茶樹CsGID1s基因家族的克隆及功能分析

袁連玉， 韓雨欣， 代洪葦， 鄭姝婷， 童華榮

西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715

赤霉素(GA)是一類重要的植物激素, 對植物芽葉的生長和莖的伸長有重要的促進(jìn)作用, 植物可通過赤霉素合成和赤霉素細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控植物的生長發(fā)育過程[1-2]． 茶樹是重要的葉用經(jīng)濟作物, 研究茶樹GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控途徑, 對解釋茶樹的形態(tài)建成過程, 尤其是葉片的發(fā)育非常重要． GID1s(Gibberellin insensitive dwarf1)為GA受體蛋白, 是一種可溶性蛋白, 其基因家族成員已在多種植物中被克隆研究, 如水稻[3]、 葡萄[4]、 李[5]、 柑橘[6]和百子蓮[7]等, 且均定位于細(xì)胞核． GID1s受體蛋白能夠識別活性GA并與之結(jié)合, 使其構(gòu)象發(fā)生改變, 從而提高其與轉(zhuǎn)錄抑制因子DELLA蛋白的相互作用, 加速DELLA的泛素化通路[1, 7], 最終形成GA-GID1-DELLA 三聚體, 使得DELLA蛋白的抑制作用減弱, 導(dǎo)致DELLA蛋白被降解, 激活了植物對GA的反應(yīng)[3, 8-9]．GID1s基因的表達(dá)會影響植物的株高及開花過程, 水稻過表達(dá)OsGID1基因表現(xiàn)出GA敏感表型, 株高增加[3]． 在楊樹和擬南芥中過表達(dá)PtGID1基因也可以促使其花期提前, 株高增加[10]． 擬南芥中已被鑒定出3個具有GA受體功能的GID1s基因, 分別命名為AtGID1A,AtGID1B與AtGID1C, 他們在水解途徑中都具有特殊的功能[11]． 在蛋白水解GA信號途徑中,AtGID1A在莖的伸長和繁殖力中起到主要的作用,AtGID1C在莖的伸長中起到次要作用,AtGID1B在繁殖力中起到次要作用[12]． 在非蛋白水解途徑中,AtGID1A在發(fā)芽和莖的伸長中起到主要作用, 在繁殖力中起到次要作用;AtGID1B在莖的伸長中起到次要作用, 在繁殖力中起到最主要的作用[13]． 此外, 龍眼GID1蛋白在種子萌發(fā)和花苞發(fā)育過程中具有重要作用[14]; 在水稻中超表達(dá)GID1a基因能使葉子保持較長時間的綠色, 從而增加植株生物量[2]; 在紫花苜蓿中GID1b基因主要作用于根和花的發(fā)育過程[15]．

茶樹作為我國重要的經(jīng)濟作物, 其生物學(xué)形態(tài)建成對茶葉的產(chǎn)量和質(zhì)量等有著十分重要的影響, 了解 GA在茶樹中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有利于提升茶樹的經(jīng)濟價值． 前人研究較少涉及茶樹GID1受體對GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用, 而茶樹基因組數(shù)據(jù)的公布使得CsGID1s基因家族的全基因組鑒定及功能分析成為可能． 本研究在茶樹全基因組范圍內(nèi)鑒定和克隆了3個CsGID1s基因家族成員, 分別命名為CsGID1A,CsGID1B和CsGID1C, 利用全面的生物信息學(xué)方法分析了該家族成員的特征特性, 分析驗證CsGID1s基因在茶樹不同品種、 不同組織及不同非生物逆境脅迫和不同濃度的外源GA3處理下的表達(dá)特征, 為茶樹CsGID1s基因的功能及茶樹中GA信號傳導(dǎo)途徑研究提供參考．

1 材料與方法

1.1 材料

以10年生茶樹‘福鼎大白’為材料進(jìn)行茶樹GA受體蛋白的克隆及花和葉不同發(fā)育時期的表達(dá)分析等試驗, 材料茶樹種植于西南大學(xué)茶樹種質(zhì)資源圃內(nèi), 分別取‘福鼎大白’茶樹的老葉、 芽等不同組織材料1 g, 液氮速凍后, 存儲于-80 ℃超低溫冰箱中備用．

