miRNA-144-3p靶向CCNE2調控肺腺癌細胞周期并抑制其增殖

王江波,梁 皓*,陸允平

0 引言

肺癌(Lung cancer,LC)是一種發病率和死亡率都極高的惡性腫瘤[1-3],是癌癥死亡的主要原因之一[4]。近期有報道顯示,每年預計有220萬例新發肺癌病例和180萬例新發死亡病例[5]。肺腺癌作為肺癌的主要組織學類型,約占肺癌病例的50%[6]。隨著技術的發展和新治療手段的開發,肺腺癌的早期診斷領域已取得了一定的進展,但肺腺癌患者的5年生存率仍然很低,復發率仍較高[7],因此,闡明肺腺癌發展涉及的分子機制,確定肺腺癌的新型預后生物標志物和治療靶點,對于肺腺癌的治療具有重要的臨床價值[8-9]。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一類短(18～24個核苷酸)的單鏈非編碼RNA[10],主要通過結合mRNA的3′末端非翻譯區(3′-untranslated region,3-UTR)來沉默mRNA表達或降解靶mRNA,從而起到調控作用[11]。Zhang等[12]研究發現,在乳腺癌細胞中,miR-1894-3p可以直接靶向mRNA Trim46的3′-UTR,下調Trim46的表達,進而抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移。已有多項研究表明,肺腺癌細胞的惡性進展受到miRNA的直接調控,如miRNA-126可增強肺腺癌細胞的增殖、遷移能力[13],miRNA-217上調可抑制FOXP1的表達,進而抑制肺腺癌的進展[14]。miRNA-454-3p受到lncRNA HOXA11-AS的調控,影響肺腺癌細胞的順鉑耐藥性[15]。然而miRNA-144-3p在肺腺癌中的研究卻較少,其影響肺腺癌惡性進展的分子機制有待進一步研究確認。

細胞周期蛋白E2(Cyclin E2,CCNE2)是細胞周期蛋白(cyclin)家族的成員之一,能夠通過激活其細胞周期蛋白依賴性激酶2(Cyclin-dependent kinase 2,CDK2)來驅動腫瘤細胞增殖[16]。CCNE2 可以調節細胞周期G1期向S期轉化,并在DNA復制、基因組穩定性控制等方面發揮功能[17]。現已有多篇文獻報道,CCNE2在肝癌[16]、乳腺癌[18]、前列腺癌[19]、胰腺癌[20]等腫瘤中異常表達。如CCNE2在胃癌中顯著高表達,能夠促進胃癌細胞的細胞周期進程[21]。在肝細胞癌中CCNE2 的過表達會促進癌細胞的生長[22]。但是CCNE2在肺腺癌中的分子機制研究還較少。

本實驗以人肺腺癌細胞為體外研究對象,研究miRNA-144-3p和CCNE2對肺腺癌細胞的增殖能力、細胞周期的調控機制,旨在為肺腺癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞和樣本來源 人肺腺癌細胞Calu-3、SPC-A-1、GLC-82和人胚肺成纖維細胞MRC-5均購自北納菌種保藏中心(BeNa Culture Collection,BNCC),貨號分別為BNCC338514、BNCC100120、BNCC338287、BNCC338054。從濮陽市人民醫院收集心胸外科手術切除的新鮮肺腺癌組織標本和配對癌旁組織(距癌組織3～5 cm)標本各20例。

1.2 主要試劑與儀器 10%胎牛血清、DMEM培養基、雙抗青/鏈霉素購自美國Gibco公司(貨號：10099、51985034、15140122);Lipofectamine?2000試劑、Trizol試劑、cDNA合成試劑盒購自美國賽默飛公司(貨號：11668019、A33250、11752025);miScript SYBR Green PCR 試劑盒購自德國Qiagen公司(貨號：331223);CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司(貨號：CK04);雙熒光素報告載體構建自中國genePharma,雙熒光素報告檢測系統購自美國Promega 公司(貨號：N1610);100%乙醇購自嘉鼎化學(貨號：MFCD00003568);碘化丙啶、TBST、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RNA酶、封閉液、ECL試劑盒均購自碧云天生物公司(貨號：ST511、ST673、P0010、ST040、P0252、P0018S);兔單克隆抗體GAPDH、兔單克隆抗體CCNE2、辣根過氧化酶標記的二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)均購自英國Abcam公司(貨號：ab181602、ab40890、ab205718)。

