c-Myc調控lnc-CCDC117-1對舌鱗癌進展的影響

石清影,朱友明

目前,人類基因組中只有2%的RNA能編碼蛋白質[1],其余98%為非編碼RNA[2],其中長度>200 nt的被歸類為長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNAs)。LncRNAs具有低豐度及組織特異性表達,通過直接與DNA、RNA和(或)蛋白質結合[3]或在染色質、DNA、轉錄和轉錄后水平調控基因表達[4],影響神經系統、癌癥以及心血管疾病等重大疾病的發生和結局。目前,多種 lncRNAs在腫瘤中具有促癌、抑癌作用,如lncRNA BC200、lncRNA MALAT1、H19等[5]。C-Myc是一種關鍵的致癌轉錄因子,參與調控人類基因當中約15%的表達[6-7]。其中包括細胞增殖、分化、凋亡、血管生成、能量代謝、翻譯和蛋白合成等一系列生理過程,并與細胞激活和轉化相關[8-9]。相關研究[2]表明,c-Myc在腫瘤中有高表達,如Burkitt淋巴瘤、CRC等,并證實c-Myc在惡性腫瘤進展和維持中的關鍵作用,因此目前其已成為癌癥治療的理想靶點。

因此,鑒于lncRNAs與c-Myc 在腫瘤進展過程中的密切聯系,從致癌轉錄因子c-Myc 切入,利用基因芯片技術在c-Myc tet off的P493細胞中進行篩選(在該系統中,加入Doxycycline后c-Myc會下調),結果顯示一些由c-Myc正調控和負調控的新lncRNAs,從中選擇了一個表達差異顯著且由c-Myc正調控的lncRNA,lnc-CCDC117(ENST00000451486),確定為后續研究對象。Lnc-CCDC117-1定位于人類22號染色體上,長約347個核苷酸。目前,在惡性腫瘤研究的相關進展中鮮有關于lnc-CCDC117-1生物學功能的報道。該研究表明c-Myc與lnc-CCDC117-1兩者間調控的相關性;通過構建表達載體及shRNA技術,過表達、敲低lnc-CCDC117-1探究其對舌鱗癌細胞發展的影響,并為舌鱗癌的早期診斷和治療提供一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料人胚腎細胞293T、人舌鱗癌細胞系HN6、SCC9、CAL27,人正常口腔上皮細胞HOK、大腸桿菌DH5 α(安徽醫科大學口腔實驗室保存)。慢病毒載體plko.1-puro、質粒體系pGag、pRev、pVsvg(美國Sigma-Aldrich公司)。表達載體plko.1-shc-Myc、plko.1-sh-ctrl、flag-c-My(+c-Myc)、pGL3質粒、 +c-Myc質粒以及renilla質粒 (中國科學技術大學生命科學院實驗室提供)。 表達載體+lnc-CCDC117-1、sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、pGL3-lnc-CCDC117-1-wt質粒和pGL3-lnc-CCDC117-1-mut質粒(上海生工生物公司);敲低慢病毒載體plko.1-sh-lnc-CCDC117-1-1、plko.1-sh-lnc-CCDC117-1-2以及對照組plko.1-sh-ctrl(本實驗室構建); 胎牛血清(上海Lonsera公司)、DMEM 高糖培養基(以色列BI公司);轉染試劑lipofectamine2000(美國invitrogen公司,貨號:11668019); q-PCR相關試劑(美國Axygen公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 使用含有10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM高糖培養液培養HN6、SCC9、CAL27、293T細胞,放置于5%CO2的37 ℃培養箱中常規培養;傳代時使用0.25%胰蛋白酶進行消化。

1.2.2plko.1-sh-lnc-CCDC117-1表達載體的構建 從NCBI數據庫中查詢lnc-CCDC117-1的基因序列,根據plko.1-puro載體的敲低骨架特征,設計plko.1-sh-lnc-CCDC117-1載體構建所需的引物,選擇PAGE純化方式,送上海生工合成。引物序列見表1。分別合成sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2。獲得擴增基因后,37 ℃水浴中消化雙酶切plko.1-puro載體,回收酶切產物。1%瓊脂糖凝膠電泳,由T4連接酶將回收的酶切產物和基因片段連接。將上述連接產物轉入感受態大腸桿菌DH5α,涂于LB(含Amp抗性)平板上,37 ℃倒置培養過夜。第2天挑取菌落,篩選陽性克隆,送公司測序鑒定,成功構建plko.1-sh-lnc-CCDC117-1-1、plko.1-sh-lnc-CCDC117-1-2。