試驗試劑: 多糖多酚植物RNA提取試劑盒, 北京艾德萊生物科技有限公司; 一步法反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液, 北京全式金生物技術(shù)股份有限公司; Taq DNA聚合酶, pMD18-T, DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和DNA切膠回收試劑盒, 天根生化科技(北京)有限公司; 熒光定量PCR試劑超混液, 美國伯樂生物技術(shù)有限公司; 引物合成和基因測序, 英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司．

1.2 茶樹GA受體蛋白家族成員的克隆

以‘福鼎大白’茶樹的老葉及芽頭為材料, 參照RNA提取試劑盒說明書的步驟, 提取總RNA; 經(jīng)過瓊脂糖凝膠及分光光度計法檢驗合格后, 按照一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄, 合成用于基因克隆及表達(dá)分析的cDNA模板． 克隆茶樹GA受體蛋白基因, 所用引物序列見表1． PCR擴增程序: 94 ℃, 3min; 94 ℃, 30 s; 55 ℃, 30 s; 72 ℃, 2 min; 34個循環(huán)后, 72 ℃, 5min, 瓊脂糖電泳, 切膠回收, 連接pMD18-T載體測序, 并與TPIA數(shù)據(jù)庫中公布的序列進(jìn)行比對, 確定克隆序列的準(zhǔn)確性．

1.3 茶樹GA受體蛋白家族的生物信息學(xué)分析

分 別 從 擬 南 芥 數(shù) 據(jù) 庫TAIR和JGI-Phytozome 12 中下載擬南芥、 水稻、 葡萄、 楊樹和紫蘇柳等植物GID1s基因的核苷酸和蛋白質(zhì)序列, 并利用本地Blast方法在茶樹基因組數(shù)據(jù)庫TPIA中鑒定并下載茶樹CsGID1s基因的預(yù)測序列及其相關(guān)數(shù)據(jù)． 利用軟件對CsGID1s蛋白的分子量、 等電點進(jìn)行分析, 利用軟件SOPM和SWISS-MODEL分析CsGID1s蛋白的結(jié)構(gòu)模型, 運用軟件ClustalX1.8, MEGA4.0和DNAMAN進(jìn)行茶樹CsGID1s蛋白的氨基酸序列比對． 采用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建進(jìn)化樹, Bootstrap參數(shù)1 000, 其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值; 通過在線軟件MEME分析茶樹CsGID1s蛋白的保守基序, 并將最大數(shù)值設(shè)為20． 利用Plant-mPLoc進(jìn)行CsGID1s蛋白的亞細(xì)胞定位分析; 利用軟件Plantcare分析預(yù)測從茶樹基因組數(shù)據(jù)庫TPIA中下載的CsGID1s基因上游1.5 kb啟動子序列中含有的順式作用元件． 本研究還利用模式植物擬南芥AtGID1s蛋白家族在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫STRING中的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò), 分析與茶樹CsGID1s相關(guān)聯(lián)的蛋白．

