低氧預(yù)處理人羊膜間充質(zhì)干細胞來源外泌體在改善血管衰老中的作用研究

趙 煒,劉金明,楊磊婷,沈 銘,張靜露

血管新生是指新毛細血管的生長,是骨修復(fù)再生的關(guān)鍵,新生血管可將氧和營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)交钴S的成骨微環(huán)境并清除代謝廢物,并可作為募集炎癥細胞、軟骨細胞和成骨細胞前體細胞等功能細胞的重要途徑[1-2]。血管化骨再生近年來成為骨再生相關(guān)領(lǐng)域研究熱點,促進血管化骨再生在種植術(shù)區(qū)骨修復(fù)再生中的研究亦受到密切關(guān)注[3-6]。隨著人均期望壽命提升,老年人群在種植修復(fù)治療患者中占比明顯提升。而老年患者存在衰老相關(guān)的骨組織愈合延遲和骨再生功能退化風(fēng)險[7-8],有研究發(fā)現(xiàn)成血管功能退化亦為老年患者骨再生功能退化的重要因素[9],因此,血管化骨再生在促進老年患者早期骨結(jié)合的形成過程中可能發(fā)揮重要作用。近年來有研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞來源的外泌體能夠改善細胞的衰老表型[10-11],低氧預(yù)處理的間充質(zhì)干細胞外泌體具有改善病理性血管功能的作用[12]。人羊膜間充質(zhì)干細胞(human amniotic mesenchymal stem cell,hAMSC)具有較高干性、低免疫原性、獲得量理想及獲取過程無侵入性操作等特征,是一種具有較好應(yīng)用前景的組織工程種子細胞[13]。基于以上,本研究通過建立人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)衰老模型探討低氧預(yù)處理人羊膜間充質(zhì)干細胞來源的外泌體(hAMSC-derived exosomes, hAMSC-exos)能否改善HUVEC衰老功能。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

α-MEM培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(Gibco,美國);ECM培養(yǎng)基(Sciencell,美國);青霉素-鏈霉素溶液(Gibco,美國);膠原酶D、中性蛋白酶(羅氏,美國);衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性染色試劑盒(碧云天,中國);transwell小室(8 μm)、Matrigel基質(zhì)膠(BD Biosciences,美國);人血小板裂解液(Helios,德國);0.45 μm及0.22 μm微生物過濾篩(Merck Millipore,德國);細胞裂解與蛋白抽提試劑盒(Thermo Fisher,美國);P16一抗、γH2AX一抗(Abcam,美國);β-actin一抗、P53一抗(Santa cruz,美國);HRP標(biāo)記二抗(Bioworld,美國);BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天,中國);D-半乳糖(D-gal,Sigma-Aldrich,美國);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(新賽美,中國)。

細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher,美國);蛋白電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad,美國);高速離心機(Thermo Fisher,美國);真空超高速離心機(Beckman Coulter,美國);透射電子顯微鏡(Tecnai G2 Spirit TEM,Zeiss,Oberkochen,德國)、Zetaview納米粒子跟蹤分析儀(Particle Metrix,德國)。

1.2 細胞來源及細胞培養(yǎng)

本實驗倫理審批號:No.PJ2021-0390001(南京醫(yī)科大學(xué))。

1.2.1 HUVEC提取及培養(yǎng) 取得健康足月產(chǎn)婦分娩后廢棄的胎盤臍靜脈,實驗室內(nèi)消化臍靜脈腔,離心后提取原代HUVEC并擴增。原代HUVEC于無菌培養(yǎng)箱中生長,培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定,CO2含量5%,溫度為37 ℃,用于其培養(yǎng)的ECM完全培養(yǎng)基含有5%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 IU/mL青霉素及1%內(nèi)皮生長因子。P2～P4代HUVEC被用于細胞實驗。

1.2.2 hAMSC提取及培養(yǎng) 取得健康足月產(chǎn)婦分娩后廢棄的胎盤。在超凈臺中用含有5%人血小板裂解液和1%青霉素-鏈霉素溶液的α-MEM完全培養(yǎng)基充分漂洗。剝離羊膜層,剪成約4.0 mm×4.0 mm的薄片,在中性蛋白酶(2.4 U/mL)溶液中充分消化10 min后,立刻用膠原酶D(1 mg/mL)在37 ℃培養(yǎng)箱中消化2.5～3.0 h,過濾后取得hAMSC細胞懸液,常規(guī)低速離心后取得細胞,用含5%人血小板裂解液的α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,24～48 h后首次換液并觀察細胞狀態(tài)。

