食品能力驗證樣品中沙門氏菌的分離與多相分類鑒定

何肖云 饒秋華 呂新 劉蘭英 傅建煒

摘 要：為沙門氏菌的快速檢測與鑒定提供參考，從傳統標準檢測方法、特異性PCR、分子系統發育3個層面，其中傳統標準檢測方法基于食品安全國家標準GB 4789.4-2016《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》、特異性PCR基于invA基因、分子系統發育基于16S rDNA，對能力驗證（CFAPA-805）樣品進行沙門氏菌的分離鑒定。結果表明：3種檢測方法結果一致，樣品341中檢出沙門氏菌，其中生化鑒定、血清學鑒定與分子系統發育鑒定結果顯示，此次陽性樣品中的沙門氏菌為沙門氏菌生化群（Ⅰ），腸炎沙門氏菌腸炎亞種，血清分型為O：9，12：H：g， m。本次實驗室的能力驗證結果為“滿意”，肯定實驗室沙門氏菌檢測能力。通過比較，特異性PCR鑒定可以確定沙門氏菌是否檢出，生化鑒定、血清學鑒定和分子系統發育鑒定可以確認沙門氏菌的生化群、血清分型與分子分型。

關鍵詞：沙門氏菌；多相鑒定；血清鑒定；特異性PCR；分子系統發育

中圖分類號：TS 207.4 ??文獻標志碼：A ??文章編號：0253-2301（2023）01-0051-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.01.008

Isolation and Polyphasic Taxonomy of Salmonella in Food Proficiency Testing Samples

HE Xiao-yun， RAO Qiu-hua， LV Xin， LIU Lan-ying， FU Jian-wei*

（Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology， Fujian Academy of Agricultural Sciences/

Fujian Key Laboratory of Agro-products Quality & Safety， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： In order to provide reference for the rapid detection and identification of Salmonella， Salmonella was isolated and identified from the proficiency testing （CFAPA-805） samples from three aspects including the traditional standard detection methods， specific PCR and molecular phylogeny. The traditional standard detection method was based on the national food safety standard （GB 4789.4-2016） ″Salmonella Examination of Food Microbiological Examination″， the specific PCR was based on the invA gene， and the molecular phylogeny was based on the 16S rDNA. The results showed that the results of the three detection methods were consistent. Salmonella was detected in 341 samples， and the results of physiological and biochemical identification， serological identification and molecular phylogenetic identification showed that： the Salmonella in the positive samples was Salmonella biochemical group （Ⅰ）， Salmonella enteritidis subspecies， of which the serotyping was O：9， 12：H：g， m. The ability verification result of this laboratory was ″satisfactory″， affirming the laboratory′s ability to detect Salmonella. By the comparison， the specific PCR identification could determine whether Salmonella was detected. The physiological and biochemical identification， serological identification and molecular phylogenetic identification could confirm the biochemical group， serotyping and molecular typing of Salmonella.

Key words： Salmonella； Polyphasic taxonomy； Serological identification； Specific PCR； Molecular phylogeny

沙門氏菌是全球范圍內最常見的一種食源性革蘭氏陰性桿菌，可導致胃腸炎、敗血癥等引起機體功能障礙的嚴重疾病［1-2］。在中國沙門氏菌同樣也是主要的食源性致病菌，據報道有70%～80%的細菌性食物中毒事件均因沙門氏菌污染所致［3］。因此，作為食源性致病菌的重點監控對象，沙門氏菌的檢測具有重要的衛生安全意義。目前沙門氏菌的檢測技術主要包括傳統標準檢測方法、分子生物學方法、免疫學方法，以及生物傳感器等新型檢測方法［4］，其中傳統標準檢測方法與分子生物學法應用較廣。

