circ-AFF2表達水平與類風濕關節炎疾病活動度的相關性研究

平佃輝

[摘要]?目的?探討類風濕關節炎（rheumatoid?arthritis，RA）患者外周血及關節滑液中的circ-AFF2表達水平與疾病活動度的關系。方法?選取2019年12月至2022年4月浙江中醫藥大學附屬湖州中醫院治療的90例RA患者納入RA組，記錄其臨床資料與實驗室指標，根據RA疾病活動度評分（disease?activity?score-28，DAS28）將納入患者分為低活動度組（n=32）、中活動度組（n=34）和高活動度組（n=24）；收集同期87例關節損傷患者納入對照組。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time?fluorescent?quantitative?polymerase?chain?reaction，qRT-PCR）測定兩組患者外周血與關節滑液中的circ-AFF2表達水平，并檢測相關實驗室指標和膝關節超聲指標。結果?RA組患者外周血與關節滑液中的circ-AFF2水平均顯著高于對照組（P<0.05）。低活動度組、中活動度組、高活動度組患者的外周血與關節滑液中circ-AFF2表達水平及類風濕因子（rheumatoid?factor，RF）、紅細胞沉降率（erythrocyte?sedimentation?rate，ESR）、C反應蛋白（C-reactive?protein，CRP）、抗環瓜氨酸肽（anti-cyclic?cirtrullinated?peptide，CCP）、滑膜厚度依次升高，滑膜血流分級、滑膜動脈阻力指數（resistance?index，RI）依次降低（P<0.05）。RA患者的外周血及關節滑液中circ-AFF2表達水平與RF、ESR、CRP、CCP、滑膜厚度均呈正相關（P<0.05），與滑膜血流分級、RI呈負相關（P<0.05）。RA患者外周血和關節滑液的circ-AFF2、RF均為RA的獨立危險因素（P<0.05）。結論?RA患者外周血與關節滑液中的circ-AFF2表達水平均升高，且患者的疾病活動度越高，circ-AFF2表達水平越高。

[關鍵詞]?類風濕關節炎；circ-AFF2；外周血；關節滑液；疾病活動度

[中圖分類號]?R593.22??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.15.005

Correlational?study?of?circ-AFF2?expression?level?with?disease?activity?in?patients?with?rheumatoid?arthritis

PING?Tianhui

Department?of?Orthopedics?and?Traumatology，?Huzhou?Hospital?of?Traditional?Chinese?Medicine?Affiliated?Zhejiang?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Huzhou?313000，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?expression?of?circ-AFF2?in?peripheral?blood?and?synovial?fluid?of?patients?with?rheumatoid?arthritis?（RA）?and?its?relationship?with?disease?activity.?Methods?90?patients?with?RA?treated?in?Huzhou?Hospital?of?Traditional?Chinese?Medicine?Affiliated?Zhejiang?University?of?Traditional?Chinese?Medicine?were?included?in?RA?group，?and?their?clinical?data?and?laboratory?indicators?were?recorded.?According?to?disease?activity?score-28?（DAS28），?the?patients?were?divided?into?low-activity?group?（n=32），?medium-activity?group?（n=34）?and?high-activity?group?（n=24）;?another?87?patients?with?joint?injury?were?regarded?as?control?group.?The?expression?level?of?circ-AFF2?in?peripheral?blood?and?synovial?fluid?was?determined?by?real-time?fluorescent?quantitative?polymerase?chain?reaction?（qRT-PCR）?method，?relevant?laboratory?indexes?and?ultrasonic?indexes?of?knee?joint?were?detected，?and?the?research?data?were?statistically?analyzed.?Results?The?expression?level?of?circ-AFF2?in?peripheral?blood?and?synovial?fluid?of?patients?in?RA?group?were?significantly?higher?than?that?of?control?group?（P<0.05）.?The?expression?levels?of?circ-AFF2?in?peripheral?blood?and?synovial?fluid，?rheumatoid?factor（RF），?erythrocyte?sedimentation?rate（ESR），?C-reactive?protein（CRP），?anti-cyclic?citrullinated?peptide（CCP）?and?synovial?thickness?increased?in?turn?（P<0.05），?while?the?synovial?blood?flow?grading?and?synovial?arterial?resistance?index?（RI）?decreased?in?turn?（P<0.05）.?The?expression?level?of?circ-AFF2?in?peripheral?blood?and?synovial?fluid?of?patients?with?RA?was?positively?correlated?with?RF，?ESR，?CRP，?CCP，?and?synovial?thickness?（P<0.05），?and?was?negatively?correlated?with?synovial?blood?flow?grade?and?synovial?artery?RI?（P<0.05）.?Peripheral?blood?circ-AFF2，?joint?synovial?fluid?circ-AFF2，?and?RF?were?independent?risk?factors?for?patients?with?RA?（P<0.05）.?Conclusion?The?expression?level?of?circ-AFF2?in?peripheral?blood?and?synovial?fluid?of?patients?with?RA?is?increased，?and?the?higher?the?disease?activity?of?patients，?the?higher?the?expression?level?of?circ-AFF2.

