基于生物信息學(xué)分析烏司奴單抗治療尋常型銀屑病不應(yīng)答的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路

王利霞,甘 泉,甘才斌,夏永華

0 引言

銀屑病是一種在遺傳和環(huán)境共同作用下誘發(fā)的免疫介導(dǎo)性慢性、炎癥性、復(fù)發(fā)性、系統(tǒng)性疾病,廣泛或者局限分布,無(wú)傳染性,主要臨床特征為鱗屑性斑塊或者紅斑,治療困難,常持續(xù)終生[1],其中尋常型銀屑病占90%以上。近年來(lái),作用于多種靶點(diǎn)的生物制劑應(yīng)用于尋常型銀屑病的治療,療效顯著,已經(jīng)成為公認(rèn)的一線治療方案。其中作用于IL-12和IL-23的烏司奴單抗長(zhǎng)期安全性和耐受性良好,臨床應(yīng)用較為廣泛,但在應(yīng)用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)小部分患者對(duì)烏司奴單抗治療不應(yīng)答,其原因和機(jī)制不明,目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。生物信息學(xué)技術(shù)快速發(fā)展,目前已經(jīng)用來(lái)研究銀屑病的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路[2],也可用于預(yù)測(cè)治療銀屑病的藥物[3],是一種新的行之有效的研究方法。本研究中,我們應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)探究烏司奴單抗治療尋常型銀屑病過(guò)程中不應(yīng)答現(xiàn)象的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取 在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.ncbi.nlm)獲取GSE117239數(shù)據(jù)庫(kù),該研究基于GPL570平臺(tái)(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)芯片,包含324個(gè)樣本,比較了有無(wú)皮損,時(shí)間點(diǎn)與基線、應(yīng)答與無(wú)應(yīng)答,由Krueger等在2018年提交。該研究選取使用烏司奴單抗治療12周后22例應(yīng)答與10例無(wú)應(yīng)答的樣本進(jìn)行分析。

1.2 篩選差異基因 使用SangerBox對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化匯總及質(zhì)控[4]。使用GEO便捷轉(zhuǎn)換器進(jìn)行ID轉(zhuǎn)化并提取表達(dá)矩陣。使用DECenter中封裝的limma軟件進(jìn)行差異基因表達(dá)分析[5],P<0.05、|logFC|≥1.5的基因被篩選為差異基因,基于差異表達(dá)分析結(jié)果繪制火山圖,使用MeV基于基因表達(dá)值繪制熱圖。

1.3 差異基因本體(Gene ontology,GO)分析及京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)分析 使用Funrich軟件對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析,分析臨床癥狀[6]。使用ConsensusPathDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//cpdb.molgen.mpg.de/)在線工具對(duì)差異基因進(jìn)行GO以及KEGG分析,以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選[7]。

1.4 差異基因蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因分析 應(yīng)用String(Search Tool for the Retrieval of interacting Genes) 數(shù)據(jù)庫(kù)[8](http：//string-db.org/)分析差異基因的蛋白質(zhì)互作,并選取綜合得分>0.4的蛋白,利用Cytoscape的插件cytohubba篩選出前10的樞紐基因[9]。

2 結(jié)果

2.1 差異基因的篩選 分析烏司奴單抗治療尋常型銀屑病無(wú)應(yīng)答患者中的差異表達(dá)基因,以P<0.05及|logFC|≥1.5為標(biāo)準(zhǔn),共篩選到76個(gè)差異基因,其中上調(diào)基因48個(gè),下調(diào)基因28個(gè)。使用SangerBox中火山圖繪制工具繪制火山圖,見(jiàn)圖1A;采用MeV軟件繪制烏司奴單抗治療尋常型銀屑病應(yīng)答與無(wú)應(yīng)答的差異基因熱圖,見(jiàn)圖1B。

