光照與核黃素濃度對核黃素光動力滅活病原體效果的研究

何緣圓,李彥玉,尹云弟,李 玲,陳可洋,劉 忠

輸血是現代醫學治療中不可或缺的手段,但是輸血感染仍然時有發生,感染性風險由可通過輸血傳播的病原微生物構成,其中包括人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等多種病毒以及大腸桿菌、金黃色葡萄菌、梅毒等細菌和原蟲等。血液病原體滅活技術是最有希望能夠進一步降低輸血感染風險的方法,是保障血液安全的最后一道屏障,但血液病原體滅活技術目前還不成熟,還需要進一步研究和發展。

核黃素光化學病原體滅活法作為一種新型高效的病原體滅活技術近年來得到廣泛的關注。核黃素一般是指維生素B2,是人體必需的營養物質。核黃素的安全性也已經得到了充分的肯定,它被美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)歸類為一般認為是安全的[1],并與紫外線介導的活化一起用于新生兒黃疸的治療[2]。核黃素光化學法的原理是核黃素在受到紫外光或可見光激活,鳥苷堿基被氧化,通過電子轉移對鳥嘌呤殘基進行修飾,阻斷核酸復制對核酸造成不可逆損傷[3-4],從而實現抑制或破壞病原體復制的目的。Mirasol PRT系統對臨床相關病原體有效和滅活白細胞[5],而不顯著損害產品的功效[6]或導致產品損失[7-8],同時也不需要后續的清除步驟。目前很少有文章報道血液病原體滅活研究中核黃素濃度與紫外光照聯合作用效果,本文將探究不同光照時間與不同濃度核黃素對血漿水皰性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus,VSV)滅活效果的影響,為核黃素光化學法病原體滅活技術滅活條件的選擇和滅活效果的優化提供可靠的依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑倒置光學顯微鏡購自日本尼康株式會社; ABO型血漿由四川德陽中心血站提供;核黃素購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;生理鹽水購自四川科倫藥業股份有限公司。

1.2 實驗用病毒與細胞VSV(原代劑量15 ml由本所輸血傳播病原體研究中心饋贈);Vero E6(由本實驗平臺輸血安全課題組傳代保存)

1.3 實驗方法

1.3.1核黃素濃度配制 取生理鹽水配制終濃度為500 μmol/L的核黃素生理鹽水溶液,溶液避光保存。

1.3.2病毒培養 取出VSV存管,水浴鍋解凍。VSV復蘇反復感染Vero E6細胞,連續傳代,以增加病毒毒力;收集病毒培養液,離心過濾后,放入-80 ℃ 保存備用。使用前檢測病毒原液滴度。

1.3.3病原體滅活 本實驗旨在評估水皰性口炎病毒VSV在不同核黃素濃度和不同紫外光照時間下滅活效果。實驗準備需要提前培養好細胞,實驗當天取出同血型血漿,將血漿混合病毒液后再加入不同工作濃度核黃素配制好后加入血袋,配制為4組核黃素濃度,每組核黃素終濃度為50、100、150 μmol/L以及空白對照組;使用365 nm紫外線燈各組照射時間為10、15、20、25 min及未進行光照的對照組;每組設置重復實驗6次。病毒滅活后,在滅活實驗后使用終點滴定法(1 ∶10連續稀釋,每個稀釋8個平行樣品)分析樣品。Vero E6細胞與每個病毒樣本一起培養,并在37 ℃和5% CO2下培養3～5 d。每天使用顯微鏡記錄細胞病理學效應,并使用Reed-Muench法[9]計算病毒滴度。

2 結果

2.1 光照時間對滅活效果的影響當光照時間為10 min時,不添加核黃素組與添加核黃素組各組間差異有統計學意義(P<0.001),添加核黃素濃度50 μmol/L組與100 μmol/L組組間差異無統計學意義(P=0.633)(圖1A);當光照時間為15 min時,不添加核黃素組與添加核黃素組各組間差異有統計學意義(P<0.001),添加核黃素組各組間差異無統計學意義,P值分別為0.859、0.128、0.174(圖1B);當光照時間為20 min時,不添加核黃素組與添加核黃素組各組間差異有統計學意義(P<0.001),添加核黃素組各組間差異無統計學意義,P值分別為0.076、0.110、0.361(圖1C);當光照時間為25 min時,不添加核黃素組與添加核黃素組各組間差異有統計學意義(P<0.001),添加核黃素組各組間差異均無統計學意義,P值分別為0.361、0.361、1.000(圖1D)。實驗結果證明,在實驗時間25 min內,當光照時間到15 min后增加光照時間對病原體滅活效果無影響。

