辣椒分子育種研究進展

雷建軍， 朱張生， 陳長明， 曹必好，陳國菊， 鄭婕， 吳昊， 肖艷輝，蔣園園， 原遠， 廖毅， 宋佳麗

1. 韶關學院 英東生物與農業學院，廣東 韶關 512005；2. 華南農業大學 園藝學院/農業農村部 華南地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，廣州 510642；3. 廣東省嶺南現代農業實驗室，廣州 510642

辣椒是一種十分重要的蔬菜作物, 其栽培面積在我國蔬菜作物中位居第一． 辣椒常規育種近年來取得了很大的成就, 對辣椒產業的發展做出了重要貢獻, 今后仍然是不可缺少的重要育種途徑和方法． 但隨著資源的不斷利用, 要想在短時間內取得重大突破, 僅靠常規方法是很難實現的． 分子標記和基因工程可以輔助常規方法, 提高育種效率, 創造常規方法難以實現的新種質, 為選育優良品種提供更多的方法和保障．

分子育種包括2個方面, 一是分子標記輔助育種, 廣義的分子標記包括同工酶標記和DNA標記, 本文重點介紹DNA分子標記, 在不加說明的情況下均指DNA標記; 一是通過基因工程創造優良資源, 它是今后辣椒育種的重要育種方法的補充和發展方向． 近年來, 辣椒分子育種取得了重要進展, 為分子育種與常規育種的緊密結合使辣椒新品種選育取得重大突破奠定了基礎． 目前這方面的綜述文章不多, 或者已經過時． 本文旨在對這方面的進展作一綜述．

1 分子標記

1.1 分子遺傳圖譜的構建

1988年, 康乃爾大學的Tanksley等[1]構建了世界上第一個辣椒的遺傳圖譜, 隨后Prince等[2]、 Lefebvre等[3]相繼報道了圖譜構建結果． Paran等[4]利用已有的數據整合構建的圖譜, 包含了2262個標記, 覆蓋了1 832 cM, 其中AFLP標記1528個, RFLP標記440個, RAPD標記288個． 我國在這方面的進展也很大[5-12]． 盡管圖譜構建的報道很多, 但仍然沒有達到飽和, 仍需要繼續找出更多的標記, 構建更飽和的圖譜才能更好地應用． Tamisier等[13]用256個核心種質資源進行基因組測序, 然后進行關聯分析, 得到的結果與通過構建作圖群體得到的結果是一致的． 詳細情況見表1．

表1 辣椒遺傳圖譜特性

1.2 質量性狀的分子標記

質量性狀的分子標記可為分子標記輔助選擇提供方便． 迄今為止標記的質量性狀見表2．

表2 部分質量性狀的分子標記

1.2.1 抗病性

1.2.1.1 對馬鈴薯Y病毒的抗性． 根據病毒與寄主抗性基因的相互關系, 該病毒可劃分為3個小種: PVY(0), PVY(1)和PVY(1.2)． 目前在辣椒上已發現了6個單抗基因,pvr1,pvr2,pvr3,pvr4,pvr5,pvr6和一組QTL[14-15]． Caranta等[16]找到了pvr4的分子標記, 最近的標記只有2.1 cM(表2)． Tamisier等用關聯分析法, 通過基因組測序法找到了抗馬鈴薯Y病毒基因的SNP分子標記(位于4,6,9,12號染色體)[13]．

1.2.1.2 對番茄斑點萎蔫病毒的抗性． 目前已經在第10號染色體上找到了抗Tsw的分子標記, 較遠的為3.4 cM[17], 最近的只有0.9 cM[18]．

1.2.1.3 對TMV的抗性． 辣椒對TMV的抗性是由L基因控制的,L有一系列等位基因,L1位于一年生辣椒的第11號染色體, 離番茄的RFLP標記TG36較近(6 cM)． Matsunaga等[19]找到了它的RAPD標記, 并已經轉化成SCAR標記(1.5 cM)．

1.2.1.4 對瘡痂病的抗性． 瘡痂病病原菌有7個生理小種, 每一個小種都有一個抗性基因對應,Bs1抗第0, 2, 5小種,Bs2抗0, 3小種,Bs3抗0, 1, 4小種, 目前尚未找到抗小種6的材料． Tai等[20]用野生辣椒(C.chacoense)作抗源, 與一年生辣椒雜交得到了近等基因系后進行分子標記研究, 得到了與抗病基因共分離的AFLP標記(A2)． Pierre等[21]找到了與BS3相連鎖的分子標記, 相距1 cM．