[Key?words]?Rheumatoid?arthritis;?circ-AFF2;?Peripheral?blood;?Synovial?fluid;?Disease?activity

類風濕關節炎（rheumatoid?arthritis，RA）是一種多因素自身免疫性疾病，與關節的慢性炎癥和關節破壞有關，其發病由異常調節性T細胞反應的誘導和進展決定[1-2]。隨著疾病的發展，RA患者關節軟骨和關節囊受到不同程度的損傷，最終導致關節畸形和功能喪失[3]。相關臨床指標有助于醫生更好地評估患者的疾病活動度，進而制訂治療計劃。環狀RNA（circular?RNA，circRNA）是來自后剪接外顯子或內含子的一種特殊RNA，在人類細胞基因表達調控中發揮關鍵作用[4]。臨床中與RA相關的circRNA較多，其中circ-AFF2是由基因AFF2經反向剪接機制形成的共價閉合連續環，可影響轉錄后基因表達調控。研究顯示，circ-AFF2在RA患者外周血中高表達，與疾病的發生、發展密切相關[5]。然而circ-AFF2與RA患者的疾病活動度相關的研究報道較少，本研究旨在探討RA患者外周血和關節滑液中的circ-AFF2表達水平與疾病活動度的關系，現報道如下。

1??資料與方法

1.1??一般資料

選取2019年12月至2022年4月于浙江中醫藥大學附屬湖州中醫院治療的90例RA患者納入RA組，其中男25例，女65例；年齡20～75歲，平均（50.16±6.81）歲。收集同期87例關節損傷患者納入對照組，其中男29例，女58例；年齡20～73歲，平均（50.07±6.73）歲。納入標準：①符合《2018中國類風濕關節炎診療指南》[6]中RA診斷標準；②年齡18～80歲；③入組前未服用過生物制劑、激素、免疫抑制劑或其他影響免疫功能及病情的藥物；④RA和關節損傷患者均存在關節積液，且為膝關節損傷。排除標準：①合并股骨頭壞死、強直性脊柱炎等其他關節疾病及系統性紅斑狼瘡、干燥綜合征、原發性血小板紫癜等其他免疫性疾病者；②嚴重糖尿病、高脂血癥、高血壓或心腦血管疾病者；③有嚴重血液系統疾病、感染性疾病、內科疾病或代謝性疾病者。本研究經浙江中醫藥大學附屬湖州中醫院倫理委員會審批通過（倫理審批號：2020-011-01）。

1.2??方法

1.2.1??外周血與關節滑液的circ-AFF2表達水平檢測??收集兩組患者入組后（治療前）晨起空腹肘靜脈血5ml，置于干燥離心管中分離血清；膝關節腔穿刺采集患者的關節滑液。采用Trizol總RNA提取試劑盒（上海圣爾生物科技有限公司，批號：SB-MR009）分離提取樣品中總RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度及濃度，反轉錄試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司，批號：RP1105）進行反轉錄操作將RNA反轉錄為cDNA。采用美國Applied?Biosystems公司的V115896型實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time?fluorescent?quantitative?polymerase?chain?reaction，qRT-PCR）試劑盒進行擴增反應。qRT-PCR擴增程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，45次循環。反應以GAPDH為內參，反應結束后結果采用2–??CT法計算外周血與關節滑液的circ-AFF2相對表達量。

1.2.2??實驗室指標采集??收集并記錄患者的實驗室指標，主要包括類風濕因子（rheumatoid?factor，RF）、紅細胞沉降率（erythrocyte?sedimentation?rate，ESR）、C反應蛋白（C-reactive?protein，CRP）、抗環瓜氨酸肽（anti-cyclic?cirtrullinated?peptide，CCP）。參考Prevoo計算方式[7]計算RA疾病活動度評分（disease?activity?score-28，DAS28），DAS28=0.56×壓痛關節數+0.28×腫脹關節數+0.7×ln（ESR）×1.08+0.16。根據DAS28-ESR將患者分為低活動度組32例（2.6分

1.2.3??超聲檢查??采用GE?Voluson?E8超聲診斷儀，探頭頻率6～13.5MHz?；颊呷⊙雠P位，屈膝30°～45°，將超聲探頭縱向置于髕骨上端，觀察并記錄滑膜厚度和膝關節髕上囊積液。囑患者盡量屈膝90°，將超聲探頭橫向置于髕骨上端，觀察并記錄滑膜內彩色血流信號、滑膜血流分級、滑膜動脈阻力指數（resistance?index，RI）。

1.3??觀察指標

兩組患者外周血與關節滑液的circ-AFF2表達水平、不同疾病活動度的RA患者外周血與關節滑液的circ-AFF2表達水平、各組患者的性別和年齡及RF、ESR、CRP、CCP、滑膜厚度、滑膜血流分級、滑膜動脈RI。