圖1 核黃素光化學法病原體滅活后VSV生長量

2.2 核黃素對VSV滅活效果的影響當不添加核黃素時,光照10 min與光照20 min和25 min組差異有統計學意義(圖2A);當核黃素濃度為50 μmol/L時,只有光照20 min組和光照25 min組間差異無統計學意義(P=0.235)(圖2B);當核黃素濃度為100 μmol/L時,只有光照20 min組和光照25 min組間差異無統計學意義(P=0.658)(圖2C);當核黃素濃度為150 μmol/L時,只有光照20 min組和光照25 min組間差異無統計學意義(P=0.474)(圖2D)。實驗結果表明,當核黃素濃度超過50 μmol/L后,增加核黃素濃度對病原體滅活效果無影響。

圖2 核黃素光化學法病原體滅活后VSV生長量

2.3 光照時間與核黃素濃度相互作用對病原體滅活效果的影響總結上述各實驗結果可得出結論:在25 min內,光照時間越長,效果越好,VSV生長量越低。與核黃素濃度相比,光照時間的增長比核黃素濃度的增加效果更明顯。當核黃素濃度增加到50 μmol/L后再增加核黃素濃度病原體滅活效果不會增強。見表1和圖3。

表1 光照時間與核黃素濃度相互作用時實驗結果檢出VSV生長量log數統計

圖3 光照時間與核黃素濃度聯合作用滅活病原體后VSV log生長量

3 討論

核黃素光化學病原體滅活技術在20世紀60年代被發現,通過對這項技術的深入研究表明活性氧介導的非特異性氧化應激以及核黃素分子插入到微生物的RNA和DNA中會對微生物造成損傷[10-12]。到目前為止,在一些歐洲國家核黃素光化學法病原體滅活技術已被運用于臨床[13]。

在核黃素聯合紫外光照光化學法滅活病原體的實驗中,紫外光照劑量增加可有效提高病原體的滅活效果,當紫外光照的時間達到20 min以上時,效果尤為明顯。相比于紫外光照劑量增加帶來的有效改變,核黃素濃度的增加對于滅活效果有一定的提升,但就不那么顯著了。孔令魁 等[14]的早期核黃素紫外光照滅菌實驗也證實核黃素濃度12.5～50.0 μmol/L滅活后細菌下,降數與無核黃素的空白對照比較差異有統計學意義(P<0.05);但是隨著核黃素濃度的增加滅菌效果趨于下降核黃素濃度>75 μmol/L后無滅菌效果(P>0.05)。

該實驗表明,核黃素與紫外光照兩者聯合對病原體的滅活是具有促進作用的,且差異有統計學意義。該實驗結果表明將紫外照射的劑量增加后,紫外光照劑量引起的病原體生長量變化幅度要大于核黃素濃度變化引起的病原體生長量變化。這與Makdoumi et al[15]在對觀察紫外光(UVA)活化核黃素對角膜炎中常見的3種細菌的抗菌作用時結果基本一致。這可能是由于紫外線劑量的增加也有可能放大氧化應激產生的數量,然而,核黃素濃度的增加并不一定起到同樣的作用。也許只需要少量的核黃素就可以達到所研究的效果,過量的核黃素甚至可以阻止紫外線滲透到液體溶液的深層。同時受試病毒的代謝周期、代謝途徑等也可能是影響氧化應激敏感性的因素之一。關于其他作用條件可能會給病原體滅活帶來的影響以及其中的作用機制等還需要后續的實驗繼續深入探索。

該實驗表明核黃素聯合紫外光A對VSV滅活確實存在一定的療效,但也存在一定的局限性。本文只驗證了核黃素濃度和紫外光A劑量的影響,其他實驗表明病原體的滅活也可能與其他因素有關,例如不同的介質、溫度、光照距離及其他機械因素。后續實驗將進一步探索。

面對各種傳染病的威脅,警示了血庫和輸血醫學領域迫切需要有更新的技術創新。由于核黃素光化學病原體滅活的優越性,在保持處理后產品無需清除工作且高質量減少副反應的發生,Mirasol PRT系統可能會被進一步展開研究,其開發應用在未來也具有非常大的潛力。