傳統標準檢測方法主要基于沙門氏菌的生長生化特征進行檢驗［5］，按照食品安全國家標準GB4789.4-2016《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》［6］，分為預增菌、選擇性增菌、選擇性分離、生化鑒定和血清學鑒定5個步驟，雖然存在過程繁瑣、耗時費力、難以批量化等缺點［4，7］，但是目前市場配套和技術成熟度高，且環境要求和技術門檻較低，具有較高的準確性，檢測結果得到市場認同，是國際和國內沙門氏菌檢測的黃金標準［8］。分子生物學檢測方法是通過保守或特異的核酸序列比對實現細菌種屬鑒定，具有靈敏、快速、特異等優勢［9］，目前基于16S rDNA保守序列的系統發育分析已經廣泛應用于細菌的分類鑒定［10-11］，而基于物種特異性基因的PCR技術在定性檢測中也十分常見［12-13］。因此，本研究采用傳統標準檢測方法、特異性PCR和分子系統發育3種方法，對能力驗證（CFAPA-805）樣品進行沙門氏菌的分離鑒定，在驗證實驗室檢測能力的同時，為沙門氏菌的快速檢測與鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 供試樣品

CFAPA-805食品中沙門氏菌的測定能力驗證計劃樣品，樣品編號為和405和341，以樣品405和樣品341表示，兩份樣品均為凍干粉末狀，以西林瓶真空密封包裝，由大連中食國實檢測技術有限公司提供。

1.1.2 標準菌株

腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335、枯草芽孢桿菌ATCC6633采購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.3 培養基與試劑

磷酸鹽緩沖液（PBS）、緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、HE瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、科瑪嘉沙門氏菌屬顯色培養基（CAS）、DBI-05沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒（北京陸橋技術股份有限公司）；A～F沙門氏菌屬診斷血清（寧波天潤生物藥業有限公司）；細菌基因組提取試劑盒、PCR Mix、瓊脂糖凝膠、PCR引物合成、PCR產物測序［生工生物工程（上海）股份有限公司］。

1.1.4 儀器設備

高溫高壓滅菌鍋：SQL810C，重慶雅馬拓有限公司；生物安全柜：BSC-1360ⅡA2，北京東聯哈爾有限公司；恒溫培養箱：IC612C，日本雅馬拓公司； PCR儀：BIO-RADTM S1000，美國伯樂公司；電泳儀：DYY-6C ，北京六一儀器廠；凝膠成像儀：BIO-RADTM Gel Doc XR+，美國伯樂公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

根據CFAPA-805《食品中沙門氏菌的測定能力驗證計劃 參試指導書》中的要求，在無菌條件下開啟真空密封西林瓶，立即加入4 mL 無菌PBS水化溶解，吸出至無菌三角瓶內，反復用無菌PBS清洗西林瓶內壁，并將清洗液轉移至上述無菌三角瓶內，最終清洗液合計40 mL，即為待測原液。

1.2.2 選擇性平板分離

按照食品安全國家標準GB4789.4-2016《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》，取25 mL待測原液轉至225 mL BPW中預增菌，取1 mL預增菌18 h培養物分別轉種至TTB和SC內，于42℃和36℃下分別培養24 h，BPW預增菌液、TTB增菌液及SC增軍液分別劃線于BS平板、XLD平板和CAS平板，挑取36℃培養24 h。

1.2.3 生化與血清鑒定

根據GB 4789.4-2016《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》，以腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335作為陽性對照，挑取樣品405與樣品341選擇性平板上的可疑菌落接種至三糖鐵斜面瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺，同時接種營養瓊脂平板，于36℃培養24 h。根據三糖鐵斜面瓊脂的反應結果，選取對應營養瓊脂平板上的可疑菌落制備菌懸液，接種至沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒中，36℃培養18～48 h，觀察并記錄相應的生化結果。

根據生化結果，對判定為沙門氏菌屬的菌落，用A～F沙門氏菌屬診斷血清進行血清學鑒定。首先，利用生理鹽水與目標培養物混合，排除自凝集反應。對無自凝現象的培養物，以生理鹽水為空白對照，以腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335為陽性對照，用A～F多價O血清和H因子血清進行進一步的O抗原鑒定和H抗原鑒定，觀察血清與目標培養物的凝集現象。最后，根據凝集試驗的結果，按照GB 4789.4-2016《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》附錄B 沙門氏菌屬抗原表判定沙門氏菌菌型。