1.2.3慢病毒包裝和轉染HN6/SCC9/CAL27細胞 取上述已構建成功且攜帶目的片段的表達載體(3 μg)和病毒包裝質粒:3 μg pGag、3 μg pRev、1.5 μg pVsvg,共轉染293T細胞,使用不含血清的DMEM培養8 h后更換為10% FBS的正常培養基。40 h后收集病毒上清液,0.45 μm PVDF濾器過濾分裝,-80 ℃保存備用。慢病毒轉染: 病毒感染前1天,0.25%胰蛋白酶消化HN6/SCC9/CAL27細胞,鋪至小皿,待細胞匯合度達60%～70%時,將病毒原液分別感染HN6/SCC9/CAL27細胞。同時加入3.5 μl的polybrene(濃度為8 mg/ml),37 ℃孵育12 h,加入嘌呤霉素篩選1～2周。

1.2.4qRT-PCR檢測lnc-CCDC117-1的表達水平 收集轉染48 h后的HN6/SCC9/CAL27細胞各5組(轉染shc-Myc、+c-Myc、sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1及其各對照組),按TRIzol試劑說明書分別提取各組細胞的總RNA。逆轉錄合成cDNA模板,-20 ℃保存待用。將含有待擴增序列的cDNA模板進行PCR反應,總體積20 μl包括:上游引物0.8 μl,下游引物0.8 μl,2× q-PCR Mix 10 μl,ROX 0.4 μl,cDNA 2 μl,無菌蒸餾水6 μl。在PCR擴增儀上完成PCR擴增,擴增反應程序為: 95 ℃、2 min,95 ℃、5 s,60 ℃、15 s,72 ℃、20 s,重復55個循環。反應結束后讀取各組結果,以β-actin作為分子內參,采用2-ΔΔCt法分析比較各組lnc-CCDC117-1的表達。引物序列見表2。

表2 引物序列

表3 在P493細胞篩選中顯示3個lncRNA響應c-Myc

表4 在HN6細胞中驗證c-Myc對3個lncRNA的影響

表5 lnc-CCDC117-1基本數據

1.2.5雙熒光素酶報告系統檢測啟動子活性 共轉染pGL3-lnc-CCDC117-1-wt與+c-Myc組,pGL3-lnc-CCDC117-1-mut與+c-Myc組及其對照組。轉染后48 h加入100 μl細胞裂解液,冰上充分裂解5 min。吸取細胞裂解液至新的EP管中,12 000 r/min離心2 min,收集上清液備用。取干凈的EP管放在Promega熒光檢測儀中檢測本底熒光值,記作L0。吸取10 μl Luciferase Substrate 到新的EP管內,小心的吸取20 μl細胞裂解液上清液,吹打混勻5次后立即放入熒光檢測儀中檢測。該值是螢火蟲熒光素酶的熒光值,記作L1。繼續向管中加入10 μl Renilla Substrate工作液,迅速吹打混勻5次放入熒光檢測儀中檢測。該值為海腎熒光素酶的熒光值,記作R1。整理得到的熒光值,用L1-L0/R1-L0計算出每管樣品的數值,繪制柱狀圖。

1.2.6熒光原位雜交實驗檢測lnc-CCDC117-1在細胞內的定位 將準備好的細胞置于4%的多聚甲醛,室溫下固定15 min。根據試劑盒說明配制好所需溶液(Buffer A,Buffer C,Buffer E,Buffer F)。棄去固定液,每孔加入200 μl 0.1%的Buffer A,室溫靜置15 min; PBS潤洗細胞2次。向孔中加入200 μl 2× Buffer C,37 ℃培養箱中孵育30 min;繼續加入200 μl變性處理后的探針混合液,避光孵育至雜交過夜。次日依次向每孔加入200 μl 42 ℃預熱的Buffer F、Buffer C浸洗5 min。,避光條件下DAPI染核20 min。滴加3～5 μl抗淬滅劑,于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7生長曲線實驗 將轉染sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1及其對照組后的HN6/SCC9/CAL27細胞按1×104個/孔密度鋪至12孔板,每組設置3個復孔。37 ℃分別培養24、48、72、96 h后收集細胞并計數,繪制生長曲線。

1.2.8CCK-8 法檢測HN6/SCC9/CAL27細胞生長 收取轉染了sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1及其對照組的HN6/SCC9/CAL27細胞,按照2×103個/孔密度接種于96孔板,設置3個平行復孔。待細胞貼壁,37 ℃分別培養 12、24、48、72 h;加入10 μl CCK-8溶液,繼續避光孵育4 h,在酶標儀450 nm處測量各孔的吸光值(OD)。

