三種結核潛伏感染試驗在HIV感染人群中的應用評價

周崇興 梁大斌 黃彥 崔哲哲 覃慧芳 黃莉雯 區進 葉婧

[摘要]?目的?評價AIMTB和T-SPOT檢測方法在人類免疫缺陷病毒（human?immunodeficiency?virus，HIV）感染人群中結核潛伏感染的診斷效能。方法?收集2022年9～10月在廣西壯族自治區疾病預防控制中心門診就診的HIV感染者的血樣標本，使用雷德AIMTB、迪奧T-SPOT和凱杰QFT三種方法進行檢測，以QFT作為參照對檢測結果進行診斷效能評價。結果?AIMTB方法檢出陽性率為54.6%，敏感度、特異性分別為84.72%、76.19%；T-SPOT方法檢出陽性率為57.6%，敏感度和特異性分別為88.89%、73.02%。AIMTB方法和T-SPOT方法與QFT方法比較結果具有一致性（P<0.001）。結論?AIMTB方法和T-SPOT方法均具有較高的陽性檢出率，與QFT方法的一致性較好，可加大樣本量進一步驗證及推廣。

[關鍵詞]?結核；γ干擾素釋放試驗；結核潛伏感染

[中圖分類號]?R446.5??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.16.006

Evaluation?of?three?latent?tuberculosis?infection?tests?in?HIV-infected?population

ZHOU?Chongxing，?LIANG?Dabin，?HUANG?Yan，?CUI?Zhezhe，?QIN?Huifang，?HUANG?Liwen，?Ou?Jin，?YE?Jing

Guangxi?Zhuang?Autonomous?Region?Center?for?Disease?Control?and?Prevention，?Guangxi?Key?Laboratory?of?Major?Infectious?Disease?Prevention?and?Control?and?Biosafety?Emergency?Response，?Nanning?530028，?Guangxi，?China

[Abstract]?Objective?To?evaluate?the?effectiveness?of?AIMTB?and?T-SPOT?tests?in?the?diagnosis?of?latent?tuberculosis?infection?in?human?immunodeficiency?virus?（HIV）?infected?population.?Methods?Collect?blood?samples?from?HIV-infected?patients?in?the?outpatient?department?of?Guangxi?Zhuang?Autonomous?Region?Center?for?Disease?Control?and?Prevention?from?September?to?October?2022.?The?blood?samples?were?tested?by?three?methods：?AIMTB，?T-SPOT?and?QFT?test.?The?test?results?were?evaluated?by?diagnostic?tests?with?QFT?as?a?reference.?Results?The?positive?rate?of?AIMTB?was?54.6%，?the?sensitivity?and?specificity?were?84.72%?and?76.19%，?respectively.?The?positive?rate?of?T-SPOT?was?57.6%，?the?sensitivity?and?specificity?were?88.89%?and?73.02%，?respectively.?AIMTB?and?T-SPOT?were?consistent?with?QFT?test?（P<0.001）.?Conclusion?AIMTB?and?T-SPOT?have?high?positive?detection?rates，?and?they?are?consistent?with?QFT?test，?which?can?be?further?verified?and?popularized?by?increasing?the?samples.

[Key?words]?Tuberculosis;?Interferon-γ?release?assay;?Latent?tuberculosis?infection

