CMTM4在口腔鱗狀細胞癌發生發展中的作用及機制研究

胡海艷,高 騰,朱載甌,丁 旭,吳煜農,宋曉萌

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最常見的口腔癌類型。據統計,OSCC的發病率和死亡率分別排在第6位和第8位[1]。OSCC患者5年存活率不到50%,總體預后較差[2]。吸煙、過度飲酒、嚼檳榔、殘根殘冠以及人乳頭瘤病毒是OSCC高發的重要因素[3]。目前OSCC患者的治療方案包括手術、放射治療、化學治療、生物治療和分子靶向治療等。盡管這些治療方式近年來有所發展,但仍未能提高OSCC患者的總體生存率[4]。因此,研究與OSCC發生發展相關的新的標志物及分子機制能夠為進一步的治療提供理論基礎。

CMTM家族(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing family)是由9個成員組成的遺傳家族,包括CKLF和CKLFSF1-8。CMTM4是CMTM家族中最保守的成員,有三種亞型:CMTM4-v1、-v2和-v3,分別編碼234、208和179個氨基酸[5]。2004年Kittler等[6]在5 305個esiRNAs中篩出37個對Hela細胞生長起重要作用的基因,其中包括CMTM4基因。2010年Plate等[7]過表達CMTM4-v1和-v2發現CMTM4通過G2/M期積累抑制Hela細胞生長。后來Li等[8]通過免疫組織化學法發現CMTM4在腎透明細胞癌中的表達顯著下調。過表達CMTM4顯著抑制786-O細胞的生長及遷移能力。Bei等[9]研究首次發現CMTM4是肝癌預后不良的危險因素。然而,與上述研究不同,CMTM4在人和小鼠頭頸部鱗狀細胞癌組織及細胞系中表達上調,且與患者不良預后和淋巴轉移密切相關[10]。然而關于CMTM4在OSCC中的研究尚少,其生物學作用仍需我們進一步探索。本研究旨在明確CMTM4在OSCC中的表達特性及其調節OSCC細胞可能的分子機制,為口腔鱗狀細胞癌的分子靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑耗材

人OSCC細胞系CAL27(ATCC,美國)、HN6(上海交通大學附屬第九人民醫院惠贈),DMEM/F-12培養基(Gibco,美國),胎牛血清(Cell Max,中國),胰蛋白酶、青/鏈霉素雙抗(碧云天,中國),Lipofectamine 2000(賽默飛,美國),RNA提取相關試劑(諾唯贊,中國),qRT-PCR引物(通用生物,中國),CCK8試劑盒(起發,中國),Transwell小室、PVDF膜(Millipore,美國),Matrigel基質膠(Corning,美國),PAGE凝膠快速制備試劑盒(雅酶,中國),SDS、Tris、甘氨酸固體粉末(BioFroxx,德國), CMTM4過表達質粒(吉瑪,中國),CMTM4敲低質粒(權陽生物,中國)。抗體:CMTM4(santacruz,美國),β-actin、Cyclin D1、CDK4、CDK6、AKT、pAKT(CST,美國);辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠/兔二抗(PT,美國)。

1.2 免疫組化實驗

實驗由南京醫科大學附屬口腔醫院倫理委員會批準實施(No.PJ2018-051-001),組織樣本為南京醫科大學附屬口腔醫院2014—2019年留存的口腔癌患者術后石蠟樣本,包括196例腫瘤組織與27例正常口腔黏膜組織。石蠟組織芯片于37 ℃烤片2 h,按順序進行脫蠟、水化、抗原修復、滅活過氧化物酶、封閉、孵育CMTM4一抗(4 ℃過夜)。洗凈一抗后室溫孵育兔/鼠IgG-HRP二抗30 min,使用DAB顯色液顯色,最后脫水固定,中性樹膠封片。染色結果判讀:根據染色強度和染色范圍計算評分。染色范圍分級:0分為無陽性細胞,1分為陽性細胞數<20%,2分為20%～50%,3分為51%～75%,4分為76%～100%。染色強度分級:0分不染色,1分淡黃色,2分棕黃色,3分深棕黃色。如上所述,計算結果時將兩個分數相乘,結果≤4分為CMTM4低表達,>4分為CMTM4高表達。

1.3 細胞培養及轉染

人口腔鱗癌細胞HN6和CAL27用含10%胎牛血清DMEM F12培養基培養,每2 d更換培養液。選取狀態好的HN6和CAL27細胞,以合適的密度接種在6孔板內。待板內細胞密度約60%時分別按照說明書轉染CMTM4過表達質粒、空載質粒VECTOR及敲低質粒Si-CMTM4、陰性對照質粒Si-NC。6～8 h后,更換含有胎牛血清的完全培養基。