細胞培養箱購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司(型號：BB150);冷凍離心機購自美國賽默飛公司(型號：Heraeus Fresco 21);多功能酶標儀購自美國Bio-Tek公司(型號：ELX800UV);正置光學顯微鏡(Nikon Eclipse E100)、倒置熒光顯微鏡(MCT-001-150-S)購自日本Nikon公司;電泳儀購自韋克斯科技(北京)有限公司(型號：WIX-midiDNA)。7500實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司(型號：Prism?7500);6孔培養板、48孔培養板、96孔培養板和Transwell 小室均購自美國 Corning 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 所有細胞均用加入1%雙抗并且含10%胎牛血清的DMEM培養基在37 ℃、5% CO2培養箱中培養[23]。

1.3.2 載體構建和細胞轉染 細胞生長至對數期時,將陰性對照模擬物(NC mimic)、微小RNA-144-3p模擬物(miRNA-144-3p mimic)以及周期蛋白E2的過表達質粒載體(oe-CCNE2)和陰性對照(oe-NC)經Lipofectamine?2000試劑瞬時轉染到肺腺癌細胞中,同樣將陰性對照抑制劑(NC inhibitor)、微小RNA-144-3p抑制劑(miRNA-144-3p inhibitor)以及周期蛋白的敲低質粒載體(sh-CCNE2)和陰性對照(sh-NC)經Lipofectamine?2000試劑瞬時轉染到肺腺癌細胞中,并在對應的培養基5%CO2、37 ℃培養,6 h后更換培養基繼續培養48 h進行后續實驗。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction) 用Trizol試劑從細胞中提取總RNA。為了檢測miRNA-144-3p和CCNE2 的mRNA表達,使用cDNA合成試劑盒將1 μg的miRNA-144-3p和CCNE2總RNA分別用于合成cDNA。使用miScript SYBR Green PCR 試劑盒在以下熱循環條件下進行定量PCR,miR-144-3p和CCNE2內參物分別為U6和GAPDH,PCR條件：95 ℃ 2 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,循環40次。2-ΔΔCt法用于測定相對基因表達。引物序列見表1。

1.3.4 細胞計數試劑盒(Cell counting kit-8,CCK-8)檢測細胞增殖 用CCK-8試劑盒進行細胞增殖測定。將肺腺癌細胞系GLC-82的細胞(6×103個細胞/孔)接種在24孔板中。待細胞貼壁后,更換新鮮培養基100 μl,再加入CCK-8液10 μl,將細胞置于37 ℃孵育。在轉染后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h檢測450 nm處的吸光度,實驗重復3次。

表1 引物序列

1.3.5 雙熒光素酶報告基因實驗 將GLC-82細胞以6×105個細胞/孔接種在24孔板中并孵育24 h。隨后,用0.8 μg pGL3-CCNE2-3′UTR WT和pGL3-CCNE2-3′UTR Mut質粒,用0.08 μg phRL-SV40對照載體共轉染細胞,然后使用Lipofectamine 2000試劑盒將miRNA-144-3p mimic及其陰性對照分別轉染到細胞中。在轉染后24 h,使用雙熒光素酶測定法檢測海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶活性,實驗重復3次。

1.3.6 流式細胞術分析細胞周期 細胞培養48 h,并在冰冷的70%乙醇中固定12 h。洗滌后,將細胞與0.25 mg/ml RNase在37 ℃孵育30 min。將細胞重懸于碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)溶液(50 μg/ml)中,并通過流式細胞術進行細胞周期分析。

1.3.7 免疫印跡(Western blot,WB) 細胞轉染48 h后,將各組細胞使用冷PBS洗滌3次,加入全蛋白裂解液(RIPA)后冰上裂解10 min,離心,收集上清液,BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。上清液與上樣緩沖液混勻后,95 ℃變性10 min,取60 μg總蛋白在100 V的恒壓下使用SDS-PAGE膠分離。電泳結束后,以100 mA、120 min將蛋白轉移至NC膜,封閉液(5% BSA/TBST)封閉60 min,加入一抗,4 ℃過夜孵育。其中一抗分別為：兔單克隆抗體GAPDH(1∶10 000),兔單克隆抗體CCNE2(1∶10 000)。一抗孵育完畢后,用1×TBST溶液室溫下搖床搖動洗膜,洗3次,每次5 min,加辣根過氧化酶標記的二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1∶20 000),室溫下孵育120 min,1×TBST洗膜3次,每次20 min后,用ECL試劑盒進行發光反應,觀察蛋白印記,并進行圖像分析。實驗重復3次。