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的呼吸道傳染性疾病，是一種主要致死性傳染病，可對人體健康構成嚴重威脅。據2019年世界衛生組織估算，全球約有17億人感染結核分枝桿菌，這些感染者以隱性感染為主[1]。中國是全球結核病負擔最重的國家之一[2]。結核潛伏感染者可長期沒有臨床癥狀，但5%～10%的感染者有發展為活動性肺結核的風險，如果同時伴有人類免疫缺陷病毒（human?immunodeficiency?virus，HIV）感染，這種風險還會增加[3-4]。因而，篩查結核潛伏感染者并進行積極有效的干預或治療，能從源頭上找出結核病潛在的傳染源并阻止傳播，極大地促進結核病防控，保護人類健康。目前尚無金標準對結核潛伏感染進行診斷，傳統方法主要使用結核菌素皮膚試驗，該方法受到既往感染或卡介苗等影響，實際應用中有一定的局限性。本研究使用γ干擾素釋放試驗，選取雷德AIMTB、迪奧T-SPOT和凱杰QFT三種檢測試劑盒，對139份納入人群的血樣標本進行檢測，探討雷德AIMTB和迪奧T-SPOT檢測方法在結核潛伏感染中的診斷效能。

1??資料與方法

1.1??研究對象

選取2022年9～10月在廣西壯族自治區疾病預防控制中心門診就診的HIV感染者為研究對象，在獲得其知情同意后，問詢既往是否做過結核菌素皮試，既往皮試陽性者納入本研究，既往沒做過皮試或皮試陰性者給予排除，最終共納入139名研究對象。本研究經廣西倫理審查委員會批準開展（倫理審批號：GXIRB2019-0017）。

1.2??方法

對139名符合納入標準的研究對象使用含肝素鋰抗凝劑采樣管采集靜脈血標本12ml。

1.2.1??主要儀器和試劑??酶標儀（賽默飛）；二氧化碳培養箱（賽默飛）；AIMTB試劑盒（雷德）；T-SPOT試劑盒（迪奧）；QFT試劑盒（凱杰），試劑均在有效期內使用。

1.2.2??AIMTB檢測??標本采集混勻后分別取0.6ml抗凝血分裝至三根細胞刺激培養管（N、T、P），37℃培養管直立孵育18～22h，1000g離心5min，收集血漿，加入至AIMTB酶聯免疫吸附試驗微孔板，按照試劑說明書進行酶聯免疫吸附試驗操作和結果判讀。

1.2.3??T-SPOT檢測??標本按以下步驟分離外周血單個核細胞：將等體積RPMI-1640培養液與血標本混勻，緩慢移入含有4ml分離液的離心管，1000g離心22min，取云霧層細胞富集液至含6ml培養液離心管，600g離心7min，棄上清，10ml培養液重懸細胞，350g離心7min，棄上清，加入500μl的培養基，混勻細胞后進行計數，將每個標本的淋巴細胞稀釋至2.5×106個/ml。每個標本設4個檢測孔，分別加入50μl陰性對照、抗原A、抗原B、陽性對照和100μl稀釋后的細胞液，CO2培養箱（37℃，5%?CO2）培養16～20h，培養后按試劑說明書進行染色和結果判讀。

1.2.4??QFT檢測??標本采集混勻后分別取1ml抗凝血分裝至三根細胞刺激培養管（N、T、M），37℃孵育16～24h，3000g離心15min，收集血漿，加入到QFT-GIT酶聯免疫吸附試驗微孔板，按照試劑說明書進行酶聯免疫吸附試驗操作和結果判讀。

1.3??統計學方法

采用SPSS?23.0軟件進行數據處理和統計分析。計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，使用Kappa檢驗進行不同試劑間的一致性比較，對三種試劑的敏感度、特異性、陽性預測值、陰性預測值進行評估，陽性率的比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??三種結核分枝桿菌檢測方法的檢測陽性率

139份標本，AIMTB方法檢出陽性率為54.6%（76/139），不確定2例；T-SPOT方法檢出陽性率為57.6%（80/139），不確定3例；QFT方法檢測陽性率為51.8%（72/139），不確定4例。AIMTB和T-SPOT兩種方法檢出陽性率均高于QFT方法（c2=56.11，102.03，P<0.001），見表1。