1.4 實時定量PCR實驗

細胞轉染質粒48 h后根據Trizol試劑盒說明書提取各組細胞RNA,使用HiScriptⅡQ RT SuperMix試劑盒進行逆轉錄,獲得對應cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒進行實時定量PCR。以GAPDH為內參,用2-ΔΔCT對目的基因表達進行分析。引物由公司設計合成(GAPDH F:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,R:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′;CMTM4 F:5′-CAAGGTC-GCCAAGTGATCTT-3′,R:5′-GTGCAGGTTGAGACT-GAACATA-3′)。

1.5 CCK8實驗

細胞轉染質粒48 h后接種于96孔板,每孔2×103個細胞,每組設置3個復孔,分別于接種后第0、1、2、3、4天的固定時間測量一次吸光度值。每孔加入10 μL CCK8試劑和90 μL無血清培養基,然后置于37 ℃恒溫培養箱中培養1～2 h,避光。用酶標儀計算450 nm波長吸光度值,并繪制生長曲線。

1.6 平板克隆形成實驗

細胞轉染質粒48 h后接種于中皿,每皿2×103個細胞,每3 d更換培養液并觀察細胞集落狀態,一定時間后停止培養。4%多聚甲醛溶液固定集落30 min,結晶紫染色15 min。將染色液洗凈、晾干后掃描儀拍攝,Image J軟件計算分析。

1.7 劃痕愈合實驗

細胞轉染質粒48 h后接種于6孔板,細胞密度達80%～90%時進行劃痕,用20 μL黃色槍頭在每孔劃出3條平行等寬的痕跡。PBS清洗細胞3次去除漂浮細胞,皿內加入不含血清的培養基,置于培養箱培養。每隔特定時間觀察,發現有劃痕即將閉合時進行拍照,使用Image J軟件計算分析,劃痕愈合率=(初始劃痕面積-最終劃痕面積)/初始劃痕面積×100%。

1.8 Transwell侵襲實驗

將基質膠均勻涂抹于小室內,細胞轉染質粒48 h后接種于24孔板,上室加入200 μL含胎牛血清的培養液,下室加入800 μL不含胎牛血清的培養液,置于37 ℃培養箱培養。24～48 h后多聚甲醛固定、結晶紫染色。小室沖洗晾干后拍照,每個小室至少選取3個視野,Image J軟件計算分析。

1.9 Western blot實驗

將轉染質粒72 h后的細胞用PBS沖洗3次,加入蛋白裂解液,冰上裂解15 min,用干凈的細胞刮刮凈皿底細胞并轉移到無酶EP管中,按照1∶4比例加入5×蛋白上樣緩沖液,振蕩混勻后置于金屬浴煮10 min。使用PAGE凝膠快速制備試劑盒制膠,按比例配置電泳液及轉膜液,恒壓60 V壓縮蛋白,120 V分離蛋白,然后300 mA恒流轉膜。快速封閉液封閉15～30 min,膜洗凈后封一抗,4 ℃過夜。第2天TBST洗凈一抗后封二抗(兔+鼠),室溫孵育1 h,TBST洗凈二抗,用化學發光凝膠成像系統進行顯影。

1.10 動物實驗

從南京醫科大學動物實驗中心購買16只雄性4～5周齡裸鼠(倫理編號1911015)。隨機分為4組:CMTM4組、VECTOR組、SI組、NC組。將轉染穩定的各組HN6細胞與基質凝膠按等體積充分混勻,分別注射于裸鼠右側腹部皮下,每只鼠注射10 μL細胞混合物,細胞濃度約1×105個/μL。4周后將裸鼠安樂死,解剖瘤體后拍攝并測量瘤體長徑L、短徑W,計算體積V=L×W2/2(mm3)。

1.11 統計學分析

CMTM4的表達與患者臨床信息及病理參數的相關性采用卡方檢驗、費希爾精確概率檢驗。細胞學實驗及動物實驗結果兩組間比較采用t檢驗、曼-惠特尼U檢驗。采用SPSS 26.0版及GraphPad Prism 8.0.1版軟件進行統計分析及繪圖,P<0.05代表統計結果有顯著性差異。

2 結 果

2.1 CMTM4在OSCC腫瘤組織及癌旁組織中的表達及臨床意義

免疫組化結果顯示,CMTM4主要在細胞膜和細胞質中表達,且與癌旁組織相比,CMTM4在口腔鱗狀細胞癌組織中高表達(圖1)。將免疫組化染色結果分為CMTM4低表達和高表達組。結果表明CMTM4的差異表達與患者的年齡、臨床分期及病理分期顯著相關(P<0.001)(表1)。

圖1 CMTM4在OSCC組織和癌旁組織中表達差異Fig.1 Expression of CMTM4 in OSCC and para-carcinoma tissues

表1 CMTM4表達與OSCC臨床病理特征的關系Tab.1 Relationship between CMTM4 expression and clinicopathological features of OSCC