1.2.9細胞劃痕實驗 取sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1和對照組HN6、SCC9細胞鋪至6孔板,每組設置3個復孔。待細胞貼壁后用20 μl黃槍頭劃線后培養過夜。24 h后在顯微鏡下觀察拍照,分析對比細胞劃痕變化。

1.2.10克隆形成實驗 取sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1和對照組CAL27細胞接種于6孔板,400個/孔,設置3個復孔。每孔加入2 ml培養液。培養14 d,4%多聚甲醛室溫下固定30 min,1%結晶紫染色4 h,清洗晾干并觀察拍照。

2 結果

2.1 lnc-CCDC117-1的篩選與鑒定該研究通過基因芯片技術,在c-Myc tet off的P493細胞中進行篩選(在該系統中,加入Doxycycline后c-Myc會下調),結果顯示有一些c-Myc正調控和負調控的lncRNAs。進一步在HN6細胞系中進行驗證,從中選擇了一個高表達且變化量約15倍的lncRNA:lnc-CCDC117-1(ENST00000451486),認為其表達差異有統計學意義,因此確定為后續研究對象。因在該系統中c-Myc下調,而在此結果中檢測到lnc-CCDC117-1表達也下調,故猜測lnc-CCDC117-1受c-Myc正性調控。檢測數據見表3-5。qRT-PCR檢測HOK、HN6、SCC9、CAL27 4種細胞系中lnc-CCDC117-1的表達情況。顯示與HOK對照組相比, HN6組、SCC9組、CAL27組內lnc-CCDC117-1表達水平上調(t=2.804,P<0.05;t=2.866,P<0.05;t=5.374,P<0.01),見圖1。因此,選擇有高表達水平的HN6、SCC9、CAL27細胞系用于后續實驗。

圖1 lnc-CCDC117-1在3種口腔癌細胞系中的表達情況

2.2 檢測c-Myc對lnc-CCDC117-1啟動子活性的影響合成pGL3-lnc-CCDC117-1-wt和pGL3-lnc-CCDC117-1-mut序列,克隆到熒光素酶報告質粒pGL3-basic中。將構建的熒光素酶質粒載體與ctrl、+c-Myc 共轉染到293T細胞中,比較各組熒光信號的強弱。結果顯示, pGL3-lnc-CCDC117-1-mut和+c-Myc共轉染細胞后,細胞的熒光信號值與對照組相比無明顯變化,但共轉染pGL3-lnc-CCDC117-1-wt和+c-Myc組后熒光信號值顯著高于對照組(t=6.133,P<0.01)。見圖2。

圖2 雙熒光素酶報告系統驗證c-Myc和lnc-CCDC117-1靶向結合

2.3 lnc-CCDC117-1在細胞中的定位情況

2.3.1核質分離實驗 取成功分離的細胞上清液和沉淀,分別通過qRT-PCR和Western blot檢測,結果顯示lnc-CCDC117-1主要定位于細胞核內(t=22.02,P<0.001)。見圖3。

圖3 核質分離Western blot法、qRT-PCR法檢測lnc-CCDC117-1的定位情況

2.3.2Fish 檢測 lnc-CCDC117-1的細胞內定位 倒置熒光顯微鏡下觀察,lnc-CCDC117-1呈現出綠色熒光,細胞核被DAPI染成藍色。將圖像合并可見lnc-CCDC117-1定位于細胞核內。說明lnc-CCDC117-1可能在細胞核中發揮作用。見圖4。

圖4 lnc-CCDC117-1 在細胞內的定位 ×40

2.4 敲低c-Myc對舌鱗癌細胞HN6/SCC9/CAL27中lnc-CCDC117-1表達的影響將shc-Myc轉染至HN6/SCC9/CAL27細胞,qRT-PCR檢測敲低c-Myc后HN6/SCC9/CAL27細胞內lnc-CCDC117-1的表達量,顯示lnc-CCDC117-1水平均低于sh-ctrl組(t=14.13、68.24、11.59,P<0.001)。見圖5。