1.4 茶樹GA受體蛋白基因的表達(dá)分析

從TPIA數(shù)據(jù)庫中下載了CsGID1s在‘舒茶早’茶樹8個組織部位(根、 莖、 芽頭、 花、 果、 嫩葉、 成熟葉和老葉)及其葉片中CsGID1s基因在鹽、 冷、 干旱和MeJA等不同非生物逆境脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的數(shù)據(jù), 并利用Tbtools繪制熱圖． 為了驗證數(shù)據(jù)庫中的基因表達(dá)量, 本研究還采用熒光定量PCR檢測CsGID1s基因在茶樹8個組織部位中的表達(dá)量; 為了解CsGID1s基因在茶樹中的功能, 本研究對‘福鼎大白’茶樹2年生扦插苗進(jìn)行外源GA3脅迫處理, 分析CsGID1s基因的表達(dá)特異性． 外源GA3處理流程: 在3個藍(lán)色方形塑料盆中, 分別加入MS液體培養(yǎng)基(對照), MS液體培養(yǎng)基+75 μmol/L GA, MS液體培養(yǎng)基+100 μmol/L GA, 對‘福鼎大白’茶樹的扦插苗進(jìn)行水培及GA處理, 分別在人工氣候箱(16 h白/8 h黑, 光照強度15 000 Lx, 溫度23 ℃, 濕度75%)中培養(yǎng) 24 h和48 h后, 對茶苗成熟度一致的第2葉進(jìn)行取樣, 液氮速凍后, 放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?采用多糖多酚RNA提取試劑盒方法提取樣本的總RNA, 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA 模板, 用于CsGID1s基因的表達(dá)特異性分析． 用Primer3軟件設(shè)計熒光定量引物(表1), 內(nèi)標(biāo)基因為茶樹肌動蛋白基因(Actin)． 10 μL Real-Time PCR反應(yīng)體系: SYBR Premix 5μL, 濃度為10 μmol/L的上下游引物各 0.2 μL, cDNA 0.5 μL, 滅菌超純水ddH2O 4.1 μL, 充分混勻, 于Bio-Rad CFX96實時定量PCR儀上進(jìn)行擴增分析, 反應(yīng)程序為95 ℃, 10 s; 95 ℃, 5 s; 55 ℃, 5 s, 進(jìn)行40個循環(huán)． 每個樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次試驗重復(fù), 采用2-ΔΔCT法分析結(jié)果, 用Sigma plot軟件分析差異顯著性并制圖．

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹GA受體蛋白基因家族的鑒定

為研究茶樹中GA受體蛋白的功能, 本研究利用模式植物中GA受體蛋白的序列信息, 在茶樹基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行本地Blast搜索鑒定, 共獲得 3個同源的茶樹GA受體蛋白基因, 分別命名為CsGID1A,CsGID1B和CsGID1C． 本研究以‘福鼎大白’茶樹的老葉提取RNA, 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA為模板, 克隆獲得了2個茶樹中的GA受體蛋白基因:CsGID1A和CsGID1B, 長度分別為1 041 bp和1 293 bp; 以‘福鼎大白’茶樹的芽頭為材料, 通過RT-PCR的方法, 克隆獲得1個茶樹中的GA受體蛋白基因:CsGID1C, 長度為1 023 bp(圖1)． 生物信息學(xué)方法分析3個基因的核苷酸和氨基酸序列, 結(jié)果表明其分別編碼346 aa, 430 aa, 340 aa長度的氨基酸殘基, 分子量分別為39.42, 48.42和38.53 kDa; 蛋白的等電點分別為8.31, 5.97和5.63; 亞細(xì)胞定位預(yù)測分析顯示, 3個GA受體蛋白均定位于細(xì)胞核, 這與模式植物中的GA受體蛋白的亞細(xì)胞定位信息一致(表2)． 染色體定位分析結(jié)果顯示, 3個CsGID1s基因分別定位于茶樹(‘舒茶早’)的2號, 6號和7號染色體(圖2)．

M為分子標(biāo)記, A為CsGID1A, B為CsGID1B, C為CsGID1C．

圖2 茶樹CsGID1s基因的染色體定位

表2 茶樹基因組中的GA受體蛋白家族成員及其理化性質(zhì)

