一種副干酪乳桿菌快速鑒定方法的建立及應用

孫林慧 禚惠榮 師文君 王康琪 張東立 侯少陽

摘 要：目的：基于腸桿菌基因間重復一致序列聚合酶鏈反應技術（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction，ERIC-PCR）），尋找并制備一對引物探針，靈敏、準確地從復雜生境中鑒定副干酪乳桿菌。方法：尋找副干酪乳桿菌HP-B1145的腸桿菌基因間重復一致序列（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC）最佳反應體系，對ERIC片段回收純化得到特定條帶及序列結果，據此設計引物，快速鑒定副干酪乳桿菌。結果：根據回收得到的副干酪乳桿菌HP-B1145 ERIC片段，設計出了一對引物探針（1145-S-F：5-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3；1145-S-R：5- CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3）。結論：根據引物特異性、準確性、普適性、含量限度實驗得出，設計的引物能準確靈敏地從復雜生境中鑒定副干酪乳桿菌。

關鍵詞：副干酪乳桿菌；腸桿菌基因間重復一致序列聚合酶鏈反應技術（ERIC-PCR）；引物探針；特異性；鑒別

Abstract： Objective： To search for and prepare a pair of primer probes based on ERIC-PCR technology for sensitive and accurate identification of Lactobacillus paracasei from complex habitats. Method： To search for the optimal ERIC reaction system for Lactobacillus paracasei HP-B1145， and obtain specific bands and sequence results through the recovery and purification of ERIC fragments. Based on this， primers were designed to achieve rapid identification of Lactobacillus paracasei. Result： A pair of primer probes （1145-S-F： 5-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3; 1145-S-R： 5- CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3） were designed based on the recovered HP-B1145 ERIC Fragment. Conclusion： Based on the comprehensive experiments of primer specificity， accuracy， universality， and content limit， the designed primers can accurately and sensitively identify Lactobacillus paracasei from complex habitats.

Keywords： Lactobacillus paracasei; enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction （ERIC-PCR）; primer probes; specificity; distinguish

2002年，歐洲食品和飼料菌種協會指出，益生菌能對宿主機體產生功能性健康益處[1]。作為人類腸道微生物群落的一個組成部分，益生菌有助于維持健康的腸道菌群環境，調節微生物的代謝活動[2]。副干酪乳桿菌是益生菌的一種，具有較高的環境耐受能力，能在宿主腸道內分泌胞外多糖，發揮降血糖作用；能促進腸道菌群降膽固醇；能將糖苷型黃酮轉化為易被機體吸收的苷元型黃酮，發揮輔助降血糖的作用；能產生代謝產物，抑制病原菌生長[3-8]。副干酪乳桿菌是一種潛在的功能性益生菌，極具應用前景。目前，副干酪乳桿菌已在食品、藥品、調味品和飼料等產品中發揮作用，用16S rRNA檢測副干酪乳桿菌存在耗時長、操作復雜、簡便性差[9-11]等特點。為改進傳統方法的劣勢，人們需要開發一種新型的檢測技術。

1990年，SHARPLES等[12]在對Escherichia coli基因組中tsl基因的3末端區進行分析時，首次發現了腸桿菌基因間重復一致序列（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC）片段并命名為“基因間重復單位”（Intergenic Repetitive Unit，IRU）序列。隨后Hulton等[13]也鑒定出相同的重復序列并命名為ERIC，即腸桿菌基因間保守重復序列[14]。副干酪乳桿菌是國內外研究熱度較高的一種益生菌，屬于乳桿菌屬的干酪乳桿菌群，具有ERIC序列。腸桿菌基因間重復一致序列聚合酶鏈反應技術（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction，ERIC-PCR）是利用ERIC序列中的高度保守區設計的一對反向引物進行聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴增，對微生物菌株的鑒定、分析等研究有較高的參考價值[15]。該技術用于微生物學研究，分析速度快，可供參考的信息量大，克服了純培養的局限，在環境監測治理、腸道菌群生態結構研究等方面具有廣泛的應用價值[16]。運用ERIC-PCR技術能大大縮短副干酪乳桿菌的鑒別時間，為副干酪乳桿菌的研究提供一種新的檢測思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2K plus Ⅱ DNA Marker、6×DNA Loading Buffer、T載體（T5 Zero Cloning Kit），北京全式金生物技術有限公司；引物，蘇州金唯智生物科技有限公司；純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司；2×Taq Master Mix，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；卡那霉素，北京索萊寶科技有限公司；Tris、SDS，德國Sigma公司；溴化乙錠（Ethidium Bromide，EB），美國Amresco公司；瓊脂糖，西班牙瓊脂糖；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，康為世紀生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-75G全自動數顯立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司；SW-CJ-ZFD雙人單面垂直凈化工作臺，上海博訊實業有限公司；Eppendorf Research plus手動移液槍，德國艾本股份公司；TS100恒溫混勻儀，杭州瑞誠儀器有限公司；T100 Thermal Cycler PCR儀，伯樂生命醫學產品有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋，金壇市江南儀器廠；ZF-20D型暗箱三用紫外分析儀，驥輝分析儀器上海有限公司；H1650-W型高速臺式離心機，長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組DNA的提取、純化