圖5 shc-Myc對HN6/SCC9/CAL27細胞中lnc-CCDC117-1表達的影響

2.5 過表達c-Myc對舌鱗癌細胞HN6/SCC9/CAL27中lnc-CCDC117-1表達的影響將+c-Myc轉染至HN6/SCC9/CAL27細胞,qRT-PCR檢測c-Myc過表達后的HN6/SCC9/CAL27細胞內lnc-CCDC117-1的表達量,顯示lnc-CCDC117-1水平均高于轉染ctrl組(t=9.513,P<0.001;t=29.71,P<0.001;t=5.309,P<0.01)。見圖6。

圖6 +c-Myc對HN6/SCC9/CAL27細胞中lnc-CCDC117-1表達的影響

2.6 shlnc-CCDC117-1干擾lnc-CCDC117-1和c-Myc的表達情況將sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1轉染HN6/SCC9/CAL27細胞后,qRT-PCR檢測顯示轉染sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2組的lnc-CCDC117-1水平顯著低于轉染sh-ctrl組(t=5.781,P<0.01;t=9.176,P<0.001)、(t=5.931,P<0.01;t=13.940,P<0.001)、(t=7.362,P<0.01;t=4.359,P<0.05)。見圖7。同樣,轉染sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2組的c-Myc水平明顯低于對照組(t=6.267,P<0.01;t=9.557,P<0.001)、(t=18.370,P<0.001;t=27.040,P<0.001)、(t=3.947,P<0.05;t=3.405,P<0.05)。見圖8。

圖7 shlnc-CCDC117-1對HN6/SCC9/CAL27細胞中lnc-CCDC117-1表達的影響

圖8 shlnc-CCDC117-1對HN6/SCC9/CAL27細胞中c-Myc表達的影響

2.7 +lnc-CCDC117-1對lnc-CCDC117-1表達水

平的影響將+lnc-CCDC117-1轉染HN6/SCC9/CAL27細胞,qRT-PCR檢測顯示轉染+lnc-CCDC117-1組的lnc-CCDC117-1水平明顯高于轉染ctrl組(t=12.470,P<0.001;t=12.110,P<0.001;t=6.269,P<0.01)。見圖9。

圖9 +lnc-CCDC117-1對HN6/SCC9/CAL27細胞中lnc-CCDC117-1表達的影響

2.8 lnc-CCDC117-1對HN6/SCC9/CAL27細胞生長、增殖、侵襲能力的影響細胞生長曲線、CCK-8法、細胞遷移實驗、克隆形成實驗檢測轉染+lnc-CCDC117-1、sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2組后HN6/SCC9/CAL27細胞的生長增殖、遷移以及集落形成能力。結果表明,與ctrl組相比,+lnc-CCDC117-1組轉染后48 h的細胞生長速率明顯增加(t=14.440,P<0.001;t=4.909,P<0.05;t=16.140,P<0.01),見圖10A、C、E;轉染sh-lnc-CCDC117-1-1,sh-lnc-CCDC117-1-2組,細胞生長速率明顯低于sh-ctrl組(F=48.360,F=19.210,F=17.020,P<0.01),見圖10B、D、F 。CCK-8法實驗顯示+lnc-CCDC117-1組轉染后24 h增值率明顯上升(t=4.635,P<0.05;t=10.65,P<0.01;t=11.820,P<0.01),見圖11A、C、E;轉染sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2組,細胞增殖明顯減慢(F=148.600,F=11.530,F=143.800,P<0.01),見圖11B、D、F。另外,與轉染ctrl組比較,+lnc-CCDC117-1組轉染后24 h后細胞遷移速率增加;轉染sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2組,細胞遷移速率明顯低于sh-ctrl組,見圖12。+lnc-CCDC117-1組細胞形成集落的數量比ctrl組增多[(161.00±3.74)vs(214.67±9.29),t=7.581,P<0.01];與sh-ctrl組比較,轉染sh1-lnc-CCDC117-1,sh2-lnc-CCDC117-1組的集落個數減少[(193.33±6.13)vs(109.33±5.56),(193.33±6.13)vs(85.00±3.56),F=239,P<0.001],見圖13。 因此,可以看出過表達HN6/SCC9/CAL27細胞內lnc-CCDC117-1顯著促進細胞增殖;反之,敲低HN6/SCC9/CAL27細胞中lnc-CCDC117-1明顯抑制細胞增殖與遷移。