1.2.1.5 對根結線蟲的抗性． 目前報道的抗根結線蟲的基因有N,Me1,Me2,Me3,Me4,Me5．Me3和Me4在同一個連鎖群中, 相距10 cM, 位于第7或12號染色體上． 目前找到的標記離它只有0.5 cM[22]．

1.2.2 果實性狀

1.2.2.1 辣味． 辣味是由顯性單基因C(也稱Pun1)控制的． Blum等[23]找到了與它共分離(距離為0 cM)的RFLP標記． Minamiyama等[24]找到了與它緊密連鎖的RAPD標記(3.6 cM)． Tamisier等[13]用256個辣椒材料, 通過基因組測序方法進行關聯分析, 得出了更詳細的結果, 將抗性基因定位在第4,6,9和12號染色體上．

1.2.2.2 果色． 類胡蘿卜素決定成熟果色, 花色素和葉綠素決定未熟果的果色． 成熟果色的遺傳起初報道是受3個獨立基因Y,C1和C2控制[25]． 類胡蘿卜素的合成途徑已經完全清楚,Y基因編碼辣椒紅色素-辣椒紅素合成酶(CCS), 因為Y與CCS完全共分離, RFLP分析表明, 不辣的辣椒中, 完全缺乏Y[26]．C2與編碼八氫番茄紅素合成酶基因共分離[27]． 褐色成熟果是由于紅色的類胡蘿卜素與葉綠素共同積累所致, 這是受隱性基因Cl控制的[28]． 當基因型為ycl時, 成熟果為綠色．Cl已經定位到第1號染色體, 但還不知道葉綠素分解代謝過程中哪個基因與它共分離[29]． 紫色未熟果是由A控制的, 是開花后積累花青素所致．A已經定位到第10號染色體[30], 后來證明它與矮牽牛中的花色素2(An2)共分離,An2是R2R3MYB轉錄因子基因, 它調控花色素的生物合成[31]．

1.2.2.3 果實質地． 柔軟的果肉是由顯性單基因S控制的, 已經定位于第10號染色體, 該基因與番茄中的多聚半乳糖醛酸酶基因共分離[32]．

1.2.2.4 果實著生方式． 族生果是由隱性單基因fa控制的． 它位于第6號染色體, 與番茄中的自封頂基因SP共分離(私人通訊)．

1.2.3 育性

Zhang等[33]報道了2個與育性恢復連鎖的RAPD標記．

1.3 數量性狀的QTL分析

數量性狀不能依照質量性狀的處理方法將單個基因的效應區別開來． 復雜的數量性狀可剖分為若干離散的孟德爾因子所決定的組分, 進而確定其在染色體上的位置及其與其它基因的關系和貢獻的大小． 有些性狀既是質量性狀, 也是數量性狀, 取決于所用的材料和判斷標準, 例如, 抗病性如果把3級以下的都定為抗病, 3級以上定為感病, 這就是質量性狀, 否則是數量性狀． 目前進行過QTL定位分析的性狀有對CMV的抗性、 對疫病的抗性、 對馬鈴薯Y病毒的抗性、 對白粉病的抗性、 對炭疽病的抗性、 果實大小、 果實形狀、 辣度和雄性不育的恢復等(表3)．