1.2.3 常氧(Nor)和低氧預(yù)處理(Hy)hAMSC-exos的制備流程 將第二代hAMSC接種于含2 μg/mL肝素、5%人血小板裂解液、1%青霉素-鏈霉素溶液的α-MEM完全培養(yǎng)基,分別在20%(Nor)和2%(Hy)的氧含量條件下生長至80%匯合度,棄去皿內(nèi)原有培養(yǎng)基,以無菌PBS沖洗3次,加入適當(dāng)體積無血清混合培養(yǎng)基(50% DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基+50% α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng),24 h后分別收集上清液。3 000 ×g常溫離心以沉淀細胞碎片,分別收集上清液。高速離心機預(yù)冷至4 ℃,按以下流程離心:300 ×g,10 min;2 000 ×g,10 min;10 000 ×g,30 min。將離心后的上清液經(jīng)0.22 μm微生物過濾篩濾入超高速離心管,于4 ℃真空超高速離心機以120 000 ×g離心2 h。棄去離心后的上清液,以適量無菌PBS洗滌離心管底以充分重懸外泌體。吸取適量外泌體懸液,BCA蛋白濃度測定試劑盒按562 nm吸光度測定外泌體濃度,其余儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 hAMSC-exos的表征

1.3.1 hAMSC-exos電鏡形態(tài)拍攝 銅涂層網(wǎng)格上加入提取的hAMSC-exos懸液,放置5 min后加入2%乙酸雙氧鈾染色后室溫干燥10 min,調(diào)整透射電子顯微鏡(TEM)為120 kV,拍攝網(wǎng)格中的外囊泡。

1.3.2 hAMSC-exos的納米粒子追蹤分析(nanoparticles tracking analysis, NTA) 取100 μg hAMSC-exos,無菌PBS稀釋至1 mL;用納米粒子跟蹤分析儀評估hAMSC-exos的尺寸分布,基于布朗運動和擴散系數(shù),自動跟蹤粒子并確定其大小。設(shè)定儀器為(23.75±0.50)℃,25 s/幀(FPS),持續(xù)60 s。

1.4 衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性檢測

HUVEC的SA-β-Gal活性通過SA-β-Gal活性染色試劑盒檢測,將HUVEC以5×104個/孔細胞密度接種到6孔培養(yǎng)板中。按照制造商的要求進行SA-β-Gal活性染色,顯微鏡40倍物鏡下收集圖像并計數(shù)。

1.5 HUVEC衰老誘導(dǎo)

P2～P4代HUVEC接種于六孔板中,貼壁后更換含20 g/L D-gal的ECM完全培養(yǎng)基,孵育48 h后更換常規(guī)ECM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h以誘導(dǎo)亞急性衰老,用SA-β-Gal活性染色驗證誘導(dǎo)效果。

1.6 HUVEC衰老挽救實驗

P2～P4代HUVEC接種于6 孔板使其貼壁,對照組不作處理,D-gal處理組、D-gal處理+Nor hAMSC-exos孵育組和D-gal處理+Hy hAMSC-exos孵育組HUVEC用20 g/L D-gal孵育48 h以誘導(dǎo)衰老,隨后分別更換培養(yǎng)體系為常規(guī)ECM完全培養(yǎng)基以及含有終質(zhì)量濃度為200 ng/μL Nor hAMSC-exos或Hy hAMSC-exos的ECM完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進行SA-β-Gal活性染色以評估衰老挽救效果。

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法進一步驗證Hy hAMSC-exos改善HUVEC衰老的效果。使用細胞裂解與蛋白抽提試劑盒提取對照組、D-gal處理組和D-gal處理+Hy hAMSC-exos孵育組總蛋白,通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì),隨后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉該膜2 h后用針對P53、P16、γH2AX、β-actin的一抗在4 ℃冰箱孵育過夜,TBST洗滌后二抗室溫孵育2 h。使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑使印跡可視化。

1.7 transwell小室遷移實驗

將對照組、D-gal處理組、D-gal處理+Hy hAMSC-exos孵育組HUVEC經(jīng)消化、離心,分別以基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸并計數(shù),各取30 000個細胞于EP管中,補齊細胞懸液至200 μL,于小室下室加入600 μL含5%胎牛血清的培養(yǎng)體系,EP管中細胞懸液吹打混勻后加入上室。在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)16 h后取出小室,吸去小室內(nèi)培養(yǎng)體系,甲醇結(jié)晶紫固定1 h。晾干后于顯微鏡40倍物鏡下每組隨機選取3個視野拍照并計數(shù)。