2 結果

2.1 miRNA-144-3p在肺腺癌中低表達 由癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數據庫下載數據,結果顯示,miRNA-144-3p在肺腺癌組織中表達顯著下調(圖1A)。臨床樣本檢測結果顯示,相比于癌旁組織,癌變組織的miRNA-144-3p表達水平顯著降低(圖1B)。采用實時熒光定量PCR分別檢測miRNA-144-3p在人肺腺癌細胞Calu-3、SPC-A-1、GLC-82和人胚肺成纖維細胞MRC-5中的表達水平,結果顯示,與肺成纖維細胞相比,miRNA-144-3p在肺腺癌細胞中的表達顯著降低(圖1C),此外,由于miRNA-144-3p在GLC-82細胞系中下調最明顯,因此選擇該細胞系進行后續實驗。

圖1 miRNA-144-3p在肺腺癌中低表達

2.2 過表達miRNA-144-3p抑制細胞增殖 向GLC-82細胞中轉染miRNA-144-3p mimic,以檢測miRNA-144-3p對肺腺癌細胞增殖的影響。qRT-PCR結果顯示,轉染miRNA-144-3p mimic的肺腺癌細胞相較于轉染NC mimic的細胞,其miRNA-144-3p表達量顯著增加(圖2A)。CCK-8實驗結果顯示,與NC mimic組相比,過表達miRNA-144-3p后,肺腺癌細胞的增殖能力顯著下降(圖2B)。

圖2 過表達miRNA-144-3p抑制細胞增殖

2.3 驗證miRNA-144-3p與CCNE2的靶向性 miRNAs通常會與下游mRNAs發生作用,表現出抑制功能。因此,應用starBase、miRDB、miRWalk數據庫對miRNA-144-3p進行靶基因預測,并與TCGA數據庫中分析得到的表達上調基因取交集,結果顯示,miRNA-144-3p下游存在靶基因CCNE2,同時用TCGA數據庫分析CCNE2的表達水平,結果發現,其在肺腺癌組織中顯著高表達(圖3A)。臨床樣本檢測結果顯示,相比于癌旁組織,癌變組織CCNE2的表達水平顯著升高(圖3B)。本研究選擇相應細胞系,采用qRT-PCR和WB實驗檢測CCNE2的表達情況。結果顯示,與正常細胞系相比,CCNE2在肺腺癌細胞系中均表現為表達上調(圖3C)。通過靶基因預測軟件miRTarBase預測miRNA-144-3p與CCNE2的靶向結合位點(圖3D),采用雙熒光素酶實驗以驗證CCNE2和miRNA-144-3p之間的靶向關系,結果見圖3E,在CCNE2野生型組中miRNA-144-3p mimic處理顯著降低了熒光素酶報告基因活性,而在CCNE2突變型組中miRNA-144-3p的過表達對熒光素酶活性無顯著影響,表明CCNE2和miRNA-144-3p可以特異性結合。qRT-PCR和Western blot結果(圖3F)顯示,肺腺癌細胞轉染miRNA-144-3p mimic后,CCNE2蛋白的mRNA和蛋白表達水平顯著低于對照組,而轉染了miRNA-144-3p inhibitor后,CCNE2蛋白的mRNA和蛋白表達水平顯著高于對照組。綜上,miRNA-144-3p能靶向下調CCNE2。