圖10 生長曲線實驗結果

圖11 CCK-8細胞增殖實驗結果

圖12 細胞劃痕實驗 ×20

圖13 結晶紫染色觀察轉染sh-lnc-CCDC117-1 、+lnc-CCDC117-1后CAL27細胞集落形成情況

3 討論

OSCCs是世界上第6大最常見的惡性腫瘤[10],5年病死率約為50%。主要危險因素有吸煙、飲酒和人乳頭狀瘤病毒感染[11]。作為一種復雜的腫瘤性疾病,口腔鱗狀細胞癌好發于口腔各個部位,其中以舌鱗癌最為常見。近些年來由于其惡性程度高、轉移快、病死率高而預后較差成為臨床治療的難題,因此,隨著腫瘤分子生物學發展,探究舌鱗癌發生的潛在通路機制聯合基因治療受到越來越多的關注[12]。

C-Myc被列為人類最重要的致癌基因之一。C-Myc的失調受多種病理條件干擾,包括基因組不穩定、免疫細胞逃逸,不受控制的細胞增殖、永生化、血管生成和轉移等[13-14]。研究表明lncRNA在腫瘤中表達異常,c-Myc可以調控一些lncRNA的表達,而lncRNA 也能結合c-Myc抑制其表達,兩者形成的lncRNA-c-Myc 網絡影響了腫瘤的進程,在腫瘤的轉移和激活中發揮關鍵作用。已有研究表明一些受c-Myc調控的lncRNA,例如在0SCC中,c-Myc上調 lncRNA NEAT1促進細胞的增殖進而提高 OSCC3 細胞的糖酵解代謝水平;舌鱗癌細胞SCC3中lncRNA55受c-Myc負調控,c-Myc敲低可以使lncRNA表達明顯上調。另有研究[12]表明非小細胞肺癌H19是c-Myc的下游靶基因,c-Myc能上調H19表達, H19 進而下調miR-107促進腫瘤生長。Feng et al[15]研究表明lncRNA MILIP在人類癌癥中上調,其表達與MYC表達水平呈正相關。MILIP通過抑制TRIML2,降低腫瘤蛋白p53的SUMO化促進細胞存活、增殖和致瘤性,最終導致腫瘤蛋白p53轉化,表明MILIP可能是對抗c-Myc軸的抗癌靶點。該研究通過基因芯片技術,篩選出因c-Myc下調引起表達差異的lnc-CCDC117-1作為研究對象,探究c-Myc 與lnc-CCDC117-1的調控關系,并分析lnc-CCDC117-1對舌鱗癌細胞發展的影響。

為了驗證舌鱗癌細胞中lnc-CCDC117-1與c-Myc表達之間的聯系,建立雙熒光素酶報告基因系統,結果顯示,c-Myc增強了lnc-CCDC117-1野生型報告基因的相對活性,說明lnc-CCDC117-1可能是c-Myc的直接靶點, c-Myc對lnc-CCDC117-1的轉錄活性有調節作用。為了增加結果的可信度, PCR檢測顯示在HN6/SCC9/CAL27細胞中c-Myc上調lnc-CCDC117-1表達增加,下調后lnc-CCDC117-1表達量減少。結論與上述一致。該研究結果顯示,在舌鱗癌細胞中lnc-CCDC117-1與c-Myc表達之間存在正相關性,推測lnc-CCDC117-1受c-Myc正調控。進一步探究lnc-CCDC117-1在舌鱗癌細胞中的生物學功能,體外構建表達載體sh-lnc-CCDC117-1-1,sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1,轉染至HN6/SCC9/CAL27細胞,過表達、敲低lnc-CCDC117-1水平。通過 CCK-8法、細胞劃痕等實驗檢測細胞增殖情況,結果均顯示lnc-CCDC117-1表達上調能促進舌鱗癌細胞的增殖,反之則抑制細胞生長,說明lnc-CCDC117-1可調控影響癌細胞的生長。另外,熒光原位雜交實驗顯示lnc-CCDC117-1定位在舌鱗癌細胞核內,預測lnc-CCDC117-1在細胞核中發揮功能。

綜上所述,該研究表明舌鱗癌細胞HN6/SCC9/CAL27中lnc-CCDC117-1受c-Myc 正調控,c-Myc參與調節lnc-CCDC117-1的轉錄活性。過表達lnc-CCDC117-1水平促進HN6/SCC9/CAL27細胞增殖、遷移能力,反之則會抑制細胞生長;并表明lnc-CCDC117-1存在于細胞核當中。但該實驗研究尚處于初級階段,對于c-Myc-lnc-CCDC117-1通路怎樣從分子水平干擾細胞生長仍是未知的。繼續深入研究lnc-CCDC117-1在舌鱗癌細胞中的抑制機制,將為口腔惡性腫瘤的靶向治療提供新的思路和臨床指導意義。