2.2 茶樹GA受體蛋白系統(tǒng)發(fā)育及蛋白保守結(jié)構(gòu)域組成

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示, 茶樹中的3個GA受體蛋白與其他植物中的該蛋白氨基酸序列具有高度的保守性, 其中茶樹中的CsGID1s蛋白與葡萄的VvGID1s蛋白的親緣關(guān)系最近(圖3)． 保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果還顯示, GID1s蛋白家族成員在不同植物中具有高度的保守性, 不同植物GIDs蛋白序列中含有保守基序的種類和數(shù)量基本一致, 只存在極少數(shù)保守序列差異． 茶樹中的3個GA受體蛋白也是一樣, 除了CsDID1s蛋白的N端有一段不含保守基序的序列外, 其余均與其他植物中已知的GID1s蛋白一致, 具有極其相似的保守基序． 為了進(jìn)一步分析這些保守基序的特征, 本研究將多種植物中GID1s蛋白進(jìn)行了多序列比對(圖4), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶樹中的3個GIDs蛋白具有GA受體蛋白所具有的幾乎所有保守結(jié)構(gòu)域, 如GID1類蛋白含有TWVLIS, LDR, FFHGGSF, HS, IYD, YRR, DGW, GDSSGGNI, GNI, MF, LDGKYF, WYW和GFY這13個功能結(jié)構(gòu)域[8]; 也包括GID1和HSL家族的保守域HGG和GXSXG, 以及HSL家族中催化3聯(lián)體氨基 Ser(S), Asp(D)和His(H), 但CsGID1B氨基酸序列中H發(fā)生突變, 被V取代, 導(dǎo)致HSL蛋白失去生物催化活性[8-9]． 與其他GID1一樣, CsGID1A和CsGID1C氨基酸序列中H被I取代． 以上結(jié)果均證明, 本研究中克隆獲得的3個CsGID1s蛋白均為典型的GA受體蛋白, 可能具有類似的功能．

不同顏色的方塊和數(shù)字代表不同的保守基序: AtGID1s為擬南芥GID1s蛋白, OsGID1s為水稻GID1s蛋白, VvGID1s為葡萄GID1s蛋白, PtrGID1s為楊樹GID1s蛋白, CsGID1s為茶樹GID1s蛋白, SpGID1s 為紫蘇柳GID1s蛋白．

▁為 GID1s和HSL家族的13個保守結(jié)構(gòu)域的序列及位置; ▼為 GA受體蛋白GID1s蛋白的活性催化堿基, ▽為 HSL家族中催化三聯(lián)體氨基酸的位置．

2.3 茶樹CsGID1s蛋白的二、 三級結(jié)構(gòu)分析

本研究還對茶樹CsGID1s蛋白的空間結(jié)構(gòu)特點及功能進(jìn)行了分析(圖5), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個CsGID1s蛋白中, 自由卷曲所占的比例均最大, 分別為34.89%(CsGID1A), 35.26%(CsGID1B), 37.24%(CsGID1C); 其次是α-螺旋, 分別為30.83%(CsGID1A), 34.97%(CsGID1B)和29.33%(CsGID1C); 延長鏈和β折疊所占的比例也較大． 以已知GA受體蛋白2zsh.1為模板, 用SWISS-MODEL 在線軟件分析蛋白的三級結(jié)構(gòu)(圖6), 結(jié)果顯示CsGID1A, CsGID1B和CsGID1C 3個蛋白的空間結(jié)構(gòu)非常相似, 均具有由8個 β 折疊片層和7個α 螺旋組成的GID1蛋白核心結(jié)構(gòu), 都屬于α/β折疊水解酶超家族中的羧酸酯酶家族的典型三級結(jié)構(gòu), 由此可推測CsGID1s蛋白家族具有相同的生物學(xué)功能．

圖5 茶樹CsGID1s蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析

圖6 茶樹CsGID1s蛋白的3D空間結(jié)構(gòu)

2.4 茶樹CsGID1s基因的時空表達(dá)特異性分析

為明確CsGID1s蛋白在茶樹生長發(fā)育中的調(diào)控功能, 本研究分析了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中CsGID1s基因在17種山茶屬植物葉片和茶樹不同組織部位的表達(dá)特異性． 圖7a中,CsGID1A基因在云抗10號(CSA)、 禿房茶(TF)、 厚葉紅山茶(HZ)和大理茶(CTA)等的葉片中表達(dá)量較低;CsGID1B和CsGID1C基因無明顯種屬間的表達(dá)差異, 且其中表達(dá)量由大到小依次為CsGID1C,CsGID1B,CsGID1A． 圖7b中, 在茶樹的不同組織部位,CsGID1C基因的表達(dá)量均較高;CsGID1A和CsGID1B基因在芽、 嫩葉和花中的表達(dá)量較低, 在根、 莖、 成熟葉和老葉中的表達(dá)量較高, 在茶果中的表達(dá)量最高． 以上結(jié)果表明, 3個CsGID1s基因可能在茶樹的不同組織中發(fā)揮的功能存在差異．

