骨形成蛋白7在ESCC中的表達及功能初步探究

孫夢菲,黃紅芳,董宇航,張華坤,周紫茹,孫 琦,管文燕,趙琳玥,崔曉賓, 陳云昭,李 鋒

骨形態發生蛋白(bone morphogenetics protein,BMP)原為一種誘導骨組織形成的生長因子,它的亞型除BMP1是金屬蛋白酶家族外,其余如BMP7等均隸屬轉錄生長因子β(TGF-β)超家族且具有典型的半胱氨酸結構域[1]。近些年,有研究[2]表明BMP7與腫瘤高度相關,該分子在小細胞肺癌、結直腸癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、食管癌等病理生理機制中起著重要價值。食管癌作為全球病死率排在第6位的惡性腫瘤, 其中約一半是病理亞型為食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)的中國人[2]。從正常食管到ESCC轉化過程中, 不只癌細胞本身發生了改變, 周圍免疫微環境也發生了變化, BMP7可以通過抑制巨噬細胞和CD4+T細胞來調節微環境中的促炎反應。但是BMP7在ESCC中研究較少且不一致亟待進一步探討,該研究從組織、細胞、生物信息學3個層次觀察BMP7在ESCC的表達與臨床病理指標和生存的關系,免疫細胞的相關性,通路富集分析等探尋BMP7與ESCC產生的分子機制[3-4]。

1 材料與方法

1.1 主要材料EC9706(ESCC細胞系)來源于中國科學院細胞庫;DAB染色液試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司);10%胎牛血清(上海酶研生物科技有限公司);1%青-鏈霉素(大連美侖生物技術有限公司); RPMI-1640(德國制藥企業勃林格殷格翰);Lipofectamine2000 轉染試劑(賽默飛世爾科技中國區有限公司);pcDNA3.1BMP7 質粒(南京晶百生物科技有限公司);Young PAGE預制膠(南京金斯瑞生物科技有限公司);Loading Buffer(上海碧云天生物技術有限公司);轉膜液(蘇州新賽美生物科技有限公司);蛋白酶封閉液(上海雅酶生物醫藥科技有限公司);羊抗兔二抗等抗體(武漢三鷹生物技術有限公司); ECL 化學發光底物(廣州碩譜生物科技有限公司);0.1%結晶紫(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 組織樣本收集整理2000—2021年食管鱗狀細胞癌石蠟包埋組織樣本共 516 例,其中,有274例為癌組織,242例為正常組織。所收集的病例均得到患者的同意并簽署醫學倫理委員會的知情同意書,通過電話和隨訪信等進行隨訪(截止時間: 2021 年9 月)。

1.3 免疫組化染色使用DAB染色液試劑盒,免疫組化操作程序:脫蠟和水化,抗原修復, 阻斷內源性過氧化物酶,滴加一抗,滴加酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物,DAB顯色、復染、脫水、透明、封片、閱片。2位有相應資質的病理醫師遵循2019版WHO 消化系統標準對染色效果進行判讀。依據棕黃色為陽性,細胞著色強度和腫瘤細胞陽性百分比分數評分的具體細節(無著色=0,黃色=1,棕黃色=2,棕色=3;腫瘤細胞陽性百分比<5%=0,6%～25%=1,26%～50%=2,51%～75%=3,75%～100%=4),其免疫組化評分等于細胞著色強度分數與腫瘤細胞陽性百分比分數的乘積(免疫組化評分≤8為低表達,評分>8為高表達)。

1.4 細胞培養EC9706(ESCC細胞系)細胞培養與轉染 EC9706培養于含 10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的 RPMI-1640 細胞培養基中,并置于 37 ℃,5% CO2恒溫培養箱中。

1.5 細胞學實驗當細胞密度約85%開展實驗處理;鋪板6孔板每孔計數60萬個細胞,過夜細胞貼壁后,EP管各加入100 μl RPMI-1640培養基,再分別添加7.5 μl Lipofectamine2000轉染試劑和2.5 μg pcDNA3.1BMP7 質粒。① Western blot 實驗應用YoungPAGE預制膠,將轉染 48 h后的細胞用 PBS 清洗 3 遍,蛋白提取全程在冰上進行,加入5× Loading Buffer 100 ℃煮沸 10 min,電泳后采用快速轉膜液濕轉法400 mA 30 min轉膜,無蛋白酶封閉液封閉10～15 min,敷一抗4 ℃過夜(BMP7 1 ∶500; GAPDH 1 ∶50 000),1×TBST 清洗,4 ℃孵二抗孵育2 h(羊抗兔二抗 1 ∶10 000)(BMP7、GAPDH、羊抗兔二抗等抗體),1×TBST 清洗, 使用 ECL 化學發光底物顯色。② CCK-8與Clone實驗將轉染細胞在 96 孔板中每孔接種約2 000 個,每組每個時間點設置3復孔,每個時間點至少留1個無細胞孔作為調零孔,96孔板旁邊一圈要加無菌PBS防蒸發,測6 d共6個時間點,取3 次的均值。平板克隆每孔 1 000 個細胞接種于6 孔板中,培養10 d左右顯示肉眼可見的克隆后PBS 清洗3次,4%多聚甲醛于 4 ℃固定 20 min,重復清洗,0.1%結晶紫4 ℃染色, 20 min后 PBS 再次清洗3次。Image J軟件計算細胞克隆數。Transwell 遷移實驗將轉染48 h 后的細胞密度約為 1×105個/ml加入上室 200 μl,下室加入 500 μl 含 20% FBS 培養基于培養箱中培養24 h 后取出,吸去上室培養基,10%甲醇溶液固定細胞30 s,0.1%結晶紫染色20 min,自來水中清洗至背景清晰。