1.8 HUVEC成管實驗

將液化Matrigel基質(zhì)膠按50 μL/孔加入96孔板,37 ℃孵育30 min使其凝固。消化離心對照組、D-gal處理組、D-gal處理+Hy hAMSC-exos孵育組HUVEC,用ECM完全培養(yǎng)基重懸并計數(shù),每組取含15 000個HUVEC細胞的懸液,配成100 μL體系打在基質(zhì)膠上,3.5 h后顯微鏡40倍物鏡下每組取3個隨機視野拍照,用Image J軟件分析成管長度。

1.9 劃痕實驗

對照組、D-gal處理組、D-gal處理+Hy hAMSC-exos孵育組HUVEC經(jīng)消化、離心后分別接種于提前畫線標(biāo)記的12孔板,用ECM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至近100%匯合度。槍頭垂直板底,垂直標(biāo)記線方向在板底單層細胞劃出兩條合適寬度的劃痕,隨后更換培養(yǎng)體系為含2%胎牛血清的ECM完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)16 h。顯微鏡40倍物鏡下收集每組劃痕后0 h和16 h同一視野5張照片,用Image J軟件分析各組遷移率。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計分析繪圖使用GraphPad Prism 9.0 版本軟件進行,兩組間統(tǒng)計分析使用t檢驗,多組間統(tǒng)計分析使用Turkey’s檢驗聯(lián)合one-way ANOVA。所有實驗均重復(fù)3次,P<0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hAMSC-exos的表征

在TEM下,hAMSC-exos呈現(xiàn)出經(jīng)典的杯形或球形形態(tài)(圖1A);根據(jù)NTA,MSC-sEV的粒徑分布曲線在55～200 nm之間,符合外泌體的直徑分布規(guī)律(圖1B)。

A:TEM;B:NTA

2.2 Hy hAMSC-exos較明顯改善HUVEC衰老的衰老表型

SA-β-Gal活性染色結(jié)果表明,較Nor hAMSC-exos,Hy hAMSC-exos孵育能夠更明顯地降低衰老HUVEC中SA-β-Gal活性染色陽性細胞率(圖2A、B)。圖2C顯示,因衰老上升的P53、P16和γH2AX蛋白水平在Hy hAMSC-exos孵育后被顯著逆轉(zhuǎn)。進一步驗證了Hy hAMSC-exos具有較好地緩解HUVEC衰老的作用。

A:SA-β-Gal活性染色顯微鏡下觀察;B:SA-β-Gal活性染色陽性細胞率;**:P<0.01,*:P<0.05;C:衰老標(biāo)志蛋白的免疫印跡實驗

2.3 Hy hAMSC-exos部分改善HUVEC的衰老相關(guān)功能退化

圖3～5顯示,衰老HUVEC的小管生成長度減少,同時小室遷移率和劃痕遷移率降低,體現(xiàn)出明顯的功能退化;而加入Hy hAMSC-exos孵育,則顯著逆轉(zhuǎn)了這一趨勢。

A:顯微鏡下觀察;B:成管總長度;***:P<0.001,**:P<0.01

A:顯微鏡下觀察;B:細胞遷移率;***:P<0.001,**:P<0.01

A:顯微鏡下觀察;B:劃痕遷移率;**:P<0.001,*:P<0.01

3 討 論

隨著人口老年化,臨床種植治療老年患者占比顯著增加,而老年患者骨量不足、骨修復(fù)再生功能退化是種植臨床需要解決的問題。老年機體各系統(tǒng)呈現(xiàn)整體性的功能性衰老退化[7],其中骨骼微環(huán)境中血管內(nèi)皮細胞的衰老是骨再生和重塑障礙的重要因素[14]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞來源的外泌體能夠改善細胞的衰老表型[10-11],其中乏氧誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細胞外泌體具有改善病理性血管功能的作用[15]。基于以上,我們認為低氧預(yù)處理的干細胞外泌體能夠改善衰老內(nèi)皮細胞功能,進而促進血管化骨再生。首先在體外建立了相關(guān)細胞模型并開展研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn):①D-gal可誘導(dǎo)HUVEC亞急性衰老從而建立HUVEC衰老細胞模型;②Hy hAMSC-exos可降低衰老HUVEC中相關(guān)標(biāo)志物的表達;③Hy hAMSC-exos可改善衰老HUVEC成血管功能的減弱。