1.4??統計學方法

采用SPSS?25.0統計學軟件對數據進行分析和處理，其中計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料檢驗后服從正態分布的以均數±標準差（）表示，組間采用獨立樣本t檢驗，三組間采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK法；RA患者外周血和關節滑液中的circ-AFF2水平與實驗室指標的相關性采用Pearson相關分析；RA患者疾病活動度的影響因素采用多因素Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??兩組患者外周血與關節滑液的circ-AFF2表達水平比較

RA組患者外周血與關節滑液的circ-AFF2表達水平均顯著高于對照組（P<0.05），見表1。

2.2??不同疾病活動度RA患者外周血與關節滑液的circ-AFF2表達水平比較

高活動度組患者外周血與關節滑液的circ-AFF2表達水平均顯著高于中活動度組和低活動度組（P<0.05）；中活動度組患者外周血與關節滑液的circ-AFF2表達水平均顯著高于低活動度組（P<0.05），見表2。

2.3??不同疾病活動度RA患者的臨床資料與實驗室指標比較

三組患者的性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。高活動度組患者的RF、ESR、CRP、CCP、滑膜厚度均顯著高于中活動度組和低活動度組（P<0.05），滑膜血流分級、滑膜動脈RI均顯著低于中活動度組和低活動度組（P<0.05）；中活動度組患者的RF、ESR、CRP、CCP、滑膜厚度均顯著高于低活動度組（P<0.05），滑膜血流分級、滑膜動脈RI均顯著低于低活動度組（P<0.05），見表3。

2.4??RA患者外周血和關節滑液的circ-AFF2表達水平與實驗室指標的相關性分析

Pearson相關性分析結果顯示，RA患者外周血和關節滑液的circ-AFF2表達水平與RF、ESR、CRP、CCP、滑膜厚度均呈正相關（P<0.05），與滑膜血流分級、滑膜動脈RI均呈負相關（P<0.05），見表4。

2.5??RA患者疾病活動度影響因素的Logistic回歸分析

以RA患者是否為高活動度為因變量，以外周血circ-AFF2、關節滑液circ-AFF2、RF、ESR、CRP、CCP、滑膜血流分級、滑膜厚度、滑膜動脈RI為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，外周血circ-AFF2、關節滑液circ-AFF2、RF均為RA的獨立危險因素（P<0.05），見表5。

3??討論

RA的主要臨床表現有關節僵硬、局部疼痛、受累關節周圍組織腫脹等，其發病較緩慢，是一種外周關節的非特異性炎癥綜合征[8-9]。進入21世紀以來，人們對RA的病理生理機制及其治療的理解顯著提高，可早期診斷并強化治療，通過定期測量疾病活動度進行密切監測[10-11]。

目前用于評估RA疾病活動度的方法主要包括DAS28、簡化疾病活動指數、臨床疾病活動指數、患者活動量表（patient?activity?scale，PAS）等，但這些評估方法均基于醫生對疾病的主觀或經驗判斷[12-13]。因此醫生在評估疾病活動度時經常出現顯著差異和異質性，可能會影響治療計劃的制定、臨床期望及病情緩解。血液與關節滑液中相關生物指標的變化及其與RA的關系研究是目前臨床研究熱點，尤其是關節滑液中的指標情況更有利于反映局部病灶的變化[14]。本研究檢測RA患者外周血與關節滑液中的circ-AFF2表達均上調，與Qu等[15]研究circ-AFF2在RA滑膜組織中的表達一致。Zhi等[16]通過細胞實驗證實circ-AFF2在RA中表達失調可誘導RA患者成纖維樣滑膜細胞的炎癥反應。據此分析circ-AFF2表達上調對RA疾病發生可能起促進作用，且與其誘導炎癥反應有關。此外，本研究結果中外周血與關節滑液的circ-AFF2表達水平隨疾病活動度增加而升高。研究顯示，RA疾病活動是慢性炎癥發生、發展的過程，臨床通過抑制circ-AFF2表達可有效控制炎癥發生，是治療RA的關鍵[17]。RF、ESR、CRP、CCP、滑膜厚度等實驗室指標均是與RA密切相關的標志物，本研究中circ-AFF2與各實驗室指標均顯著相關，進一步提示circ-AFF2可能參與RA的炎癥病理過程，在疾病活動度進程中發揮促進作用[18]。多因素分析結果顯示，外周血與關節滑液的circ-AFF2表達水平是RA疾病高活動度的危險因素。分析可能原因：RA患者的circ-AFF2表達失調與體內免疫炎癥失衡情況加重密切相關，而隨著circ-AFF2釋放入血和在關節滑液的表達水平增多，最終造成關節炎癥及損傷的進一步加重。

綜上，RA患者外周血與關節滑液的circ-AFF2均呈高表達，且其表達水平隨疾病活動度增加而升高，是影響RA疾病活動度的重要因子。circ-AFF2有可能作為RA疾病活動度新的生物指標，其檢測價值較高。

[參考文獻][1] RIYADH-MOHSEN?E，?ALI?N?H，?ALDAOSERI?H?A.?Immunologic?parameters?for?disease?activity?in?rheumatoid?arthritis[J].?Arch?Razi?Inst，?2021，?76（4）：?1095–1105.