1.2.4 特異性PCR反應鑒定

按照細菌基因組提取試劑盒的操作規程對SC增菌液進行DNA提取，得到目的基因后，測定DNA濃度并進行PCR。PCR反應體系（25 μL）為：2X SanTaq PCR Master Mix 12.5 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，DNA模板 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序見表1，其中特異性PCR以沙門氏菌侵襲蛋白A invA基因（F：5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′，R：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′）作為目的基因［13］， PCR產物用于電泳分析，普通PCR以16S rDNA（27F： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′， 1492R： 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）為目的基因，以枯草芽孢桿菌ATCC6633為陰性對照， 腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335為陽性對照，對陰性對照、陽性對照、樣品405、樣品341進行invA基因的特異性擴增。PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，并將序列上傳至NCBI，樣品405、樣品341和腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335的GenBank Accession Number 分別標記為OM666544、OM666543、OM666545。

1.2.5 分子系統發育

將測序后的陽性對照菌株腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335、樣品405和樣品341的16S序列通過BLAST進行初步判斷，按照沙門氏菌的分子分型［14］，選擇亞利桑那亞種Salmonella enterica subsp.arizonae、雙亞利桑那亞種Salmonella enterica subsp.diarizonae、腸炎亞種Salmonella enterica subsp.enterica、豪頓亞種Salmonella enterica subsp.houtenae、印度亞種Salmonella enterica subsp.indica、薩拉姆亞種Salmonella enterica subsp.salamae這6個腸炎沙門氏菌亞種和邦戈沙門氏菌Salmonella bongori作為參考序列，選擇弗氏檸檬酸桿菌Citrobacter freundii作為外群，進行系統發育分析。利用MEGA v7對目標序列進行比對，構建最大似然樹（ML Tree）。

2 結果與分析

2.1 選擇性平板分離

沙門氏菌屬因不同選擇性培養基中成分及濃度的不同，呈現不同的菌落特征［15-16］，在BS平板上表現為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色菌落，周圍培養基黑色或棕色，或為灰綠色菌落，周圍培養基不變；在XLD平板上表現為粉紅色帶或不帶黑色中心菌落，或為帶大光澤黑色中心或全部黑色菌落，或為黃色帶或不帶黑色中心菌落［6］；在CAS平板上表現為淡紫色菌落，或培養24～48 h后才出現紫色菌落。根據已知沙門氏菌屬的菌落特征，挑選樣品405和樣品341中的可疑菌落，具體見表2。 對比預增菌液（BPW）和增菌液（TTB和SC）的分離結果，發現在不同選擇性平板上，兩種增菌程度的可疑菌落特征未表現出明顯差異。對比同種增菌液在不同選擇性平板上的分離結果，發現樣品在不同選擇性平板上表現出不一樣的菌落特征，其中樣品405與陽性對照差異較大，但仍可BS與XLD的沙門氏菌菌落描述中找到對應的特征，卻與CAS的沙門氏菌菌落特征描述不符，樣品341則表現出與陽性對照腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335相似的菌落特征。

2.2 生化與血清鑒定

由表3可知，樣品405的可疑菌落在三糖鐵瓊脂斜面和底層均產酸，且賴氨酸脫羧酶試驗結果為陰性，可初步判斷為非沙門氏菌屬，結合靛基質、尿素、氰化鉀的生化結果，可判定為非沙門氏菌屬。樣品341的可疑菌落與陽性對照菌株生化結果一致，在三糖鐵瓊脂斜面產堿、底層產酸、硫化氫陽性、產氣陽性、賴氨酸脫羧酶試驗陽性可初步判斷樣品341中存在可疑沙門氏菌屬，靛基質、尿素、氰化鉀、β-半乳糖苷酶、丙二酸鹽的生化結果表明，基于GB 4789.4-2016《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》樣品341可判定為沙門氏菌生化群Ⅰ［6］，基于第 2 版《伯杰系統細菌學手冊》 （2005）樣品341可判定為S.enterica subsp.enterica（Ⅰ）［17］。