表3 辣椒QTL分析

1.4 分子標記輔助選擇

分子標記的最終目的是應用于選擇, 尤其是數量性狀, 因為數量性狀根據表型的選擇是不太準確的． 近年來應用分子標記進行輔助選擇有所增加． Thabuis等[34]將辣椒的抗疫病的特性轉育到了甜椒中． 李怡斐等[35]利用抗疫病的分子標記對獲得的雙單倍體進行篩選, 獲得了14個抗疫病的材料． 王春萍等[36]用12個辣椒疫病抗性相關分子標記進行輔助篩選, 不同的分子標記的篩選效率有較大的差異, 最高的為87.5%, 有些根本無法應用． 王立浩等[37]對馬鈴薯Y病毒的抗性進行了分子標記輔助選擇． 郭廣君等[38]用與抗性基因qCmr2.1緊密連鎖的3個InDel分子標記輔助選擇, 提高了選擇效率． 李怡斐等[39]用雄性不育分子標記CRF-SCAR 對BC6F1的75 個單株進行分子標記輔助選擇驗證, 正確率為100%． Tanaka等[40]報道: 辣椒素酯類物質是辣椒果實中低辣味的辣椒素類似物． 其生物活性與辣椒素類物質相似, 有抑制脂肪積累和抗氧化等特性． 以前的遺傳研究表明,p-AMT和Pun1兩個基因控制辣椒素酯的合成, 這兩個基因分別表示為A、 B． 基因型為aaBB和aaBb的植株果實中含辣椒素酯, 辣味較低． 他們利用p-AMT和Pun1基因的DNA標記選育了一個含有辣椒素酯類物質的辣椒新品種． Murasaki(AAbb)和CH-19 Sweet(aaBB)雜交后代的基因型都用DNA標記進行了鑒定． p-AMT基因型利用dCAPS標記鑒定, Pun1基因型用SCAR標記鑒定． 分析雜交后代的基因型, 篩選出基因型aaBB或者aaBb的植株并培育出了一個新品種Maru Salad． Maru Salad 果實的辣椒素酯含量為700 μg/g DW． 同時Maru Salad的果實比CH-19 Sweet大, 而且適合鮮食． Kim等[41]用固定效率的標記輔助篩選辣椒素含量不同的材料, 比以前的分子標記輔助選擇的效率提高了很多． Ren等[42]用分子標記輔助選擇育性恢復基因．

2 辣椒素類物質和紅色素物質生物合成的分子機理

2.1 辣椒素類物質

從辣椒中分離到的辣椒素類物質已超過23 種[43-44], 命名的辣椒素類包括辣椒素、 二氫辣椒素、 辛酸香草酸胺、 降二氫辣椒素、 高辣椒素和葵酸香草酞胺等, 其余的尚未命名． Stewart等[45]報道, 在已發現的辣椒素類物質中, 辣椒素和二氫辣椒素約占辣椒果實中總辣椒素類物質含量的91%以上, 并提出了辣椒素生物合成的模型．

基于前人的研究, Mazourek等[46]全面分析了辣椒素類物質合成代謝網絡, 用生物信息學的方法建立了辣椒素類物質生物合成模型, 包括苯丙氨酸生物合成、 辣椒素合成的直接前體香草基胺的合成、 支鏈氨基酸合成和代謝以及支鏈脂肪酸的合成等鏈脂肪酸的合成等4方面, 其中后兩條途徑最終可產生各種不同的酰基, 認為其參與不同辣椒素類物質的生物合成． 張正海等[47]根據前人的結果[48-49]提出了一個翻譯成中文的較全面的辣椒素生物合成模型．

Kim等[48]根據測序結果, 講了一個辣椒素生物合成的故事, 進一步證實了辣椒素合成的基因的重要性, 在茄屬中, 番茄與辣椒相比, 合成路徑中, 前面的基因都一樣, 只有最后一個結構基因不一樣． 根據這樣的設想, 我們曾經將辣椒素合成基因導入到番茄中, 但沒有得到預期結果, 轉基因番茄并沒有辣椒素的合成． Naves等[50]提出了辣味番茄的設想．

辣椒素生物合成的結構基因的分離和克隆及功能鑒定, 有很多報道[51]． 比較好的研究結果如下: Arce-Rodríguez等[52]報道, R2R3-MYB(MYB31)調控辣椒素的合成, 同時在營養器官中也有表達, 而且受吲哚乙酸、 茉莉酸、 水楊酸、 赤霉素、 創傷、 溫度和光照的影響, 說明該轉錄因子不僅僅影響辣椒素的合成, 可能還影響其他反應． Koeda等[53]報道, 在中國辣椒(C.chinense)中, 有些品種沒有辣椒素是因為辣椒素合成最后一級的乙酰轉移酶(AC)基因、 上游的假定轉氨酶(pAMT)基因和酮脂酰-ACP合成酶(CaKR1, 也稱KAS)基因突變造成的． 作者課題組取得了更進一步的結果: 回答了中國辣椒為什么比其他4個種更辣的問題, 中國辣椒中, 與最重要的MYB31互作的WRKY9的啟動子區域是正常的, 但其他4個種的啟動子都發生突變, 導致這兩個轉錄因子不能很好互作[54]． 后來我們又證明MYB48[55]ERF102和ERF111[56]在辣椒素合成中也起很重要的作用． Shams等[57]的研究證明在鹽脅迫下, 辣椒素的含量增加． Wen等[58]的研究證明乙烯可以誘導AP2/ERF的表達, 進一步調控辣椒素的合成． Yu等[59]證明MYB24能夠負調控辣椒素的合成． Liu等[60]證明CabHLH007, CabHLH009, CabHLH026, CabHLH063, CabHLH086可以調控辣椒素的生物合成, 并還能與辣椒素生物合成的主要調控轉錄因子MYB31互作調控辣椒素的生物合成．