1.6 生物信息學分析生物信息學使用TCGA數據庫和limma、reshape2、ggpubr、vioplot、ggExtra等包繪制免疫浸潤圖,同時用gridExtra、ggplot2等包畫GSEA圖。

1.7 統計學處理采用SPSS 26.0 軟件統計分析,BMP7于正常食管鱗狀上皮與鱗癌組織之間以及高低表達BMP7兩組樣本臨床信息之間比較均采用χ2,預后生存曲線分析使用Kaplan-Meier 法,ESCC預后的單因素和多因素分析運用cox法,P<0.05表示差異有統計學意義。細胞學實驗每組數據重復3次,計量資料符合獨立正態分布方差齊時組間比較用t檢驗,不符合時用非參數檢驗。

2 結果

2.1 組織學驗證BMP7表達與臨床信息的關系

2.1.1BMP7蛋白在ESCC組織的表達 正常食管鱗狀上皮及ESCC組織免疫組化染色顯示(圖 1),BMP7主要富集在胞核,染色具有顯著差異,在ESCC組織中的蛋白表達水平顯著低于癌旁正常食管組織(P<0.05)(表1)。

表1 低、高表達BMP7的兩組樣本的比較[n(%)]

表2 BMP7 表達與臨床特點[n(%),n=226]

2.1.2BMP7表達差異與臨床特征的關系 具有臨床病理數據的226例依據免疫組化總分(IRS)進行分組(表 2), 分值<8 分為低表達, 分值≥8分為高表達, 其中BMP7的表達差異與不同級別分化程度(P=0.006)、N分期(P<0.001)、 TNM分期(P<0.001)之間差異有統計學意義。

圖1 正常組織與ESCC組織中BMP7蛋白表達

圖2 ESCC中BMP7蛋白表達差異與生存預后

2.1.3BMP7與ESCC患者生存預后和預后影響因素 有137例ESCC患者通過電話、信件隨訪、病案記錄等方式獲得完整的隨訪信息,通過Kaplan-Meier 生存分析 ESCC患者BMP7蛋白表達水平與生存時間的關系,BMP7低表達組的生存時間低于高表達者(P=0.041)(圖 2)。單因素分析后把所有因素使用更嚴格的多因素計算,TNM分期差異有統計學意義(P<0.001),cox多因素回歸分析顯示TNM分期是影響ESCC預后的獨立因素(表3)。

表3 ESCC中cox單因素和多因素分析(n=137)

2.2 細胞學實驗驗證BMP7對ESCC的影響EC9706細胞中,按照轉染說明書分別使用不同量 BMP7 質粒: Lipofectamine2000 比 例 在 6 孔 板 中 進 行 轉 染 分別24、48、72 h轉染,同時做了無處理的Control組和轉染了正常載體的NC組做對照,BMP7組分別按照 2.5、2.0、3.0 μg濃度梯度,確定最佳轉染條件48 h BMP7 質粒2.5 μg,Lipofectamine2000 7.5 μl時過表達效果較好(圖 3A)。使用最佳轉染條件進行過表達BMP7 對ESCC細胞增殖能力的影響等實驗,在CCK-8實驗中,EC9706細胞過表達 BMP7 組吸光度值低于對照組(P<0.01)(圖3B),平板克隆實驗在EC9706 細胞中過表達 BMP7 組細胞集落數顯著低于對照組(P<0.000 1)(圖3C),結果顯示 BMP7可以抑制ESCC細胞的增殖能力。Transwell 遷移結果顯示過表達 BMP7 組的細胞遷移數目低于對照組的細胞遷移數目(P<0.000 1)(圖3D)。

圖3 BMP7對ESCC細胞的影響

2.3 BMP7在ESCC免疫微環境中的角色基于TCGA數據庫去驗證ESCC中BMP7與免疫細胞浸潤水平的相關性。如圖4A所示,BMP7與B細胞(r=0.373,P=0.008)、樹突狀細胞(r=0.343,P=0.016)、巨噬細胞(r=0.307、P=0.032)、NK細胞(r=-0.304,P=0.034)免疫細胞呈正相關,它與γ-δT細胞(r=-0.313,P=0.028)、M1-TAM(r=-0.353,P=0.013)、M2-TAM(r=-0.281,P=0.050)呈負相關。同時,BMP7相關的基因集GSEA富集分析顯示其與哮喘、自身免疫性甲狀腺疾病、補體與凝血疾病、糖脂磷脂酰肌醇、移植物抗宿主疾病通路呈正相關,與造血細胞系疾病、視黃醇代謝、RNA降解、氨基酸代謝、剪接體通路呈負相關(圖4B)。