2.2 CMTM4過表達及敲低質粒的轉染效率

結果顯示,過表達質粒的轉染可以明顯提高HN6、CAL27細胞中CMTM4的表達(P<0.001),轉染敲低質粒后,兩個細胞系中CMTM4的表達明顯下降(圖2)。

CMTM4 mRNA水平;***:與對照組比較,P<0.001(t檢驗)。

2.3 CMTM4對HN6和CAL27細胞增殖能力的影響

CCK8實驗結果顯示,與對照組相比,細胞轉染CMTM4過表達質粒后450 nm吸光度值明顯升高。轉染CMTM4敲低質粒后,與對照組相比,CCK8吸光度值降低(圖3)。

HN6、CAL27細胞活性曲線,***:細胞培養4 d時,與對照組比較,P<0.001(t檢驗)

平板克隆形成實驗顯示,與對照組相比,過表達CMTM4后細胞集落數明顯增加,敲低CMTM4后細胞集落生成減少(圖4)。

A:CMTM4過表達及敲低后HN6細胞(13 d)、CAL27細胞(15 d)集落結晶紫染色圖;B: HN6、CAL27細胞集落統計分析圖;***:與對照組比較,P<0.001(t檢驗)

2.4 CMTM4對HN6和CAL27細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結果顯示,過表達CMTM4后,與對照組相比,細胞劃痕相同時間后的愈合面積更多,遷移能力增強。而轉染CMTM4敲低質粒后,細胞的遷移水平減慢(P<0.001)。尤其在CAL27中,細胞劃痕26 h后,轉染敲低質粒的實驗組與對照組相比,劃痕愈合面積減少,愈合速度明顯減慢(圖5)。

A:HN6細胞(16 h)、CAL27細胞(26 h)鏡下劃痕愈合圖,比例尺=100 μm;B:HN6、CAL27細胞劃痕愈合比例統計分析; ***:與對照組比較,P<0.00 1;****:與對照組比較,P<0.000 1(t檢驗)

2.5 CMTM4對HN6和CAL27細胞侵襲能力的影響

實驗結果顯示,與對照組相比,CTMT4過表達后,HN6和CAL27在顯微鏡下有更多的細胞穿過小室,表現出更強的侵襲能力。相對應地,CMTM4敲低后,顯微鏡下穿過小室的細胞數量減少,侵襲能力變弱(圖6)。

A:HN6、CAL27鏡下侵襲實驗小室圖,比例尺=100 μm;B:HN6、CAL27穿越小室細胞統計分析;***:與對照組比較,P<0.001(t檢驗)

2.6 CMTM4對HN6和CAL27細胞周期蛋白及AKT通路蛋白的影響

Western blot曝光結果表明,CMTM4過表達后細胞內周期相關蛋白CDK4、CDK6、Cyclin D1和AKT通路相關蛋白pAKT表達顯著增加,而CMTM4敲低后這些蛋白生成明顯減少(圖7)。

A:Western blot條帶圖;B:蛋白條帶統計分析圖;與對照組比較,*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001;****:P<0.000 1(t檢驗)

2.7 CMTM4對HN6細胞體內成瘤能力的影響

裸鼠成瘤實驗結果顯示,CMTM4過表達組細胞形成的瘤體體積(195.44±40.03)mm3明顯大于對照組(32.47±6.80)mm3。相對應地,CMTM4敲低后,與對照NC組(219.13±89.54)mm3相比,SI組瘤體體積(38.92±3.17)mm3更小,差異有統計學意義性(P<0.05)(圖8)。

A:移植瘤大體圖;B:移植瘤體積差異分析圖;*:與對照組比較,P<0.05(正態分布使用曼-惠特尼U檢驗、非正態分布使用獨立樣本t檢驗)

3 討 論

過去的研究發現,CMTM4在多種腫瘤的發生發展中扮演重要角色。Mezzadra等[11]發現CMTM4能夠協同CMTM6與PD-L1相互作用,減少PD-L1泛素化,增強表達PD-L1的腫瘤細胞抑制T細胞的免疫能力。而Tan等[12]發現CMTM4與肝癌中CD4+和CD8+T細胞浸潤呈正相關。在胰腺癌中,胰腺星狀細胞來源的外泌體miR-5703可以靶向胰腺癌細胞中的CMTM4,并通過PAK4激活PI3K/AKT通路促進細胞增殖[13]。CMTM4在OSCC領域仍缺乏研究,本實驗為了探討CMTM4的表達與OSCC患者臨床病理特征及預后的關系,通過免疫組化檢測OSCC組織和癌旁組織中CMTM4的表達情況,明確了CMTM4在OSCC組織中表達較癌旁組織明顯增加,CMTM4主要表達于細胞膜和細胞質。我們將免疫組化染色結果分為CMTM4低表達和高表達組,結果表明CMTM4的差異表達與患者的年齡、臨床分期及病理分級顯著相關(P<0.001)。當患者的年齡<60歲時,CMTM4高表達患者數量遠高于低表達患者,關于CMTM4高表達的患者人數是否隨著年齡降低而增加,需要更多樣本量對年齡進一步細化分析。隨著臨床分期及病理分級的增加,CMTM4高表達患者數量明顯增加,這意味著CMTM4高表達可能是OSCC預后不良的危險因素。CMTM4的表達與患者的性別、腫瘤的部位、腫瘤大小、淋巴結轉移狀態之間無明顯關聯。推測由于樣本量仍舊較小,并且在染色和統計學分析上存在一定偏差,關于CMTM4高表達是否為OSCC預后不良的獨立危險因素,仍需大量樣本進一步檢測。