2.2 辣椒紅色素

辣椒紅素是類胡蘿卜素的生物合成途徑的代謝終產物, 其生物合成途徑從牻牛兒基焦磷酸(GGPP)開始． 首先, 八氫番茄紅素合成酶(Psy)轉化2分子的GGPP生成八氫番茄紅素; 其次, 在八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)作用下, 被氧化成番茄紅素; 接下來番茄紅素下游產生兩個分支, 一個分支是番茄紅素在LCYb和lCYe兩種酶的共同催化下形成α-胡蘿卜素, 在Crtz酶和O2共同作用下最終形成葉黃素; 另一個分支是番茄紅素被單一酶LCYb催化形成β-類胡蘿卜素, 最終經過一系列酶和O2的共同參與下形成辣椒紅素和辣椒玉紅素[61]． 在未成熟的辣椒果實中, Lcyb和lcye這兩種酶都存在, 但Ccs不表達, 故β-胡蘿卜素和葉黃素是主要的類胡蘿卜素; 進入綠熟期后Ccs開始表達并逐漸增強, 玉米黃質被Ccs催化形成辣椒紅素, 辣椒紅素的量開始不斷積累, 辣椒果實顏色開始由綠色轉為紅色[61]． 研究表明, 黃色和橙色辣椒果實中因Ccs缺失, 玉米黃素不能繼續往下游產物轉化, 果實顏色為橙色或黃色[62]． Tian等[63]分析了合成辣椒紅素和辣椒玉紅素的基因Ccs的啟動子中的重復序列對基因表達的影響, 結果表明, 不存在劑量效應, 可能存在未知效應． 辣椒紅素/辣椒玉紅素合成酶(Ccs)基因發生突變會導致辣椒果實的顏色變化, 由紅色變成黃色或其他顏色[61, 64-65]． 辣椒紅素/辣椒玉紅素合成途徑上游的八氫番茄紅素合成酶(PSY)的內含子發生突變后紅色果變成了橙色果[66]． β胡蘿卜素羥化酶(CHY2)基因發生突變后紅色果變成橙色[67]． 玉米黃素環氧酶(ZEP)發生突變后, 黃色果變成橙色果[68]．

我們的研究表明, CaERF82, CaERF97, CaERF66, CaERF107 and CaERF101的表達量與辣椒紅素的積累呈正相關[69]． 進一步研究表明, R-R型MYB轉錄因子DIVARICATA1編碼一個核定位的轉錄激活因子, 沉默DIVARICATA1顯著降低了辣椒紅素合成相關基因PSY,PDS,β-CH1和CCS的轉錄, 對應的辣椒紅素含量也顯著降低[69]． Ma等[70]報道CaBBX20(鋅指轉錄因子)可以調控辣椒紅素的生物合成． Hattan等[71]首次報道利用基因工程技術在大腸桿菌中生產辣椒紅素, 但產量很低．

其他方面的詳細情況見雷建軍等的綜述[72]．

3 雄性不育分子機理

3.1 核雄性不育

Cheng等[73]對辣椒雄性不育兩用系的可育株和不育株進行了轉錄組和蛋白組分析, 找出了一些與花藥壁和花粉外壁發育相關的基因． Dong等[74]報道, 可育株與不育株相比, 不育株的Capana10g000198(編碼CaMYB80)的第三個外顯子插入163bp, 形成了一系列終止子, 而可育株是正常的．