基于生化試驗的結果，對樣品341和陽性對照菌株進行進一步的血清學鑒定。由表4可知，樣品341和陽性對照菌株在生理鹽水下表現為不凝集，表明樣品341菌株與陽性對照菌株腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335同為非粗糙型菌株。腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335 的血清學鑒定結果O抗原為O9，12，H抗原第1相為g，m。樣品341在O抗原鑒定試驗中，被A～F多價O血清凝集，后續依次用O2、O4、O5等多種因子血清做凝集試驗，發現樣品341被O9和O4，12因子血清凝集，且不被O4因子血清凝集，查GB 4789.4-2016附錄B可知，樣品341的O抗原可判定為D群。在H抗原的鑒定試驗中，利用單因子血清進行逐一驗證，結果表明樣品341被Hg和Hm因子血清凝集。綜上可知，樣品341的血清分型為O：9，12：H：g，m，血清鑒定結果與腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335一致。因此樣品341中檢出沙門氏菌，且血清型為O：9，12：H：g，m，是腸炎沙門氏菌S.enterica serovar enteritidis。

2.3 特異性PCR反應鑒定

invA基因是沙門氏菌編碼吸附和侵染上皮細胞表面蛋白的毒力基因，是沙門氏菌的侵染基礎［7］。因其在血清型分類中的廣譜性和沙門氏菌特異性，已被設計成沙門氏菌的特異性引物廣泛應用于沙門氏菌的快檢中［18］。基于invA基因的特異性PCR電泳結果見圖1，陽性對照菌株腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335與樣品341表現出invA基因特異性，約280 bp處出現明顯的目的條帶，與報道中invA基因的大小相符［13］，樣品405擴增出3條模糊的條帶，大小分別約為2 000、400、250 bp，明顯不具備invA基因特異性，陰性對照菌株枯草芽孢桿菌ATCC6633未出現條帶。由此可得，樣品341與陽性對照菌株腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335的特異性PCR結果一致，表明樣品305檢出沙門氏菌。

2.4 分子系統發育

由圖2可知，樣品405區別于沙門氏菌的7個亞種，與弗氏檸檬酸桿菌聚類在同一分支，因此，樣品405應為沙門氏菌陰性。樣品341和陽性對照菌株腸炎沙門氏菌CMCC（B）50335，與沙門氏菌的7個亞種聚類在同一大分支中，且對應的分支嵌在沙門氏菌7個亞種中拓撲結構中，由此可知樣品341檢出沙門氏菌陽性。此外，樣品341聚類在Salmonella enterica subsp.enterica這一小分支中，且其分支嵌于Salmonella enterica subsp.enterica的拓撲結構中，因此樣品341中沙門氏菌的分子分型為腸炎沙門氏菌腸炎亞種。

3 討論與結論

常規分離培養作為易普及、易操作的傳統基礎方法仍在微生物檢測領域，尤其是食品沙門氏菌常規檢測中發揮重要作用［19］。在本研究中，選擇性平板分離階段的不同增菌程度菌液表現出一致的可疑菌落特征，但在日常檢測中，BPW預增菌液直接劃線于選擇性平板中，存在雜菌蔓延速度過快，陽性菌落因不具空間競爭與營養競爭優勢，導致陽性菌落瘦小不典型等情況，容易出現漏檢［20］。另外，對比所用的BS、XLD與CAS 3種選擇性培養基，發現CAS在分離鑒別時，受干擾菌影響較小，能更直觀區分雜菌，這與研究報道中的描述相符［19-21］。CAS培養基作用原理主要是依于沙門氏菌特有的辛酯酶反應，是在生化反應的基礎上開發的新技術，具有較高的靈敏性和特異性，目前在沙門氏菌的快速檢測中已得到廣泛應用［21-23］，但是CAS同樣無法做到鑒別所有沙門氏菌，因此建議選用CAS與多種選擇性培養基的組合模式［19，21］，并且對選擇性培養基中的可疑菌落進行后續生化與血清鑒定，可提高檢出率，以防漏檢［24］。

