產嗜熱酯酶菌株的篩選、鑒定及發酵特性研究

趙 妍，陳 娟，袁 倩，王子卉，朱小輝，郝征紅，畢文慧*，任長博，孟維國

（1.山東農業工程學院食品科學與工程學院，山東濟南 250100；2.山東省十里香芝麻制品股份有限公司，山東 濱州 251900）

酯酶是一類能催化酯鍵斷裂和形成的酶，在脂肪分解和酯類物質合成方面具有重要作用，廣泛應用于果酒釀造、果蔬制品風味改良等精深加工領域[1]。現有酯酶主要來源于微生物，自然界中能產生酯酶的微生物資源十分豐富，如青霉、鐮孢霉、曲霉、酵母菌、梨頭霉等真菌，及假單胞菌、粘質賽氏桿菌、無色桿菌和葡萄球菌等細菌。另外，少數放線菌也能分泌酯酶[2-3]。其中，細菌因能產生種類多、產量大、純度高的酯酶，已成為工業酯酶的主要來源。酯酶根據其最適反應溫度可分為常溫酯酶和嗜熱酯酶。在果蔬精深加工過程中，嗜熱酯酶比常溫酯酶更具優勢，其可以在高溫下完成催化，且在高鹽、有機溶劑存在的反應環境中具有更高的穩定性，因此在加工過程中應用嗜熱酯酶可有效防止生產污染，保證產品品質的穩定[4]。嗜熱酯酶具有極高的行業應用需求，但許多已知嗜熱酯酶存在產量低、熱穩定性差等問題，不能滿足實際生產需求。目前能夠應用于工業生產并且能夠量產的酯酶種類較少，因此還需要從環境中不斷篩選高活性、高穩定性、產酶量大的候選工業酯酶，以滿足果蔬精深加工等食品行業的需求[5]。

芝麻廢棄物、畜禽糞便等資源不及時處理會造成環境污染，如果以其為肥源進行堆肥，能夠起到資源節約和環境保護的重要作用。以芝麻廢棄物、畜禽糞便為原料進行堆肥，其高溫期溫度可達50～70 ℃，為嗜熱微生物營造了一個優良生境，且這些原料中油脂含量偏高，更易于誘導產酯酶微生物的生長[6]，并有望篩選到高活性產嗜熱酯酶的菌株。本試驗采用鑒別平板篩選法從堆肥樣品中篩選產嗜熱酯酶微生物，并對篩選菌株的發酵特性進行了研究，以期為工業酯酶生產菌種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PCR 引物、DNA marker、PCR 預混液、DNA loading buffer、瓊脂糖、SDS、CTAB，生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR Clean-Up kit，Promega 生物技術有限公司；GenGreen 核酸染料，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；革蘭氏染色液，北京奧博星生物技術有限責任公司；蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉、LB 肉湯、可溶性淀粉培養基、糖發酵基礎肉湯、明膠培養基、西蒙氏檸檬酸鹽培養基、Kovacs 氏靛基質試劑、胰蛋白胨水培養基、V-P 試驗試劑盒、甲基紅試驗試劑盒、硝酸鹽還原試劑盒、硝酸鹽肉湯，青島海博生物技術有限公司；石蕊，天津光復試劑有限公司；三丁酸甘油酯、乙二胺四乙酸二鈉鹽、NaCl 等，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 培養基

篩選培養基：蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl 10.0 g、10 mL 三丁酸甘油酯、瓊脂15.0 g、蒸餾水1000 mL、pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

產酶培養液：蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl 10.0 g、5 mL 三丁酸甘油酯、蒸餾水100 0mL、pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.3 儀器與設備

TC-S Gene Max 基因擴增儀，杭州博日科技有限公司；Nanodrop One 超微量核酸蛋白質測定儀，賽默飛世爾科技公司；ChemiDoc XRS+化學發光成像系統，伯樂生命醫學產品有限公司；DMi8 倒置生物顯微鏡，徠卡顯微系統有限公司；TGL-16 臺式高速冷凍離心機，湘儀離心機儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 產嗜熱酯酶微生物的初篩與純化

將芝麻廢棄物堆肥高溫期樣品接種于LB 肉湯中，于55 ℃振蕩培養3 d。將活化后的菌懸液梯度稀釋后，涂布于含1%三丁酸甘油酯的LB 平板上，于55 ℃下培養24 h。從初篩平板上挑取不同形態、具有明顯水解圈的單菌落進行分離純化，直至獲得純培養物[7]。

1.4.2 高活性產嗜熱酯酶微生物的篩選

分別測量純化后各單菌落的水解圈直徑和菌落直徑，計算水解圈直徑與菌落直徑的比值（hydrolysis circle，HC），選取HC 值最大的菌株再次純化并進行菌種鑒定[8]。