將從酸菜中分離到的副干酪乳桿菌HP-B1145接種至MRS固體培養基中，37 ℃厭氧環境下培養2 d，采用SDS-堿裂解法[17]提取副干酪乳桿菌HP-B1145的基因組，37 ℃烘25 min后加入50 μL 1×TE溶解DNA，-20 ℃保存備用。

1.3.2 引物的設計

以副干酪乳桿菌HP-B1145為研究對象，進行多次實驗，找到最佳ERIC-PCR反應條件。以副干酪乳桿菌HP-B1145基因組DNA為模板，進行ERIC-PCR，回收、純化，得到基因組目的片段，連接T5載體，送至蘇州金唯智公司測序。根據測序結果，采用Primer Premier 5和Oligo 7軟件進行引物探針設計。將副干酪乳桿菌HP-B1145 ERIC序列上傳至GenBank數據庫。

1.3.3 探究引物的特異性

將乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動物雙歧桿菌、干酪乳桿菌和大腸桿菌作為引物探針特異性檢驗的對照，分別對上述菌株及副干酪乳桿菌HP-B1145采用1145-S-F/1145-S-R引物探針進行PCR，并對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.3.4 探究引物的普適性

將副干酪乳桿菌TMPC 46M17、副干酪乳桿菌CD-M-1、副干酪乳桿菌BCRC-16100、副干酪乳桿菌AK508和副干酪乳桿菌KPP3777作為引物探針普適性檢驗的對照，以1145-S-F/1145-S-R為引物，分別對上述菌株及副干酪乳桿菌HP-B1145進行PCR，并對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.3.5 探究引物能夠檢測的含量限度

將乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動物雙歧桿菌、干酪乳桿菌、大腸桿菌和副干酪乳桿菌HP-B1145混合制成副干酪乳桿菌HP-B1145含量分別為100%（絕對含量900 ng·mL-1）、70%（絕對含量630 ng·mL-1）、30%（絕對含量270 ng·mL-1）、0%（絕對含量0 ng·mL-1）的混合DNA溶液，以此混合DNA溶液為模板，采用1145-S-F/1145-S-R引物探針進行PCR，并對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.3.6 探究引物能否檢驗市售產品中的副干酪乳桿菌

選取3種市售配方中含有副干酪乳桿菌的產品，提取產品基因組DNA，以此為模板，采用1145-S-F/1145-S-R引物探針進行PCR，對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證，探究引物探針是否具有實用性。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA的測序及引物設計

依據多次實驗探索到的最佳反應條件，對副干酪乳桿菌HP-B1145的基因組DNA進行ERIC-PCR，得到多態性的ERIC片段，膠回收、純化，得一條900 bp左右的DNA條帶。通過測序得到DNA序列，設計引物探針，該基因片段的序列已上傳GenBank數據庫，接收序列號為OP681785。設計結果如下：1145-S-F：（5-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3）；1145-S-R：（5- CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3）。引物由蘇州金唯智公司合成，用所設計的引物繼續實驗。由SnapGene分析可知，所設計的引物可擴增副干酪乳桿菌HP-B1145的片段長度為489 bp。

2.2 引物探針具有準確性

以HP-B1145基因組DNA為模板進行PCR（反應體系：92～98 ℃預變性8～12 min，92～98 ℃變性1 min，44～46℃退火35～45 s，65～78 ℃延伸210 s，執行30～34個循環，16 ℃后延伸）并進行瓊脂糖凝膠驗證，由圖1可知，引物探針能擴增基因組目的片段，表明引物探針具有準確性與簡便性。

2.3 特異性

分別提取副干酪乳桿菌HP-B1145、乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動物雙歧桿菌桿菌、干酪乳桿菌和大腸桿菌的基因組DNA，采用1145-S-F/1145-S-R引物探針進行PCR。如電泳圖2所示，在眾多菌株中，只有副干酪乳桿菌（1、2號泳道）擴增出對應的基因組目的片段，能被準確檢出，其他菌株沒有擴增出相應的基因組目的片段，證明了引物探針的特異性。