為了進一步研究CMTM4在OSCC細胞系中的作用,我們在HN6和CAL27細胞中轉染CMTM4過表達質粒或敲低質粒檢測其對細胞功能的影響。CCK8實驗和平板克隆形成實驗顯示了CMTM4對細胞增殖的影響,結果顯示,過表達CMTM4后與對照組比,450 nm處吸光度值顯著增高,細胞集落數目增多,說明過表達CMTM4后細胞增殖能力明顯提高;轉染CMTM4敲低質粒后,細胞的增殖能力降低。劃痕實驗結果顯示,與對照相比,過表達CMTM4后細胞劃痕愈合能力明顯增強。轉染CMTM4敲低質粒后,細胞的遷移水平減弱。尤其在CAL27中,細胞劃痕26 h后,與對照組相比,實驗組細胞劃痕愈合面積明顯減少。上述結果表明CMTM4在促進口腔鱗癌細胞的增殖、遷移中起到重要作用。另一方面,通過Transwell實驗檢測CMTM4對OSCC細胞侵襲行為的影響,結果顯示CTMT4過表達后顯微鏡下有更多的細胞穿過小室,表現出更強的侵襲能力;干擾CMTM4表達后其侵襲能力明顯下降。以上實驗進一步證實免疫組化結果,CMTM4在口腔鱗癌中扮演促癌作用,通過增強細胞增殖、遷移及侵襲,促進腫瘤發生。

細胞周期是一種高度復雜的調控過程,按照嚴格的順序從一個階段進行到另一個階段。過去研究表明,細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)和CDK抑制劑(cyclin dependent kinase inhibitors,CKI)在調節細胞穩定方面起著重要的作用[14]。尤其D型周期蛋白(Cyclin D1/D2/D3)和CDK4/6在細胞周期啟動過程扮演至關重要的角色,細胞通過胞外絲裂原激活蛋白激酶MAPK(mitogen-activated protein kinases)途徑,導致多個轉錄因子的激活,促進細胞周期蛋白D的轉錄,從而激活CDK4/6和CDK2,并進入細胞周期[15]。Zhang等[16]通過研究發現Cyclin D-CDK4可以通過Cul3SPOP破壞PD-L1的穩定性以控制腫瘤免疫監視,揭示CDK4/6抑制劑和PD-1/PD-L1免疫檢查點阻斷聯合治療提高人類癌癥治療效果的可能性。而表達異常的Cyclin D會導致出現DNA損傷、復制應激和檢查點激酶 1(checkpoint kinase 1,CHK1)激活,使細胞生長出現異常[17]。PI3K/AKT在口腔鱗狀細胞癌中是十分經典的信號通路。P21激活的蛋白激酶4可以通過此通路促進OSCC的增殖、遷移和侵襲[18]。CXCL1(chemokine (C-X-C motif) ligand 1,趨化因子(CXC基序)配體1)在適當濃度下可通過PI3K/AKT途徑促進舌癌細胞增殖[19]。為了進一步探索CMTM4在細胞中的作用,我們進行免疫蛋白印跡實驗,結果表明,CMTM4過表達后細胞周期相關蛋白CDK4、CDK6、Cyclin D1以及AKT通路相關蛋白pAKT表達水平升高。CMTM4敲低后這些蛋白水平降低。因此,認為CMTM4可能通過調節細胞周期及AKT通路從而促進口腔鱗狀細胞癌的發生發展。關于CMTM4如何促進OSCC細胞增殖、遷移、侵襲,以及如何調控細胞周期及PI3K/AKT相關通路,具體分子機制尚未明確,仍需進一步研究。

綜上,CMTM4在OSCC組織中高表達,能夠促進OSCC細胞的增殖、侵襲、遷移能力。CMTM4可能通過調控細胞周期及AKT通路調節OSCC生物學行為。本研究對CMTM4在口腔鱗狀細胞癌中的作用進行了探索,關于CMTM4能否成為口腔鱗狀細胞癌診斷的生物分子標志物,還要從更深的機制層面探究。