圖3 驗證miR-144-3p與CCNE2的靶向性

2.4 miRNA-144-3p靶向下調CCNE2,抑制細胞增殖,阻滯細胞周期 為了研究miR-144-3p與CCNE2在肺腺癌中的調控作用,本研究構建了不同的表達處理組,采用qRT-PCR和Western blot檢測轉染效果,結果見圖4A。圖4A結果顯示,過表達CCNE2后,CCNE2表達水平顯著升高,進一步過表達miRNA-144-3p后,CCNE2表達水平顯著降低,恢復至oe-NC+NC mimic組水平。此外,采用CCK-8檢測不同處理組細胞的增殖能力,結果顯示,肺腺癌細胞在單獨過表達CCNE2后,其細胞增殖能力顯著提高。當共轉染oe-CCNE2和miRNA-144-3p mimic時,相對于只轉染oe-CCNE2組,細胞增殖能力顯著降低,但依舊高于oe-NC+NC mimic組(圖4B)。各組細胞的細胞周期見圖4C,結果顯示,轉染oe-CCNE2的細胞和對照組相比,S期細胞占比顯著增加,G1期細胞占比減少,細胞周期進程加快。共轉染miRNA-144-3p mimic和oe-CCNE2的細胞相較于只轉染oe-CCNE2的細胞,S期細胞占比顯著減少,G1期細胞占比增加。另外,本研究驗證了敲低miRNA-144-3p對CCNE2的調控作用。結果如圖4D-F所示,敲低CCNE2后,細胞增殖能力顯著降低,G1期細胞顯著增加,S期細胞顯著減少,進一步加以miRNA-144-3p inhibitor處理后,GLC-82細胞中CCNE2表達水平、細胞增殖能力和細胞周期水平恢復至sh-NC+NC inhibitor組水平。結果表明,miRNA-144-3p可靶向CCNE2調控肺腺癌細胞增殖和細胞周期。

圖4 miRNA-144-3p靶向下調CCNE2,抑制細胞增殖并阻滯細胞周期

3 討論

盡管近幾十年來肺癌的診斷和治療技術取得了重大進展,但治療效果仍不盡人意,患者預后效果不理想[24]。因此,迫切需要開發針對肺腺癌惡性進展有效且安全的療法。國內研究表明,miRNA在調節肺腺癌發生發展中起著至關重要的作用,例如miRNA-148b-3p與肺腺癌的腫瘤等級和腫瘤大小顯著相關,是肺腺癌患者整體生存的獨立預測標志物[25];miRNA-375在肺腺癌中顯著上調,其調控作用對肺腺癌的進展至關重要[26];miRNA-145靶向N-cadherin 抑制肺腺癌細胞的轉移能力等[27]。因此,本研究探究了在肺腺癌中異常表達的miRNA-144-3p對癌細胞表型的影響及其下游相關的分子機制。

miRNA-144-3p在癌癥研究中已被廣泛報道,其參與了肝癌、鼻咽癌、甲狀腺腫瘤、腎透明細胞癌、喉鱗狀細胞癌等多種癌癥的發生和發展[28-32]。如miRNA-144-3p的異位表達顯著阻斷了肺鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[33]。miRNA-144靶向PURA,抑制了食道癌細胞的遷移、侵襲和增殖能力[34]。miRNA-144-3p對EGFR的負調控可對骨肉瘤的生長和遷移起到負面影響[35]。由此,miRNA-144-3p在腫瘤中的調控作用是普遍存在的。本研究通過分析TCGA數據及細胞實驗,確定miRNA-144-3p在肺腺癌組織和細胞中顯著低表達,CCK8實驗驗證了miRNA-144-3p能夠抑制肺腺癌細胞的增殖。

有研究表明,miRNA-144-3p可通過靶向不同的基因,如RP105[36]、YAP[37],從而起到調控腫瘤發生發展的作用。因而,為了探究miRNA-144-3p影響肺腺癌惡性進展的分子機制,我們利用targetscan網站,挖掘得到與miRNA-144-3p有靶向結合關系的下游基因CCNE2。此外,雙熒光素酶實驗也證明了兩者的靶向結合關系。CCNE2是細胞周期家族的成員之一,通過激活其激酶伴侶細胞周期蛋白依賴性激酶2來驅動細胞周期G1期向S期轉化[17],以促進細胞增殖[22]。在卵巢癌中CCNE2顯著上調,并與患者的預后不良相關[38]。在非小細胞肺癌中CCNE2受miRNA-3607-3p的靶向調控,影響癌細胞的增殖和遷移能力。在本研究中,我們通過體外實驗發現過表達miRNA-144-3p 能夠逆轉CCNE2對肺腺癌細胞增殖能力和周期分布的影響。

綜上,本研究表明,在肺腺癌細胞中miRNA-144-3p表達顯著下調,而CCNE2表達顯著上調。并且miRNA-144-3p能夠通過靶向CCNE2發揮抑制肺腺癌細胞增殖,并將細胞周期阻滯于G1期的作用,表明miRNA-144-3p可能是肺腺癌治療的潛在分子靶標。但是本研究有不足之處,如主要以肺腺癌細胞株為研究對象,通過體外實驗驗證了該分子機制,后續還有待利用動物實驗等進行進一步驗證和完善,未來還需納入臨床樣本進行檢測和前瞻性分析,使其真正能應用于臨床。