1.4.3 產嗜熱酯酶細菌的鑒定試驗

（1）形態學鑒定

將篩選到的菌株點接于篩選培養基平板，55 ℃下培養24 h 后觀察菌落形態。同時進行革蘭氏染色，觀察菌體顏色、形態[9]。

（2）生理生化鑒定

通過淀粉水解試驗、糖發酵試驗、明膠液化試驗、檸檬酸鹽試驗、靛基質試驗、V-P 試驗、甲基紅試驗、硝酸鹽試驗、石蕊試驗檢測篩選菌株的生理生化特性[10-11]。

（3）分子生物學鑒定

采用CTAB 法提取菌株基因組DNA，挑取一環純培養物于1 mL 無菌水中，混勻后在4℃、14 000 r/min 條件下離心1 min。將沉淀轉移到含有1.35 mL 裂解液（100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L EDTA-Na+、100 mmol/L磷酸鈉、1.5 mol/L NaCl、1% CTAB，pH 8.0）和150 μL 20% SDS的離心管中，輕輕混勻，放置在65 ℃恒溫水浴鍋中水浴2 h，每20 min 反轉混勻，水浴結束后在4 ℃、8 000 r/min條件下離心5 min，取上清液。在上清液中加入900 μL 異丙醇沉淀1 h，在4 ℃、14 000 r/min 條件下離心10 min，棄上清液。在含有沉淀的離心管中加入700 μL 75%乙醇，在4 ℃、14 000 r/min、離心2 min，棄上清液。取100 μL無菌水溶解DNA。測定DNA 濃度并進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測[12]。使用通用引物27F-5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′和1492R-5′-ACGGY TACCTTG TTACG ACTT-3′，采用馮廣達等[13]PCR 反應體系和運行程序進行16S rRNA 基因擴增。按照PCR Clean-Up kit 的操作程序回收擴增產物，將PCR 產物送至上海鉑尚生物技術公司測序。測序結果運用DNAman 進行序列拼接，BLAST 進行序列比對，并將序列提交至Genbank 數據庫（Genbank No.MZ203594），利用MEGA 5.0 軟件構建系統發育樹[14]。

1.4.4 菌株最適培養條件

（1）最適培養溫度的測定

將菌株GRJ 2 接種至LB 培養液中，分別放置于50、55、60、65、70、75 ℃下培養16 h，測定OD600nm以確定最適生長溫度。

（2）最適培養pH 值的測定

將菌株GRJ 2 接種至LB 培養液中，調整培養液初始pH 為4、5、6、7、8、9，在最適培養溫度下培養16 h，測定OD600nm以確定最適生長pH。

1.4.5 菌株生長曲線的測定

將菌株GRJ 2 以1%接種量接種至LB 培養液中，在最適溫度、pH 條件下培養，每隔2 h 取樣并測定OD600nm，繪制生長曲線。

1.4.6 產酶曲線檢測

（1）分批培養

將菌株GRJ2 以1%接種量接種至產酶培養液中，55℃下連續培養，分別在0、4、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28 h 時取發酵液，離心制備粗酶液。

（2）連續培養

方法同分批培養，在培養至14 h 時，補加10%新鮮產酶培養液（5 倍濃縮）[15]。

（3）酯酶活性測定

采用對硝基苯酚法，以對硝基苯酚丁酸酯為底物測定酶活[16]。標準曲線回歸方程y=4.16x-0.0038（R2=0.9992）。1 個酶活力單位定義為1 min 釋放1 μmol 對硝基苯酚所需要的酶量。

1.5 數據處理

使用SPSS 23.0 軟件進行數據差異顯著性分析，P＜0.05 說明數據間差異顯著；使用Origin 2021 軟件繪制柱狀圖和點線圖。

2 結果與分析

2.1 高活性產嗜熱酯酶微生物的篩選

產嗜熱酯酶微生物具有分解三丁酸甘油酯的能力，在含有三丁酸甘油酯的培養基中生長會在菌落周圍形成明顯的透明水解圈，水解圈直徑與菌落直徑之間的比值越大，代表微生物的活力越大[17]。通過篩選試驗發現5 株菌可見明顯透明水解圈，其中GRJ 2 菌株HC 值為3.0，其HC 值最大，說明酯解能力最強（表1）。

表1 產嗜熱酯酶細菌菌落HC 值Table 1 HC value of colony of thermophilic esterase producing bacteria