2.5 茶樹CsGID1s基因響應(yīng)非生物逆境脅迫的表達(dá)特異性分析

為了進(jìn)一步明確CsGID1s基因的功能, 本研究從TPIA數(shù)據(jù)庫中獲得了CsGID1s基因響應(yīng)NaCl、 干旱、 MeJA和冷等不同非生物逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 并分析了其表達(dá)特異性(圖8)． 在NaCl和干旱脅迫條件下,CsGID1A基因的表達(dá)是升高的,CsGID1B和CsGID1C基因的表達(dá)是被抑制的． 在冷脅迫條件下,CsGID1A基因的表達(dá)受到抑制,CsGID1B基因的表達(dá)受到誘導(dǎo),CsGID1C基因的表達(dá)無明顯變化． 在外源JA 激素的脅迫下,CsGID1B基因的表達(dá)在24 h時略有升高, 48 h后又恢復(fù)正常;CsGID1A和CsGID1C基因的表達(dá)基本不受影響, 變化不明顯． 由以上結(jié)果可以推測, 茶樹CsGID1s基因可能參與了茶樹應(yīng)對鹽、 干旱和冷等非生物逆境脅迫的響應(yīng)過程, 但對外源JA激素的響應(yīng)較小．

藍(lán)色代表低表達(dá), 紅色代表高表達(dá)． a圖中N0, N24, N48和N72為200 mol/L NaCl處理0 h, 24 h, 48 h, 72 h; b圖中CK為未冷馴化處理對照, CA1和CA3分別為完全馴化和去馴化; c圖中J0, J24, J48和J72分別為MeJA處理0 h, 24 h, 48 h和72 h; d圖中P0, P24, P48和P72分別為25% PEG處理0 h, 24 h, 48 h和72 h．

2.6 CsGID1s啟動子片段順式作用元件分析

為進(jìn)一步分析CsGID1s基因的功能, 本研究分別下載該基因家族成員的啟動子序列, 并運用在線軟件Plantcare進(jìn)行分析．CsGID1s基因啟動子中含有多個順反子元件(表3), 其中CAAT-box和TATA-box常規(guī)關(guān)鍵順反子元件的數(shù)量較多． 在CsGID1B和CsGID1C基因啟動子中分別含有1個能夠參與赤霉素GA響應(yīng)的TATC-box和P-box順反子元件． 在該家族基因的啟動子序列中含有較多的光響應(yīng)元件, 如chs-CMA2a, Box 4, AT1-motif, GATA-motif, GA-motif和GT1-motif． 另外, 在CsGID1s基因啟動子序列中還含有響應(yīng)干旱、 冷和厭氧等外界非生物逆境及外界外源激素誘導(dǎo)的元件． 由以上結(jié)果可以推測,CsGID1s基因家族成員可能參與了赤霉素的代謝過程, 并且可能廣泛參與茶樹對外界非生物逆境的響應(yīng)過程．

表3 CsGID1s啟動子順式作用元件預(yù)測

2.7 茶樹CsGID1s蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

本研究還利用擬南芥同源的AtGID1s蛋白進(jìn)行了CsGID1s蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測分析． 圖9顯示, 茶樹CsGID1s蛋白間均存在相互作用關(guān)系, 而與其存在相互作用關(guān)系的蛋白均與赤霉素GA的合成、 結(jié)合及其運輸?shù)却x過程有關(guān), 其中包含DELLA蛋白(RGA1, RGL1, RGL2, RGL3及GAI 等), GA3, SLY1及 GA3OX1 等． 由此可推測, CsGID1s蛋白可與GA吸收、 轉(zhuǎn)運、 代謝相關(guān)的蛋白相互作用, 共同調(diào)控茶樹對赤霉素GA的代謝過程．

圖9 依據(jù)擬南芥同源蛋白推測茶樹CsGID1s相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)