3.2 質核互作雄性不育

質核互作雄性不育也稱細胞質雄性不育． 位于辣椒細胞質線粒體中的雄性不育基因主要包括:orf165[75]、orf456和coxII[76]、orf507[77]、ψatp6-2[78]等．orf456是必須的, 但僅有它不足以產生雄性不育, 還必須有其他基因參與[79]． Guo等[80]對不育系和保持系進行了蛋白組學分析, 證明線粒體與雄性不育有關． Nie等[81]通過精細定位發現CaRfHZ最有可能是育性恢復基因．

4 抗病分子機理

植物中的轉錄因子DoF, WRKY, MYB, NAC, bZIP, ERF, ARF和HSF調控植物對生物和非生物逆境的抗性[82]． Hussaina等[83]對辣椒中的WRKY進行了綜述．

4.1 青枯病

Dang等[84]報道, CaWRKY27可以正向調控對青枯病的抗性． Mou等[85]報道, CaHDZ27可以正向調控辣椒對青枯病的抗性． Cheng等[86]認為CaLRR51可以正向調控辣椒對青枯病的抗性．

Huang等[87]報道, CaASR1正調控辣椒對青枯病的抗性． Yang等[88]的研究表明, CaMLO6是青枯病的負調控因子(與抗逆性相反), 部分受CaWRKY40的調控． CaWRKY28 Cys249復合體是CaWRKY40調控辣椒對青枯病菌免疫所必須的[89]． Shen等[90]報道, CaCBL1沉默后, 對青枯病的抗性明顯降低, 在高溫下更明顯． Shi等[91]報道, CaPti1-CaERF3復合體共調控辣椒對青枯病的抗性, 同時也耐脫水． Hussain等[92]認為, CaASHH3正向調控辣椒抗青枯病． CaCDPK29-CaWRKY27b復合體促進CaWRKY40調控的辣椒對青枯病的抗性[93]．

4.2 疫病

Cheng等[94]的研究表明, CaWRKY08-4和CaWRKY01-10兩個轉錄因子在抗病的CM334受疫病菌浸染后高表達, 而在感病的EC01中沒有變化． Kang等[95]報道, Dof轉錄因子可以調控辣椒對疫病的抗性． Zhang等[96]報道, CaSBP12負向調控辣椒對疫病的抗性． 后來又從辣椒中分離15個SPB轉錄因子基因, 證明CaSBP08和11是2個負向調控因子, 沉默后抗病性明顯增強, 在煙草中超表達植株, 病情指數明顯增加[97-98]． Ali等[99]報道, CaChiVI2為辣椒的抗疫病基因, 同時也抗熱． Du等[100]報道, 辣椒疫病的抗性受表觀遺傳的調控． Nabor-Romero等報道, 辣椒對疫病相關的防衛基因(PR-1b,CaWRKY58,CPI,MIR,HMG和PAL)的表達會受到根結線蟲的影響[101]．

4.3 炭疽病

辣椒醇對辣椒炭疽病菌有明顯的抗性, 接種病原菌后, 辣椒醇生物合成相關基因的表達量增加了50多倍, 但尚未作轉基因鑒定[102]． Lee等[103]從抗病辣椒中分離出抗菌蛋白基因CaAMP1可以抗多種病害(17種病原菌), 其中對炭疽病的抗性研究得比較清楚． Son等[104]報道, 只存在于C.baccatum中的CbCN能夠抗炭疽病．

4.4 枯萎病

Lee等[103]報道將辣椒的CaAMP1在擬南芥超表達對枯萎病的抗性明顯增強．

4.5 病毒病

Kang等[95]報道, Dof轉錄因子可以調控辣椒對TMV和辣椒斑駁病毒的抗性． CaNAC1可以調控對斑駁病毒的抗性[105]． Zhao等[106]報道, 抗病辣椒品種可以通過生長素途徑基因的超表達而產生過敏性壞死反應而抗病．

4.6 瘡痂病

Wang等[107]從抗病的柔毛辣椒(Capsicumpubescens)中分離一個廣譜性的抗瘡痂病的基因導入到水稻中, 提高了水稻對白葉枯病的抗性． Sendin等[108]從Capsicumchacoense中分離了CcBs2基因(抗瘡痂病基因)導入到柑橘中后, 使柑橘對潰瘍病的抗性大大增強．

