥物和快速控制感染提供依據［14-16］。本研究藥敏試驗顯示革蘭陽性菌中金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌和表皮葡萄球菌對青霉素G、對克林霉素、紅霉素、苯唑西林和頭孢西丁等均表現出較高耐藥性，原因可能與術前預防性應用抗感染藥物有關，導致CNS 感染的病原菌多為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌。本研究中革蘭陽性菌對萬古霉素、呋喃妥因、左氧氟沙星和利奈唑胺耐藥發生率較低，因此可作為首選抗感染治療方案。革蘭陰性菌中大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和鮑氏不動桿菌對阿莫西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松分、氨曲南和慶大霉素耐藥性較高，而對環丙沙星、美羅培南和亞胺培南耐藥率相對較低，可見碳青霉烯類抗生素可作為現階段抗革蘭陰性菌感染的首選藥物。本研究顯示凝固酶陰性葡萄球菌和表皮葡萄球菌整體耐藥率高于金黃色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌和鮑氏不動桿菌整體耐藥率高于大腸埃希菌，更易表現出多藥耐藥，與文獻［4，17］報道結果相近。因此，可采用多藥聯合治療以增強抗感染效果并縮短用藥時間，同時嚴密隨訪病情并及時調整治療方案。

攜帶耐藥基因是細菌產生耐藥性的重要原因。本研究以金黃色葡萄球菌為樣本進行分析，顯示耐藥基因ermA、ermB、ermC、msrA、msrB、aac（6＇）/aph（2″）、mecA、femB 和gyrA 檢出率分別為30.00%、10.00%、45.00%、40.00%、20.00%、30.00%、55.00%、45.00%和20.00%，這與本研究中金黃色葡萄球菌對青霉素G、克林霉素、紅霉素、苯唑西林、頭孢西丁以及環丙沙星等多種抗生素均具有較高耐藥性結果一致，可見金黃色葡萄球菌通常攜帶多種耐藥基因，從而造成多種耐藥性。erm基因包括ermA、ermB 和ermC 3種類型，廣泛分布于質粒或染色體，通過編碼核糖體甲基化酶并誘導23S rRNA 甲基化導致大環內酯類抗生與核糖體結合障礙，從而造成克林霉素和紅霉素等相應藥物耐藥；此外，質粒基因msr可編碼外排蛋白并引起對紅霉素等14 或15 環大環內酯類抗生素耐藥［18～20］。本研究中erm/msr與克林霉素耐藥符合率為70.00%，與紅霉素耐藥符合率為90.00%，證實攜帶erm/msr可能是造成金黃色葡萄球菌克林霉素和紅霉素耐藥的主要原因。金黃色葡萄球菌aac（6＇）/aph（2″）基因檢出率較高，是造成氨基糖苷類抗生素耐藥的重要原因。本研究中檢出率30.00%，與無萬古霉素耐藥菌株的檢測結果一致，較CHEN 等［21］報道結果更高，原因可能與不同地區抗生素應用差異有關。mecA 為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌經典耐藥基因，通過編碼青霉素結合球蛋白2a（PBP2a）競爭性抑制β-內酰胺類抗菌藥物的殺菌活性，femB 為金黃色葡萄球菌特異性表達的高度保守性基因，可與mecA 協同作用并引起多種耐藥性［22-23］。本研究顯示mecA/femB 與青霉素G 符合率為75.00%，與苯唑西林符合率為85.00%，與頭孢西丁符合率為80.00%，證實mecA/femB可引起多種抗生素耐藥。gyrA基因突變是喹諾酮類抗生素耐藥的常見原因，其機制與DNA 促旋酶結構改變有關［24］。本研究中gyrA 與左氧氟沙星和環丙沙星耐藥符合率為85.00%和75.00%，但gyrA 檢出率僅為20.00%，低于左氧氟沙星和環丙沙星，可見左氧氟沙星和環丙沙星耐藥還與其他因素有關。SHENG等［25］研究認為編碼拓撲異構酶Ⅳ的parC 基因與左氧氟沙星、莫西沙星以及耐諾沙星均存在密切聯系。本研究表明各種抗生素耐藥性均與一種或多種耐藥基因緊密相關，但由于樣本量偏小，且金黃色葡萄球菌與耐藥性相關的基因突變較多，因此無法詳細闡明各種抗菌藥物耐藥的所有機制，有待后續研究擴大樣本量進行更為深入和細致的分析。

IA 術后CNS 感染病原菌以革蘭陽性菌更為常見，且細菌耐藥率較高，明確細菌耐藥性及相應基因型可為合理選用抗菌藥物提供依據，從而提升抗感染治療效果。