2.2 產嗜熱酯酶微生物鑒定結果

2.2.1 形態及生理生化鑒定結果

菌株GRJ 2 在平板上形成的單菌落呈乳白色，邊緣整齊，表面光滑、濕潤，在菌落周圍可見明顯的透明水解圈，符合產嗜熱酯酶微生物在三丁酸甘油酯選擇培養基上生長的典型菌落形態特征[17]（圖1A）；革蘭氏染色呈陽性，菌體為桿狀（圖1B）。

圖1 菌株平板菌落特征（A）及革蘭氏染色結果（B）Fig.1 Properties of bacterial colony (A) and gram staining results (B)

根據《伯杰氏系統細菌學手冊》，菌株GRJ 2 生理生化結果（見表2）符合芽孢桿菌屬特性[11]。

表2 篩選菌株生理生化鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical identification of isolated strain

2.2.2 分子生物學鑒定結果

以菌株GRJ 2 基因組DNA 為模板，擴增16S rRNA基因，PCR 擴增結果顯示菌株GRJ 2 獲得約1 500 bp 的單一條帶，可用于菌株測序鑒定（圖2A）。GRJ 2 菌株測序結果經序列拼接獲得一段1 450 bp 的基因片段，Blast比對后發現該基因片段與嗜熱淀粉芽孢桿菌（C.thermoamylovorans）的16S rRNA 基因相似度為99.73%。結合其形態及生理生化鑒定結果，初步鑒定菌株GRJ 2為嗜熱淀粉芽孢桿菌（C.thermoamylovorans），其系統發育樹見圖2B。

圖2 分子生物學鑒定結果Fig.2 Identification results of molecular biological

2.3 菌株發酵特性

2.3.1 菌株最適發酵條件

由圖3A（見下頁）可知，溫度對菌株GRJ 2 生長的影響較為明顯，菌株GRJ 2 在50～65 ℃的溫度范圍內均能生長；但當溫度高于70 ℃時，生長明顯受抑制。在同樣培養時長內，55 ℃條件下菌懸液吸光度最高，說明菌株濃度最高、生長最快，由此確定菌株的最適生長溫度為55 ℃。菌株可以在pH 5～9 范圍內生長，對酸、堿性環境都有一定耐受能力，但是在同樣培養條件下，pH 為7 時菌株生長最快，因此菌株GRJ 2 最適生長pH 值為7。

圖3 菌株最適培養溫度（A）及pH（B）Fig.3 Optimum incubation temperature (A) and pH (B) of strain

2.3.2 最適發酵條件下菌株生長及產酯酶特性

生長曲線可以反應細菌在發酵期間生長變化趨勢，從而確定種子液制備時間[18]，圖4（見下頁）為在最適培養溫度和pH 條件下（55 ℃、pH 7）菌株GRJ 2 的生長曲線與產酶曲線。發酵前0～4 h 為菌株生長延遲期，細菌增殖速度較為緩慢；4～14 h 菌株快速增殖，處于對數生長期；培養16 h 后，在不添加新鮮培養液的情況下進入衰亡期，細胞數量逐漸下降。該菌株培養10 h（OD600nm=0.52）即達到適宜細胞濃度，可作為種子液用于發酵生產（圖4A）。

圖4 菌株GRJ 2 生長曲線（A）與產酶曲線（B）Fig.4 Growth curve (A) and enzyme production curve (B) of GRJ 2

產酶曲線表征發酵過程中酯酶分泌情況，用于確定產物收獲期[19]。在分批培養12 h 后開始大量產酶，至第18 h 酶活達最高3.87 U/mL，相較來源于Acinetobacterjohnsonii菌株的酯酶活性更高[20]。嗜熱酯酶最佳收獲時間為16～22 h；在培養至14 h 時補加新鮮培養液，可以將產酶期延長4 h，該菌株適合于連續培養生產嗜熱酯酶（圖4B）。

3 小結

采用傳統的分離培養技術進行產酯酶微生物篩選，可以獲得更加穩定、高產的菌株，利用菌株發酵生產酯酶，實現量產并應用于工業生產的可行性較強[21]。本研究從堆肥高溫期樣品中分離、篩選得到產嗜熱酯酶菌株GRJ 2，經形態學、生理生化、分子生物學鑒定，該菌株為嗜熱淀粉芽孢桿菌（C.thermoamylovorans）。該菌株可以在50～65 ℃條件下生長，最適生長溫度為55 ℃；可耐受酸、堿性環境，最適生長pH 為7。該菌株作為種子液只需活化10 h 即可達到較高菌種濃度，培養16 h 后即可收獲酯酶，并且在連續培養條件下可以顯著延長酯酶收獲時間。本菌株可以經誘變育種進一步提升其產酶量及產酶活性，也可改造為底盤微生物用于工業化嗜熱酯酶生產，以滿足果蔬精深加工等食品領域不斷增長的嗜熱酯酶需求。