骨組織是一種高度血管化的組織,其發(fā)育、成熟、重塑和再生高度依賴于血管功能。骨形成和骨折愈合的過程中,血管化不僅為間充質(zhì)干細胞遷移提供了通道,也是為代謝活躍的骨組織提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)以及清除代謝廢物的必要途徑[16]。血管化骨再生在骨組織工程中越來越受到重視,以改善因外傷、手術(shù)或生理性骨修復(fù)不足等造成的骨組織喪失的治療[17]。外泌體對血管生成的作用近年來已有研究,Atienzar-Aroca等發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜色素上皮細胞來源的外泌體能夠促進血管生成而引發(fā)致盲性眼疾病[18];Lu等[19]的研究顯示,骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可以在體內(nèi)和體外促進血管生成,從而增強血管化成骨的效果;亦有研究發(fā)現(xiàn)某些外泌體對血管生成具有抑制性作用,Dong等[20]曾經(jīng)通過外泌體向內(nèi)皮細胞傳遞抗血管生成肽抑制視網(wǎng)膜血管生成。目前的研究大多針對外泌體對生理狀態(tài)下的血管內(nèi)皮細胞的影響,而對病理(如衰老)狀態(tài)下的血管內(nèi)皮細胞的作用缺乏關(guān)注。在我們的研究中,使用D-gal刺激正常的HUVEC以誘導(dǎo)其亞急性衰老狀態(tài),建立衰老HUVEC細胞模型;然后使用常氧和低氧預(yù)處理的人羊膜間充質(zhì)干細胞來源的外泌體作用于衰老HUVEC,結(jié)果顯示Hy hAMSC-exos可更有效地改善HUVEC衰老及其成血管功能的退化。

衰老的特征是機體各系統(tǒng)整體性的功能退化[7]。研究顯示,老年患者骨再生表現(xiàn)出明顯的延遲甚至受損[8]。衰老成骨細胞的遺傳和表觀遺傳變化,以及衰老相關(guān)的微環(huán)境改變導(dǎo)致的對分化因子敏感性降低是老年患者成骨功能退化的重要原因[21-22]。近年來有研究進行了改善衰老相關(guān)的骨再生障礙的嘗試。如通過TERT基因(端粒逆轉(zhuǎn)錄酶)的過表達使老化的骨髓干細胞“重端粒化”,以及改善衰老相關(guān)分泌表型產(chǎn)生的不良炎癥微環(huán)境,達到緩解衰老、改善干性特征、增強骨再生的效果[23-24]。這些研究在改善衰老相關(guān)的成骨障礙方面取得了一定效果。而間充質(zhì)干細胞來源的外泌體具備較為理想的再生潛力,同時具有低免疫原性、低消除率和高融合率等諸多優(yōu)點,近年來在抗衰老研究領(lǐng)域受到關(guān)注[25]。有研究發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體能夠緩解成骨細胞的衰老并刺激其成骨活性[26];Zuo等[27]的一項研究中,骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體具有緩解輻照導(dǎo)致的骨髓干細胞的衰老和成骨功能退化的作用。對于在骨再生初始階段中發(fā)揮重要作用的血管內(nèi)皮細胞的衰老尚未見研究[28]。我們通過構(gòu)建HUVEC衰老模型來模擬老年患者頜骨種植術(shù)區(qū)血管內(nèi)皮衰老的微環(huán)境,通過Hy hAMSC-exos作用于衰老的HUVEC,結(jié)果顯示其顯著改善了衰老HUVEC相關(guān)衰老表型及功能退化。

本研究初步揭示了低氧預(yù)處理的人羊膜間充質(zhì)干細胞外泌體具有逆轉(zhuǎn)HUVEC衰老的作用,而此過程中涉及的具體分子機制尚不清楚。已有相關(guān)研究表明,外泌體可以直接結(jié)合細胞膜表面并與細胞膜融合或通過內(nèi)吞作用被內(nèi)化,從而將包裹在其中的蛋白、核酸和脂質(zhì)傳遞至目標(biāo)細胞[29]。近來Lei等的一項研究表示,新生兒臍帶干細胞來源的外泌體通過轉(zhuǎn)移增殖細胞抗原相關(guān)的mRNA來緩解人骨髓間充質(zhì)干細胞的衰老[30],這為外泌體通過傳遞核酸成分緩解靶細胞衰老的策略提供了一定的理論依據(jù)。基于該研究,我們后續(xù)將進一步明確Hy hAMSC-exos是否通過某些發(fā)揮關(guān)鍵作用的mRNA改善HUVEC衰老過程。