2.8 茶樹CsGID1s基因表達(dá)特異性分析

為了進(jìn)一步分析茶樹CsGID1s基因的功能, 本研究還利用熒光定量PCR分析了該基因家族在茶樹葉片和花中不同發(fā)育階段的表達(dá)特異性． 圖10顯示,CsGID1C基因在葉片不同發(fā)育時期的表達(dá)量均高于CsGID1A和CsGID1B基因． 在葉片由芽頭→嫩葉→成熟葉→老葉的發(fā)育過程中,CsGID1s基因的表達(dá)先升高再降低, 在芽頭、 成熟葉和老葉中的表達(dá)量要低于嫩葉(CsGID1A除外)． 該部分基因的表達(dá)規(guī)律與圖7數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不一致, 可能是因為材料屬于不同品種和采樣時對葉片成熟度的定義有關(guān)． 圖11中,CsGID1B基因在花不同發(fā)育時期的表達(dá)量均遠(yuǎn)低于CsGID1A和CsGID1C基因; 在花由花苞→露白→初開→全開→盛開的發(fā)育過程中,CsGID1s基因的表達(dá)也是先升高再降低, 在花的初開和全開時期的表達(dá)量要遠(yuǎn)高于其他時期． 由以上結(jié)果可知,CsGID1s基因的表達(dá)存在時空特異性．

小寫字母不同表示p<0.05, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義．

小寫字母不同表示p<0.05, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義．

2.9 茶樹CsGID1s基因響應(yīng)外源赤霉素GA3的表達(dá)特異性分析

為了解CsGID1s基因的功能, 本研究對2年生‘福鼎大白’茶苗進(jìn)行了外源GA3的脅迫處理, 并分析了脅迫處理后的CsGIDs基因的表達(dá)情況(圖12)． 與對照MS培養(yǎng)的茶苗為對照, 在75 μmol/L GA3處理24 h后,CsGID1A,CsGID1B和CsGID1C基因的表達(dá)均受到抑制, 表達(dá)量下降; 在75 μmol/L GA3 處理48 h后,CsGID1A和CsGID1B基因的表達(dá)繼續(xù)受到抑制, 表達(dá)量較低, 而CsGID1C基因的表達(dá)受到誘導(dǎo), 表達(dá)量被上調(diào)． 在100 μmol/L GA3處理24 h后,CsGID1A,CsGID1B基因的表達(dá)量下降, 但在處理48 h后, 該2個基因的表達(dá)會被明顯上調(diào); 在100 μmol/L GA3處理24 h, 48 h后,CsGID1C基因的表達(dá)均受到誘導(dǎo), 表達(dá)量被明顯上調(diào)． 以上結(jié)果推測, 茶樹中CsGID1s基因的表達(dá)在不同濃度GA3的不同處理時間時其表達(dá)量是不一致的, 較為明顯的規(guī)律為低濃度外源GA3, 處理時間較短時,CsGID1s基因的表達(dá)受到抑制; 高濃度外源GA3, 處理時間較長時,CsGID1s基因的表達(dá)會被誘導(dǎo), 表達(dá)量明顯被上調(diào)．

小寫字母不同表示p<0.05, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義．

3 討論

自20世紀(jì)50年代GA被列入植物激素以來, 人們對其在植物中調(diào)控植物生長發(fā)育及代謝途徑的機理方面進(jìn)行了很多研究, GID1s蛋白作為GA受體, 也被廣泛探討． 2005年,GID1s基因最早在水稻中被分離出來[3], 擬南芥中被發(fā)現(xiàn)了3個GID1s同源基因[16]． 目前, GID1s蛋白已經(jīng)在多種植物中被克隆獲得, 本研究利用已公布的茶樹基因組數(shù)據(jù)庫, 在全基因組水平上分析鑒定, 并從‘福鼎大白’茶樹中克隆獲得3個CsGID1s基因:CsGID1A,CsGID1B和CsGID1C, 其分子量、 等電點與其編碼區(qū)長度均與擬南芥中 GID1s 蛋白具有高度的同源性, 且均定位于細(xì)胞核(表2)． 茶樹中的GIDs蛋白的數(shù)量與擬南芥相同． 茶樹的3個CsGID1s蛋白的二級結(jié)構(gòu)、 三級結(jié)構(gòu)與擬南芥[16]、 水稻[3]、 葡萄[4]等植物的GID1s蛋白高度相似, 含有植物GID1s家族成員的TWVLIS, LDR, FFHGGSF, HS, IYD, YRR, DGW, GDSSGGNI, GNI, MF, LDGKYF, WYW和GFY等多個在植物生長發(fā)育過程中起重要調(diào)控作用的特征性結(jié)構(gòu)域(圖4), 說明茶樹的CsGID1s蛋白也高度保守, 是參與茶樹GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的生長發(fā)育過程調(diào)控的重要蛋白．