4.7 白絹病

Liao等[109]報道了辣椒受白絹病病原菌浸染后的蛋白組和代謝組的變化．

5 抗逆分子機理

5.1 結構基因與抗逆性的關系

與抗旱相關的結構蛋白主要包括CaOSR1[110]、 CaWDP1[111]、 CaREL1[112]、 CaDIL1[113]、 CaDRHB1[114]、 DIK1[115]、 CaCIPK3[116]、 CaCIPK7[117]、 CaHsp25.9[118]、 CaAIRE1[119]、 CaAIMK1[120]、 Ca CIPK7[117]、 CaSIP1[121]、 CaDIMK1[122]、 CaHSP18.1a[123]、 CaUBP12[124]．

耐熱的包括HSP70sHSP[125-126]、 Ca PMT6[127]、 CaChiVI2[99]、 CaHsp25.9[128]、 Ca DHN4[129]、 CaHSP22.5[130]等．

耐低溫的包括: CaLTSF1和CaLTSF2[131]、 CaCIPK13[132]、 CaTPS1[133]、 CaSPDS[134]、 CaDHN5[135]、 CaTPS1[133]、 CaSPDS1和CaSPDS4[134]等．

耐鹽的包括CaDHN5[135]、 CaDHN4[129]、 CaHsp25.9[118]、 CaFAF1[136]、 CaTPS1[133]、 CaCP34[136]、 CaHSP18.1a[123]等．

同時抗多種逆境的有CaHSP18.1a[123]、 CaFtsH06[137]、 CaDHN3[137]、 AGL8[138]等．

5.2 調控因子與抗逆性的關系

調控抗旱的轉錄因子包括CaATBZ1[139]、 CaWRKY27[84、 140]、 CaDRHB1[141]、 CaWRKY1和CaWRKY41[142]、 CaHsfA1[143]、 MYB1[116]、 CaGRA1[143]、 CaNAC072[144]、 CaNAC46[145]等．

調控耐熱的有CaNAC2[146]、 CaWRKY40[88]等．

調控耐低溫的有CaNAC2[146]、 CaALAD[147]等．

調控耐鹽的有CaNAC46[145]．

調控多種逆境的有CaHsfA2[148]、 CaMADS[149]、 CaNAC035[150]和CabHLH79[151]等．

6 分子育種改良

隨著基因工程研究的不斷深入, 越來越多的目的基因已經分離出來, 并且轉基因辣椒也越來越多, 在辣椒上, Liu等[152]在1990年首次報道用農桿菌介導對辣椒進行遺傳轉化的結果, 獲得了冠癭瘤, 但未獲得轉基因植株． 從此以后, 這方面的報道越來越多, 下面作一簡要介紹:

6.1 抗病

Shin等[153]將煙草中的逆境誘導基因Tsi導入到辣椒中獲得了廣譜性(病毒、 細菌和卵菌)抗性．

6.1.1 病毒病

在抗病基因工程中, 抗病毒基因工程進展最快, 取得的成果最多, 尤其在通過導入病毒外殼蛋白基因獲得抗病毒的轉基因植株方面, 有很多將病毒外殼蛋白基因導入辣椒的報道．

6.1.1.1 外殼蛋白基因． Murphy等[154]用電激法轉化將辣椒斑駁病毒和CMV病毒外殼蛋白基因轉入5個辣椒品種的原生質體, 成功獲得了轉基因辣椒． Xu等[155]對轉CMV和TMV外殼蛋白基因的紅椒分別進行CMV和CMV-RNA接種侵染, 轉化植株對CMV和CMV-RNA表現出很高的抗性． 周鐘信等[156]將CMV cp基因轉入了西椒1號． Yu等[157]也將CMV cp基因轉入了中華2號． 畢玉平等[158]將TMV和CMV外殼蛋白基因同時導入到辣椒中, 獲得了對TMV和CMV免疫的植株． 李華平等[159]將黃瓜花葉病毒衣殼蛋白基因轉入了華椒l7號, 獲得了抗病植株． 郭亞華等[160]獲得了抗CMV和TMV的轉基因植株． 商鴻生等[161]獲得了抗CMV和TMV辣椒植株, 并可以遺傳．