生化鑒定技術主要是根據不同種屬微生物酶系統、代謝途徑和代謝產物的差異性，利用代謝產物的不同生化特征進而鑒定微生物種類。沙門氏菌屬最早就是通過生化反應實現分類鑒定［1］，第 2 版《伯杰系統細菌學手冊》 （2005） 采用了目前國際認可的沙門氏菌分類方案，將沙門氏菌屬分為了邦戈爾沙門菌、腸炎沙門菌（包括6個亞種）兩個種。GB 4789.4-2016《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》中依據沙門氏菌的生化反應分類方案，將沙門氏菌屬劃分成6個生化群，雖與主流分類方案相似，但無法完全等同。而血清分型對沙門氏菌屬的分類更為細化，已多達2 600多個，其中絕大部分屬于腸炎沙門氏菌［25］。本研究中，分離得到的沙門氏菌正是腸炎沙門氏菌，根據國標歸屬于沙門氏菌生化群I，根據《伯杰系統細菌學手冊》歸屬于腸炎沙門氏菌腸炎亞種（I），血清型為O：9， 12：H：g，m，是較為常見的沙門氏菌株。在日常檢測中，生化鑒定是必做項目，而血清學鑒定屬于選做項目［6］，但是若為了進一步研究沙門氏菌致病性及傳染源的追蹤、溯源等，血清型鑒定是不可或缺的一項［26］。

目前，對于沙門氏菌鑒定的分子技術已多有研究報道，沙門氏菌的特異性PCR是通過成功擴增沙門氏菌基因組中的特異性基因片段，實現沙門氏菌的檢測，其中inva基因是沙門氏菌中編碼入侵蛋白的基因，在沙門氏菌鑒定中得到廣泛應用［7，12-13］，PCR體系及程序已相對成熟，在本研究中也得到成功驗證，在陽性對照和陽性樣本中成功檢出沙門氏菌，在陰性對照和陰性樣本中未檢出沙門氏菌。16S rDNA是細菌鑒定的通用引物，本研究中將其應用于沙門氏菌的檢測中，構建的系統發育樹不僅成功確定樣本沙門氏菌的是否檢出，而且明確參試菌種的分類，表明本研究中的沙門氏菌為腸炎沙門氏菌腸炎亞種，作為陰性樣品的干擾菌為弗氏檸檬酸桿菌。與常規生化血清鑒定相比，分子方法具有簡單、快速等優點，在快檢技術的開發應用具有巨大的優勢［7］，但GB 4789.4-2016《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》中并未涉及，因此分子方法可作為傳統標準檢測方法的補充。

采用傳統標準檢測方法、特異性PCR與分子系統發育3種不同方法對能力驗證（CFAPA-805）樣品進行檢測，檢測結果一致，樣品341中檢出沙門氏菌，能力驗證結果為“滿意”，驗證了實驗室沙門氏菌的檢測能力。比較發現，選擇性培養可以確定是否存在可疑沙門氏菌，特異性PCR可以確定沙門氏菌是否陽性檢出，可應用于沙門氏菌快速檢測，是傳統標準檢測方法的補充；生化鑒定、血清學鑒定和分子系統發育鑒定可以確認沙門氏菌的生化群為沙門氏菌生化群（Ⅰ），血清分型為O：9，12：H：g，m，分子分型為腸炎沙門氏菌腸炎亞種，適用于沙門氏菌具體鑒定分型，可應用于沙門氏菌的致病性、流行病溯源。

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（責任編輯：柯文輝）