圖4 BMP7的表達與ESCC中的免疫浸潤水平相關

2.4 BMP7基因的列線圖根據年齡、性別、分化程度、N分期、TNM分期、BMP7免疫組化表達評分等繪制可視化列線圖,預測ESCC患者的患病風險,評估預后生存時間(圖5)。

圖5 ESCC風險預測列線圖

3 討論

近年來,ESCC的發病率和病死率開始下降,但患者術后總體生存率仍然較低。尋找有效的分子標志物可以為食管鱗狀細胞癌提供新的診斷標志物,早診早治提高患者生存率[5]。BMPs發揮抑癌作用或致癌作用,這取決于細胞環境和腫瘤類型[6]。腫瘤本身是細胞發生累積性基因突變的結果[3],尋找新的標志物有望提高診斷的有效性和準確性。比較近10年來BMP7與ESCC的研究進展,嚴琳 等[7]在56例ESCC組織標本中驗證出BMP7陽性率(73.2%)遠高于正常食管黏膜,且主要在胞膜和胞質。有研究[8]使用160例ESCC組織標本表明BMP7在ESCC細胞中有高、中、低表達3種情況,主要富集癌巢。該研究516 例樣本中BMP7在ESCC組織中主要為低表達,主要表達在胞質,從樣本角度分析原因可能是相對之前的研究擴大了樣本數量且使用了其他地區的組織樣本;從分子本身角度分析原因可能是ESCC可通過自分泌和旁分泌的方式產生,BMP7調節ESCC微環境,其分泌量受多種因素影響也處于一種動態平衡狀態。綜合分析不同的ESCC組織BMP7表達量有所不同,進一步研究可使用內鏡下黏膜剝離術或類器官等ESCC樣本深入構建模型研究。列線圖能綜合多種影響因素,簡易方便地實現個人評估,提高ESCC患者個體化診斷和預后的效率[9]。

BMP7是一種通過改變靶基因轉錄調節許多不同細胞類型的增殖、分化和凋亡的分泌蛋白[3]。該細胞學實驗驗證過表達的BMP7質粒轉染EC9706細胞后CCK-8以及平板克隆實驗結果中過表達組的細胞增殖能力發生了顯著的下降,同時Transwell 遷移實驗結果也提示,過表達BMP7的處理組中,ESCC 細胞的遷移能力也出現明顯的減弱,BMP7在EC9706中可發揮抑癌作用。有文獻[10]表明 BMP7能抑制轉移性腫瘤,能延緩肺癌轉移和擴散。

越來越多的研究[11-13]表明BMPs調節免疫細胞反應并在癌癥中具有免疫抑制作用,比如調節巨噬細胞的激活和極化等。在ESCC里,該研究表明BMP7與M1-TAM(經典活化型巨噬細胞)和M2-TAM(交替活化型巨噬細胞)呈負相關。腫瘤相關巨噬細胞是數量最大的炎癥細胞群,有2種亞型,M1-TAM可產生IFN-γ、腫瘤壞死因子、IL-10等,可在一定程度上抵抗食管鱗狀細胞癌的進展,但隨著食管腫瘤細胞及間質細胞分泌的相關細胞因子( 包括 CCL-2、CCL-18 等趨化因子和 CSF-1) 增加,部分 M1 型腫瘤細胞能向 M2 型轉化,形成以 M2-TAMs 為主的免疫微環境浸潤[14],M2-TAM促進癌癥發生。在這里,BMP7與樹突狀細胞呈正相關。樹突狀細胞表達I型和II型BMP受體(BMPRIA、BMPRIB、IA型激活素受體、BMPRII)和BMP信號轉導分子(Smad1),其信號激活通過增加共刺激分子和CD83、程序性細胞死亡配體1(PD-L1)和PD-L2的表達,促進人類DC的表型成熟,而且BMPs處理的樹突狀細胞表現可增強的T細胞刺激能力。BMP7可通過自分泌和旁分泌影響腫瘤微環境腫瘤和免疫細胞進而影響腫瘤的進展。研究[3]表明BMP7信號通路是癌癥中潛在的免疫治療靶標,同時在TCGAESCC數據庫中BMP7相關的基因集與自身免疫性疾病通路呈正相關。高表達BMP7的ESCC也可以介導正常成纖維細胞活化為腫瘤相關成纖維細胞,BMP7可通過激活Smad1/5/8并抵消TGF-β/Smad2/3信號通路來抑制纖維化[14]。BMP7抑制可能是克服ESCC免疫治療一個靶點。