M—2K plus Ⅱ DNA marker；以副干酪乳桿菌HP-B1145基因組DNA為模板，使用引物1145-S-F/1145-S-R。

M為2K plus Ⅱ DNA marker；1到9泳道模板分別為副干酪乳桿菌HP-B1145、乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動物雙歧桿菌桿菌、干酪乳桿菌、大腸桿菌的基因組DNA；1到9泳道使用的引物探針是1145-S-F/1145-S-R。

2.4 普適性

分別提取副干酪乳桿菌HP-B1145、副干酪乳桿菌TMPC 46M17、副干酪乳桿菌CD-M-1、副干酪乳桿菌BCRC-16100、副干酪乳桿菌AK508和副干酪乳桿菌KPP3777的基因組DNA，以1145-S-F/1145-S-R為引物，進行PCR，對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。實驗結果如圖3所示，引物探針能將副干酪乳桿菌的近緣菌株擴增出相應的基因組目的片段，能將副干酪乳桿菌HP-B1145及其近緣菌株檢測出來，證明了探針的普適性。

2.5 含量限度

將乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動物雙歧桿菌、干酪乳桿菌、大腸桿菌和副干酪乳桿菌HP-B1145混合制成副干酪乳桿菌HP-B1145含量分別為100%（絕對含量900 ng·mL-1）、70%（絕對含量630 ng·mL-1）、30%（絕對含量270 ng·mL-1）、3%（絕對含量27 ng·mL-1）、0%（絕對含量0 ng·mL-1）的混合DNA溶液，采用1145-S-F/1145-S-R引物探針進行PCR，對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。結果如圖4所示，副干酪乳桿菌絕對含量為27 ng·mL-1時，運用該引物探針可檢測出，證明該引物探針能在微量DNA存在時檢出副干酪乳桿菌，具有特異性強、靈敏性高的特點。

M為2K Plus Ⅱ DNA marker；1、2、3、4、5、6泳道分別以副干酪乳桿菌HP-B1145、TMPC 46M17、CD-M-1、BCRC-16100、AK508、KPP3777 6株副干酪乳桿菌的基因組DNA為模板。1、2、3、4、5、6泳道使用的引物探針是1145-S-F/1145-S-R。

M為2K Plus Ⅱ DNA marker；1泳道為副干酪乳桿菌含量100%（絕對含量900 ng·mL）的驗證、2泳道為副干酪乳桿菌含量70%（絕對含量630 ng·mL-1）、3泳道為副干酪乳桿菌含量30%（絕對含量270 ng·mL-1）、4泳道為副干酪乳桿菌含量3%（絕對含量27 ng·mL-1）、5泳道為副干酪乳桿菌含量0%（絕對含量0 ng·mL-1）的溶液。1、2、3、4泳道使用的引物探針是1145-S-F/1145-S-R。

2.6 市售產品驗證引物的實用性

選取3種市售配方中含有副干酪乳桿菌的產品，提取產品基因組DNA為模板，采用1145-S-F/1145-S-R引物探針進行PCR反應，PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。如圖5所示，以選取的3種產品為模板進行PCR均能擴增出相應的目的片段。

M為2K Plus Ⅱ DNA marker；1、2、3分別以市售混合益生菌產品一，市售混合益生菌產品二及市售益生菌產品三的基因組DNA為模板；1、2、3泳道使用的引物探針是1145-S-F/1145-S-R。

3 結論

基于ERIC-PCR技術獲得副干酪乳桿菌HP-B1145特異性序列，序列信息已上傳GenBank數據庫，接收序列號為OP681785。設計了一對引物探針，即1145-S-F：（5-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3）和1145-S-R：（5-CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3），比對數據庫發現該序列在副干酪乳桿菌中具有較高保守性，能通過簡單PCR快速、準確、特異性地從復雜樣品中檢出副干酪乳桿菌，解決了現有檢測方法操作復雜、誤差大、耗時長的問題，該引物的設計為食品、制藥、生物技術等領域提供了一種新的檢測方法。16S rRNA序列測定結合生理生化實驗鑒別副干酪乳桿菌需3 d才能獲知檢測結果，但是運用該研究設計的引物探針對復雜樣品進行普通PCR擴增，僅在4 h內即可完成對未知菌株中副干酪乳桿菌的鑒定，操作過程簡單，重復性好，可最大程度減小操作過程的誤差，具有較高的應用價值。

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基金項目：山東省自然科學基金（ZR2022QB146）；菏澤學院博士基金（XY21BS35）。

作者簡介：孫林慧（2002—），女，山東聊城人，本科。研究方向：藥食兩用微生物資源的開發和利用。

通信作者：張東立（1983—），男，山東菏澤人，本科，工程師。研究方向：藥品、保健食品研發及生產質量管理。E-mail： donglifl@163.com。