我國發放了安全證書的轉基因園藝植物總共只有5例, 抗CMV轉基因甜椒就是其中的一例, 但沒有推廣, 估計是其它經濟性狀不理想．

6.1.1.2 衛星RNA． Kim等[162]用CMV衛星RNA互補DNA導入辣椒, 并在后代中穩定表達和遺傳． 董春枝等[163]將CMV衛星RNA互補DNA導入到辣椒, 獲得了抗病性有所增強的轉基因植株．

6.1.1.3 商陸抗病毒蛋白基因． 陳國菊等[164]將中國商陸抗病毒蛋白基因導入到辣椒中, 獲得了對病毒抗性增強勞動轉基因植株． 高玉堯等[165]將商陸抗病毒蛋白與蘇云金桿菌毒蛋白基因構建雙價載體導入到辣椒中獲得了抗蟲病毒的植株．

6.1.2 抗真菌病害

Kim等[166]通過農桿菌將RIP基因轉入辣椒獲得了抗真菌病害的植株． Zhu等[167]獲得了同時表達幾丁質酶和β-1, 3-葡聚糖酶的轉基因辣椒植株, 其抗真菌能力大大提高． 包良帥等[168]將辣椒煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸基因在辣椒中超表達使辣椒對疫病的抗性明顯增強． Bagga等[169]將野生馬鈴薯中的RB基因導入到辣椒, 獲得了對疫病的抗性． Zhang等[98]通過敲除CaSBP11(負向調控的轉錄因子)提高了辣椒對疫病的抗性． Mishra等[170]利用基因編輯技術, 將炭疽病負向調控因子CaERF28突變后, 使辣椒對炭疽病的抗性得到明顯的提高, 用VIGS技術沉默后也取得了很好的抗病效果．

6.1.3 抗細菌病害

目前已知的抗細菌的基因主要有抗菌肽類、 溶菌酶類和抗菌蛋白類, 其中以昆蟲抗菌肽類基因工程研究最多、 發展最快． 張銀東等[171]用農桿菌介導法將抗菌肽基因導入辣椒品種‘雪峰’中, 獲得了再生植株． 李乃堅等[172]將昆蟲抗菌肽B、 D基導入5個辣椒栽培品種, 轉基因植株具有較強的抗病力． 李穎等[173]在獲得轉抗菌肽基因辣椒后, 對后代經過多代定向選育, 獲得了遺傳穩定的抗青枯病的辣椒株系．

6.2 抗蟲

目前應用廣泛的抗蟲基因主要有Bt、CpTI(豇豆胰蛋白酶抑制劑基因)和植物凝集素基因等． 柳建軍等[174]將基因CpTI轉入了辣椒中, 獲得了抗蟲植株． 王朋等[175]也將CpTI轉入辣椒． 袁靜等[176]將蘇云金桿菌晶體毒蛋白基因cryIAc導入到辣椒中． Zhu等[177]將Cry2Aa2基因導入到辣椒中, 獲得抗性增強的轉基因植株．

6.3 抗除草劑

Tsaftaris等[178]將pat導入辣椒, 轉基因辣椒能夠耐受0． 44%濃度的商品除草劑Basta(含20%膦絲菌素), 對PPT的耐受能力大大提高． Ortega等[179]將EPSPS導入到辣椒中, 使辣椒獲得了對草甘膦的抗性．

6.4 耐鹽

林棲鳳等[180]在人工授粉后10～16 h, 切除柱頭, 將供體紅樹DNA(濃度為0.5 mg/mL)滴于切口處． 轉基因植株的耐鹽性明顯增強, 在海灘上試種, 用海水直接澆灌, 約55%的轉化株能開花、 結果, 而對照株全部死亡． Subramanyam等[181]將煙草的耐鹽基因基因導入到辣椒中, 獲得了耐鹽性增強的植株． Bulle等[182]將小麥的耐鹽基因導入到辣椒后, 獲得了耐鹽性增強的轉基因植株． Shivakumara等[183]將豌豆耐鹽基因導入到辣椒后獲得了耐鹽性增強的辣椒植株．

6.5 耐旱

Zhu等[177]將擬南芥的抗旱基因HDG11與抗蟲基因一起導入到辣椒中, 獲得了既耐旱又抗蟲的轉基因植株． Jeong等[120]將辣椒CaAIMK1超表達獲得了抗旱性增強的轉基因植株．