GID1s受體廣泛參與種子萌發(fā)、 莖的伸長、 花器官分化及果實發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等植物生長發(fā)育過程的調(diào)控． GID1s可打破唐菖蒲、 山藥的種子休眠過程, 促進(jìn)萌發(fā)[17-18]; 龍眼GID1蛋白能促進(jìn)植株增高, 促進(jìn)花苞發(fā)育[14]; 辣椒GID1可以促進(jìn)莖的伸長[19]． 此外, 還發(fā)現(xiàn)葡萄中該基因?qū)涡越Y(jié)實及果實形成過程有重要作用[20], 在茶樹中越冬芽解除休眠與GA及其受體基因也有關(guān)系[21]． 茶樹CsGID1s基因在不同組織部位中的表達(dá)量不同, 且在葉片和花的不同發(fā)育階段其表達(dá)量也有明顯不同, 說明CsGID1s基因在茶樹不同組織及不同發(fā)育時期通過調(diào)控不同的代謝途徑而發(fā)揮不同的生理功能． 在16種不同的山茶科植物中, CsGIDs的表達(dá)量也存在明顯差異, 這可能與不同的屬種間發(fā)芽早晚、 開花多少等生理特性有關(guān)．

啟動子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn), 茶樹CsGID1s基因的啟動子序列中均含有GA相應(yīng)元件, 另外還含有逆境脅迫響應(yīng)元件． 使用外源GA3對茶苗進(jìn)行脅迫處理, 在低濃度、 處理時間較短時,CsGID1s基因的表達(dá)受到抑制; 在高濃度、 處理時間較長時,CsGID1s基因的表達(dá)會被誘導(dǎo), 推測CsGID1基因的轉(zhuǎn)錄水平受到GAs的反饋抑制調(diào)節(jié), 該結(jié)論與板栗[22]、 棉花[23]、 葡萄[4]的研究結(jié)果一致． 且茶樹CsGID1s蛋白還能與赤霉素GA的合成、 結(jié)合及其運輸?shù)却x過程有關(guān)的DELLA, GA3, SLY及GA3OX1等蛋白相互作用, 共同參與茶樹的GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程． 由此可知, CsGID1s家族成員參與茶樹對外源GA及其他非生物逆境的響應(yīng)過程．

系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系表明茶樹與葡萄親緣關(guān)系最近, 兩者同屬雙子葉植物, VvGID1s蛋白通過赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控葡萄果實發(fā)育, 從而為無籽葡萄的生產(chǎn)提供理論依據(jù)[24]． 本研究推測茶樹CsGID1s蛋白可通過赤霉素GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控茶樹生殖生長與營養(yǎng)生長的轉(zhuǎn)化過程, 對茶樹增產(chǎn)等經(jīng)濟價值有著十分重要的意義． 此外, 茶樹中GID1s蛋白對茶樹形態(tài)學(xué)建成及抗逆過程起著重要的調(diào)節(jié)作用, 進(jìn)一步研究GA受體在茶樹生長發(fā)育過程中的調(diào)解機制對茶樹果實的發(fā)育以及茶芽越冬管理有著十分必要的參考價值．

4 結(jié)論

本研究從茶樹基因組中克隆獲得3個茶樹GA受體蛋白基因:CsGID1A,CsGID1B和CsGID1C． 茶樹CsGID1s蛋白具有高度的保守性;CsGID1s基因存在組織表達(dá)時空特異性, 且受到外源GA3和其他非生物逆境的影響． 根據(jù)本研究結(jié)果推斷CsGID1s基因家族成員廣泛參與了茶樹中赤霉素GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其他非生物逆境脅迫的響應(yīng)過程, 為深入分析茶樹GA受體蛋白的功能提供了一定參考．