圖1 篩選差異基因的火山圖和熱圖

2.2 GO分析 利用Funrich軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析,上調(diào)基因主要富集的細(xì)胞成分(CC)：與actin相關(guān)的肌動(dòng)球蛋白、固有層、紡錘體及中心體;主要富集的分子功能(MF)：磷蛋白磷酸酶活性、核酸外切酶活性、轉(zhuǎn)氨酶活性;主要富集的生物進(jìn)程(BP)：糖類(lèi)代謝、器官形成、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)。下調(diào)基因主要富集的細(xì)胞成分(CC)：核膜、細(xì)胞膜、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu);主要富集的分子功能(MF)：蛋白特異性蛋白酶活性、RNA結(jié)合、受體信號(hào)復(fù)合體支架活性;主要富集的生物進(jìn)程(BP)：凋亡、DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄,見(jiàn)圖2。

2.3 KEGG信號(hào)通路分析 KEGG分析顯示,差異基因主要富集的信號(hào)通路,主要包括：核糖體、凋亡、其他糖類(lèi)降解、溶酶體等信號(hào)通路,見(jiàn)表1。

2.4 蛋白質(zhì)PPI分析 通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異基因,繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見(jiàn)圖3A。隨后選取綜合得分大于0.4的蛋白,利用Cytoscape的插件cytohubba篩選出前10的樞紐基因：CCL20、CXCL9、S100A9、S100A12、ARG1、OAS1、OASL、IL36G、SERPINB4、KRT16,見(jiàn)圖3B及表2。

圖2 差異表達(dá)基因的GO富集分析

表1 差異基因的KEGG通路分析

圖3 差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(A)及樞紐基因(B)

表2 10個(gè)樞紐基因及其功能

3 討論

銀屑病主要與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有關(guān),某些細(xì)胞因子在疾病發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用,例如Th1細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素12(IL-12)以及Th17細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素23(IL-23)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[10]。針對(duì)這一發(fā)病機(jī)制,科研人員研發(fā)了烏司奴單抗,于2009年獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市,用于中重度尋常型銀屑病[11]。隨著烏司奴單抗臨床應(yīng)用逐漸增多,研究發(fā)現(xiàn)部分尋常型銀屑病不應(yīng)答,原因不明。

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)篩選出76個(gè)差異表達(dá)基因,其中上調(diào)基因48個(gè),下調(diào)基因28個(gè)。上調(diào)基因主要富集在糖類(lèi)代謝、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)。目前研究顯示,銀屑病的發(fā)病機(jī)制與代謝性疾病(包括肥胖、代謝綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等)有著密切的關(guān)系[12-14],均與糖類(lèi)代謝紊亂關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn),銀屑病并發(fā)代謝紊亂的平均患病率為23.5%,且重度銀屑病合并代謝紊亂的患病率高于輕度[15]。研究發(fā)現(xiàn),銀屑病相關(guān)的危險(xiǎn)因素中肥胖占16%,且這一因素是可變的,與其他因素獨(dú)立[16]。有研究表明,體重指數(shù)每增加一個(gè)單位,患銀屑病風(fēng)險(xiǎn)增加9%[17]。糖類(lèi)代謝紊亂有可能通過(guò)影響烏司奴單抗的代謝引起不應(yīng)答,但仍需進(jìn)一步證實(shí)。此外,很多表達(dá)上調(diào)的基因富集在免疫相關(guān)信號(hào)通路中。在先天性免疫過(guò)程中,許多基因富集在抗微生物肽(Antimicrobial peptides,AMPs)這一通路[18]。AMPs是由角質(zhì)形成細(xì)胞、皮脂腺細(xì)胞和外分泌腺細(xì)胞產(chǎn)生的一類(lèi)多肽(包括抗菌肽、β-防御素、P物質(zhì)、趨化因子等)。在銀屑病患者中,β-防御素、S100蛋白、RNAase7、Cathelicidin、中性粒細(xì)胞明膠酶等表達(dá)增加,這些AMPs通過(guò)激活先天性免疫和適應(yīng)性免疫來(lái)調(diào)節(jié)銀屑病患者的免疫反應(yīng)[19],進(jìn)而影響了烏司奴單抗的應(yīng)答過(guò)程。