2.2??一致性檢驗

本研究以QFT方法作為標準，AIMTB方法和T-SPOT方法與QFT方法比較結果具有一致性（P<0.001），見表1。

2.3??敏感度和特異性檢驗

AIMTB方法的敏感度和特異性分別為84.72%、76.19%，陽性預測值和陰性預測值分別為80.26%、78.69%，約登指數為0.61；T-SPOT方法的敏感度和特異性分別為88.89%、73.02%，陽性預測值和陰性預測值分別為80.00%、82.14%，約登指數為0.62。

3??討論

肺結核是慢性傳染病，由結核分枝桿菌感染所致，是致死率位居第二的傳染病，也是HIV感染者和抗生素耐藥相關死亡的主要原因。據估算，2021年全球新發結核病患者1060萬例，HIV感染者占6.7%[5]。我國是肺結核負擔較高的國家之一，結核病防控面臨巨大的壓力和挑戰，特別是結核潛伏感染人群，基數大且沒有臨床癥狀，5%～10%可發展為活動性結核病患者，如果伴有HIV感染，這個數據還會增加。實驗室檢測是發現結核病患者的主要技術手段，目前常用于結核病診斷的檢測技術主要有涂片鏡檢、痰培養及分子生物學等。涂片鏡檢受樣本質量、涂片技術及閱片經驗的影響，檢出率相對較低，易發生漏診，導致患者未得到及時治療；痰培養同樣受樣本質量的影響，只能診斷活動性肺結核且耗時長，影響結核病早期診斷，延誤治療；分子生物學作為結核分枝桿菌快速試驗，極大縮短檢測時間，可輔助臨床診斷，但需獲得帶菌標本，無法檢測結核潛伏感染者，同時需要配套的設備和試劑價格昂貴?；诔Ｓ脵z測技術存在的不足，尋找新的結核病診斷方法及早期快速準確地發現結核病患者對結核病防控意義重大[6]。γ干擾素釋放試驗的原理是人體感染結核分枝桿菌后，致敏T淋巴細胞存在于體內，當機體再次接觸結核分枝桿菌相應抗原時，體內致敏T淋巴細胞迅速活化為效應T淋巴細胞，釋放出高水平的γ干擾素，γ干擾素的釋放程度可作為一項評估受試對象是否受到結核分枝桿菌感染的指標[7]。盡管γ干擾素釋放試驗也有很多不足，如陽性結果需要結合流行病學資料、影像學資料和其他醫療及診斷結果共同評估，才能得出正確的診斷結果；不能區分是近期獲得的感染還是既往感染的延續；不能區分潛伏性感染還是活動性結核，但并不妨礙該方法作為結核潛伏感染的體外診斷技術逐步推廣，其獨特的技術優勢能更好地輔助結核病防控，深受各國青睞。QFT檢測于2001年在美國獲得許可，開始作為結核病感染的體外輔助診斷技術，是全球最早用于輔助診斷結核分枝桿菌感染的γ干擾素釋放試驗，也是目前世界衛生組織推薦用于結核潛伏感染的診斷方法[8]。艾滋病群體由于免疫力低下，在接受抗病毒治療后結核潛伏感染往往被低估；但在中國西安開展的HIV陽性人群QFT檢測研究中發現，其陽性率高于傳統檢測方法，γ干擾素釋放試驗更適合在免疫力低下的合并HIV感染人群中開展結核分枝桿菌潛伏感染檢測[9]。