6.6 耐熱

Huang等[127]將CaPMT6在辣椒中超表達后, 可以增強辣椒的耐熱性．

6.7 耐寒

王興娥等[184]將冷誘導基因CBF4導入到辣椒中, 獲得了耐寒性增強的植株．

6.8 雄性不育

我們利用Cre/lox定位重組系統, 將lox和barnae基因構建在同一個表達載體中, 將Cre序列構建到另一個表達載體中, 將前者導入將來制種的F1母本, 將后者導入父本, 母本便可育成雄性不育系, 與父本雜交后, 由于Cre與lox相遇, 可以自動地從lox位點(barnase位于2個lox之間)切除, 從而使F1可育, 這樣便解決了辣椒恢復系的問題[185]．

6.9 辣椒紅素

Furubayashi等[186]將辣椒紅素的兩個關鍵基因CaCCS和CaZEP導入到大腸桿菌中, 轉基因大腸桿菌產生了辣椒紅素．

7 展望

7.1 存在的問題

辣椒分子育種研究取得了重要進展, 但由于它的復雜性, 目前在育種上成功應用的實例并不多, 存在的主要問題有:

1) 分子標記離目的基因較遠, 選擇效率不高．

2) 分子標記輔助選擇的成本比較高, 操作麻煩． 大多數育種單位不具備條件, 因此即使有較好的分子標記可用, 實際上絕大多數單位并沒有用．

3) 遺傳轉化技術體系不夠完善． 辣椒的器官分化較容易, 但芽的伸長很困難, 對基因型的依賴太大, 往往是能夠轉化的, 其它經濟性狀不太好, 經濟性狀好的不容易轉化． 加之優良品種的生命周期較短, 即使當時用了最好的材料作轉化的受體, 但經過若干年的成功轉化后, 這個品種的其它經濟性狀已經落后了．

4) 人們對轉基因產品的疑慮沒有消除． 有一部分人總是擔心轉基因產品不安全, 加上世界綠色和平組織的強烈反對, 媒體宣傳不準確, 導致了大眾對轉基因不太了解, 如果有選擇, 肯定會選擇純天然的．

7.2 展望

存在上述問題并不意味著分子育種沒有光明的前景, 美國孟山都公司的轉基因農作物新品種確實給它們帶來了巨大的經濟效益． 隨著分子育種技術的不斷完善, 辣椒分子育種離應用會越來越近． 對今后的分子育種研究提出如下建議．

1) 研究任務合理分流． 基礎研究由綜合性大學或高等院校及國家級科研單位承擔． 應用研究由育種單位承擔, 如遺傳轉化研究就應該由育種單位承擔, 因為育種單位有更多的材料供選擇, 而且很清楚材料的經濟性狀．

2) 選用合理的選擇標記基因． 以前的選擇標記大多數是用NPTII基因、 抗除草劑的基因等, 擔心會給生態環境造成不良影響． 建議以后可通過一些技術刪除選擇標記基因或者用磷酸甘露糖異構酶(PMI)基因作為植物篩選標記, PMI能夠催化甘露糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸之間的互變異構反應, 而在植物(除大豆外)中不存在PMI, 當在培養基中用甘露糖代替蔗糖作為碳源時, 植物因不能利用甘露糖而生長受到抑制． 由于在動物、 人體中普遍存在這種酶, 因此, PMI作為選擇標記對人類健康和環境不會產生不良影響． 目前, PMI基因作為標記基因已被利用于玉米、 小麥等轉基因作物中, 而且發現利用甘露糖篩選比卡那霉素抗性篩選的轉化效率高．

3) 構建更加飽和的分子標記遺傳圖譜． 圖譜越飽和越好用, 選擇效率越高．

4) 開發利用功能標記． 分子標記畢竟不是基因本身, 材料換了以后不一定用得上, 如果是對基因直接進行選擇, 就不存在這樣的問題了． 例如辣椒素基因就可以直接用PCR擴增C基因．

5) 建立更完善的遺傳轉化技術體系． 辣椒的遺傳轉化技術體系尚未完善, 對基因型的依賴性太大, 如果這個問題不解決, 將會延緩轉基因在辣椒育種的應用速度．

6) 充分利用基因編輯技術, 創造有應用價值的種質資源． 利用基因編輯技術的前提條件是要有負調控因子, 因此首先必須找到負向基因(結構基因或調控基因均可)．