下調(diào)基因主要影響了凋亡、DNA修復(fù)通路。銀屑病雖然發(fā)病原因復(fù)雜,但是病理改變明確,主要病理改變表現(xiàn)為角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖和分化不全,以及凋亡異常[20]。正常情況下,細(xì)胞凋亡與增殖平衡以維持表皮厚度,有助于角質(zhì)層形成,并可消除惡性腫瘤細(xì)胞,而銀屑病是失衡的[21]。此外,與DNA修復(fù)相關(guān)基因也明顯下調(diào),DNA修復(fù)是細(xì)胞維護(hù)基因組穩(wěn)定性的生物進(jìn)程之一,能夠保護(hù)基因組免受損傷和突變。當(dāng)細(xì)胞累積DNA損傷超過(guò)一定限度,機(jī)體自身已經(jīng)不能保持損傷和修復(fù)的平衡時(shí),就會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞衰老、細(xì)胞程序性死亡以及細(xì)胞分裂失控[22-23],最后一種情況就可能導(dǎo)致銀屑病。通過(guò)烏司奴單抗治療后,以上基因表達(dá)發(fā)生明顯變化,且通過(guò)對(duì)這些變化基因所影響的生物學(xué)事件進(jìn)行分析,提示烏司奴單抗可能通過(guò)促進(jìn)或者抑制這些基因的表達(dá)發(fā)揮療效,例如通過(guò)上調(diào)糖類(lèi)代謝相關(guān)基因以及下調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因,進(jìn)而起到了治療效果。對(duì)于使用烏司奴單抗治療無(wú)應(yīng)答的銀屑病患者,其發(fā)病不是這些基因造成的,故治療無(wú)應(yīng)答。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析得到的10個(gè)樞紐基因?yàn)镃CL20、CXCL9、S100A9、S100A12、ARG1、OAS1、OASL、IL36G、SERPINB4、KRT16。按照作用可分3類(lèi)：①免疫反應(yīng)相關(guān)基因,包括CCL20、CXCL9、S100A9、S100A12、OASL、IL36G、SERPINB4。CCL20作為趨化因子受體CCR6的配體,參與Th17淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)[24],同時(shí),Th17產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-17又會(huì)刺激包括CCL20等多種促炎因子產(chǎn)生,并具有免疫調(diào)節(jié)功能[25]。研究表明,特定區(qū)域銀屑病患者CXCL9顯著高于正常人群[26],提示在不同的環(huán)境下CXCL9對(duì)于銀屑病影響是不同的,也可能是導(dǎo)致烏司奴單抗無(wú)應(yīng)答的原因。IL36G是白介素36家族中的一種細(xì)胞因子,與受體結(jié)合活化MAPKs/JUN/ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑,通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1啟動(dòng)靶基因表達(dá),發(fā)揮促炎作用[27-29]。既往研究解釋了烏司奴單抗主要靶向細(xì)胞因子IL-12/IL-23[10],本研究又發(fā)現(xiàn)其可以影響IL-36G基因表達(dá),對(duì)于理解烏司奴單抗的作用原理又提供了一個(gè)新的方向。②代謝相關(guān)基因ARG1、OAS1。銀屑病發(fā)病機(jī)制研究中,與氨基酸代謝和核苷酸代謝方面的研究較少,但銀屑病代謝異常現(xiàn)象早已受到廣泛關(guān)注。研究表明,通過(guò)下調(diào)ARG1等基因,抑制尿素生成,進(jìn)行氨清除,可抑制腫瘤生長(zhǎng)[30]。本研究顯示,這些代謝相關(guān)基因在銀屑病發(fā)病中起重要作用,并可作為治療靶點(diǎn)。③細(xì)胞增殖相關(guān)基因KRT16。KRT家族蛋白是編碼細(xì)胞支架蛋白里中間纖維蛋白的基因,包括20個(gè)成員。異常增生的KRT16在基底層高表達(dá)是臨床前期銀屑病的標(biāo)志[31],表達(dá)變化可以作為銀屑病治療效果優(yōu)劣的指標(biāo),這更加體現(xiàn)出了烏司奴單抗治療后會(huì)對(duì)不同的患者產(chǎn)生不同的效果。

綜上所述,通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn),CCL20、CXCL9、S100A9等基因以及代謝、免疫反應(yīng)等信號(hào)通路在烏司奴單抗治療尋常型銀屑病不應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。本研究對(duì)于烏司奴單抗不應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行了探索,有利于理解無(wú)應(yīng)答的原因,對(duì)后續(xù)臨床治療、新藥研發(fā)都具有參考意義。