雷德AIMTB是近幾年上市的用于γ干擾素釋放試驗的國產試劑，該試劑選擇在卡介苗和大多數非結核普遍缺失的早期分泌抗原6（early?secretory?anti-gen-6，ESAT-6）和培養濾液蛋白10（culture?filtrate?protein?10，CFP-10），通過基因工程技術修飾后表達成為刺激抗原，與新鮮采集的抗凝全血混合孵育后，用酶聯免疫吸附試驗檢測特異性釋放的γ干擾素水平，進而判定檢測結果。本研究顯示AIMTB方法檢測的陽性率為54.6%，略高于QFT的51.8%。AIMTB采用三聯管和標簽設計，能夠適應大批量樣本檢測需求，QFT的刺激管需多管標記，抗原混勻步驟相對煩瑣，兩者都使用酶聯免疫吸附試驗技術進行后期操作和結果判讀；AIMTB操作步驟相對QFT更簡化，所需樣本量更少，具有一定的優勢。T-SPOT試劑使用酶聯免疫斑點技術檢測經結核特異性抗原ESAT-6、CFP-10肽段庫刺激后外周血單個核細胞的γ干擾素釋放，經一系列反應后斑點顯示判讀結果。研究發現T-SPOT是最敏感的檢測結核抗原特異性T淋巴細胞的技術之一[10]。本研究結果顯示T-SPOT方法檢出陽性率為57.6%，高于QFT的51.8%。T-SPOT方法檢測結果受患者的性別、年齡和免疫狀況等因素影響較小，現廣泛應用于臨床預防性治療的輔助診斷[11-12]。Talati等[13]研究顯示，在HIV感染群體中，CD4細胞數的多少與QFT陽性率相關，但與T-SPOT的陽性率無關，這也很好地解釋本研究T-SPOT的陽性率高于QFT的原因。相對于QFT方法使用三種蛋白（ESAT-6、CFP-10、TB7.7）的混合多肽刺激肝素化全血中的致敏T淋巴細胞，T-SPOT方法在成本和抗干擾因素方面有一定的優勢，但其通過分離液收集淋巴細胞，且需將淋巴細胞稀釋至相應濃度再進行檢測、人工計數和分析，操作方法更為煩瑣，結果誤差相對較大。

以QFT試驗作為評價標準分析兩種檢測方法的一致性，AIMTB檢測方法的Kappa值為0.583，具有中等一致性，T-SPOT檢測方法的Kappa值為0.625，一致性較高。本研究中T-SPOT方法的敏感度為88.89%，特異性為73.02%，與De?Keyser等[14]研究結果基本相符。AIMTB的敏感度略低于T-SPOT，特異性略高于T-SPOT。AIMTB方法和T-SPOT方法的陽性預測值均能達到80%，陰性預測值均高于78%，兩種方法的診斷價值較高；兩種方法的約登指數分別為0.61和0.62，說明兩種方法的檢測效果較好，真實性可靠。

本研究的三種γ干擾素釋放試驗均可用于結核潛伏感染的檢測，主要用于輔助診斷結核病感染，可較好地區分非結核分枝桿菌和結核分枝桿菌感染，敏感度和特異性均較高，結果可重復性強，但不能鑒別是否為活動性肺結核[15]。其他分枝桿菌感染（堪薩斯分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、海分枝桿菌等）也可能會導致結果陽性，這也給檢測結果的真實性和準確性帶來挑戰。以世界衛生組織推薦的QFT方法作為評價標準，AIMTB和T-SPOT方法均有較好的一致性和符合率，但由于“金標準”的缺乏，兩種方法的敏感度和特異性評價可能存在偏差[16]。本研究納入的研究對象為HIV感染者，此類人群免疫力相對低下，感染結核病的風險增加，這也是檢測結果陽性率較高的原因之一。在國外開展的一項健康人群監測中，γ干擾素釋放試驗的陽性率為23%，遠低于本研究結果[17]。在HIV感染人群中開展γ干擾素釋放試驗，能夠盡早發現雙重感染者，從而盡早開展預防性用藥或治療，提高患者的生活質量，減少結核病傳播風險，降低結核病病死率。

[參考文獻][1] World?Health?Organization.?Global?tuberculosis?report?2019[R/OL].?（2019-10-15）[2023-05-24].?https：//www.?who.int/publications/i/item/9789241565714.

[11] 盧青純，?唐小燕，?熊恬園，?等.?T-SPOT.?TB試驗在活動性結核診斷中的價值及其影響因素分析[J].?中國循證醫學雜志，?2014，?14（5）：?522–526.