長鏈非編碼RNA尿路上皮癌相關基因1對人乳腺癌MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲的影響△

楊姝婭，劉文娟，駱耐香，韋冉，王鑫峰，劉文慧,5#

桂林醫學院基礎醫學院1免疫學教研室，4人體解剖學教研室，廣西 桂林 541001

2成武縣人民醫院病理科，山東 菏澤 2742000

3桂林醫學院第二附屬醫院檢驗科，廣西 桂林 541001

5中南大學湘雅醫院臨床藥理研究所，長沙 410008

乳腺癌是中國女性中最為普遍的惡性腫瘤[1]，世界衛生組織國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）發布的2020年全球乳腺癌數據顯示，乳腺癌新發病例高達226萬例，取代了肺癌（220 萬例）成為全球女性第一大腫瘤[2]。中國乳腺癌的早期診斷率尚未達到20%，中晚期患者的治愈效果也不理想，許多女性患者在治療后仍死于轉移和復發[3]。因此，進一步探究乳腺癌增殖和轉移的機制，篩選新的治療靶點迫在眉睫。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200 個核苷酸、與信使RNA結構相似、經過剪切后具有poly A 尾及啟動子結構的非編碼RNA[4-5]。研究發現，多種lncRNA 參與了乳腺癌的發生發展，并且可作為惡性腫瘤的診斷、預后標志物和治療靶點[6-9]。Zhao 等[6]研究發現，lncRNA HOX 轉錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）在乳腺癌組織和細胞中的表達均升高，并且可以促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制細胞凋亡。早期的研究發現lncRNA H19 在胃癌和膀胱癌中均可以促進細胞的增殖[7-8]，后來研究發現其在乳腺癌中也可以促進乳腺癌細胞的增殖，參與乳腺癌的轉移過程[10]。lncRNA轉移相關肺腺癌轉錄本1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）、母系表達基因3（maternally expressed 3，MEG3）等也被證實可以成為乳腺癌治療的潛在靶點[11]。尿路上皮癌相關基因1（urothelial cancer associated 1，UCA1）是近年來在膀胱癌中發現的一種lncRNA，也參與了乳腺癌的發生發展[12]，但其在乳腺癌中的具體作用機制尚不明確。本研究探討UCA1對乳腺癌MCF-7細胞生物學行為的影響，探索UCA1在乳腺癌中的作用機制，進而為臨床乳腺癌治療提供新的靶點，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞株MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231均購自中國科學院上海細胞庫，正常乳腺上皮細胞株MCF-10A購自武漢普諾賽生命科技有限公司。UCA1小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，UCA1過表達質粒由重慶優寶生物技術股份有限公司合成。高糖DMEM、RPMI1640、胰蛋白酶均購自美國Gibco 公司，胎牛血清購自蘇州依科賽生物科技股份有限公司，MCF-10A 專用培養基購自武漢普諾賽生命科技有限公司，siRNA 轉染試劑購自山東思科生物有限公司，四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl terazolium，MTT）試劑購自北京索萊寶科技有限公司，總RNA 提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，逆轉錄試劑購自莫納生物科技有限公司，引物購自武漢金開瑞生物工程有限公司，定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司。細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）一抗均購自英國Abcam 公司，β-actin 一抗和二抗免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理MCF-7 和SK-BR-3 細胞置于含10%胎牛血清的DMEM 培養基中，MDAMB-231 細胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養基中，MCF-10A 細胞置于專用培養基中，放入37 ℃5%CO2培養箱中培養。選取對數生長期的細胞分為4 組，分別為si-NC 組（對照）、si-UCA1 組（UCA1 敲低組，按照GenMute siRNA 轉染試劑說明書及siRNA 說明書進行細胞轉染）、vector 組（對照）和pcDNA-UCA1 組（UCA1過表達組），以每個電轉杯300×104個細胞進行電穿孔轉染，轉染后24 h 進行后續實驗。

1.2.2 總RNA 提取與qRT-PCR按照1.2.1 方法轉染MCF-7 細胞，48 h 后收集細胞，用RNA 總提取試劑盒提取總RNA，逆轉錄成cDNA，然后按照說明書進行qRT-PCR。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參，引物序列：GAPDH正義，5'-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3'，GAPDH反義，5'-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3'；UCA1 正義，5'-TGGCTGAAGACTGATGCTGC- 3'，UCA1 反義，5'-GGGAATCCTCCACCGTAAGA-3'；cyclin D1正義，5'-GTCGCTGGAGCCCGTGAA-3'，cyclin D1反義，5'-GGCCGGATGGAGTTGTCG-3'。 反應程序：94 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40 個循環，以2-△△Ct值表示待測基因的表達水平。實驗重復3 次。

1.2.3 MTT 法檢測細胞增殖能力按照1.2.1 方法轉染MCF-7 細胞，24 h 后重新消化計數均勻接種于96 孔板中，每組設5 個副孔，分別培養24、48、72、96 h。待細胞貼壁后每孔加入5 mg/ml 的MTT工作液20 μl，37 ℃5%CO2繼續培養4 h，棄去培養基，每孔加入200 μl 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），于定軌搖床搖10 min，用酶標儀檢測490 nm 波長下每個孔的光密度（optical density，OD）值。實驗重復3 次。

1.2.4 平板克隆形成實驗檢測細胞集落形成能力MCF-7 細胞轉染24 h 后重新消化，以600/孔接種于6 孔板中，每組設3 個副孔，連續培養14 天后結晶紫染色并拍照，記錄克隆形成數。實驗重復3 次。

1.2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力MCF-7 細胞轉染后，待細胞培養至90%融合度，10 μl 無菌槍頭劃過細胞層后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗3 遍，使用含2%胎牛血清的DMEM 培養基培養96 h，顯微鏡下觀察劃痕寬度并拍照，使用Image J 軟件計算劃痕面積，最終得出細胞遷移率。細胞遷移率=（0 h劃痕面積-所拍時間點劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。實驗重復3次。

1.2.6 Transwell 實驗檢測細胞遷移和侵襲能力胰蛋白酶消化MCF-7 細胞，用不含血清的基礎培養基重懸細胞并計數，以15×104/孔均勻接種于24孔板中Transwell 小室的上室，下室添加30%胎牛血清，37 ℃培養72 h，4%多聚甲醛固定30 min 后加結晶紫染色15 min，用棉簽擦除上室細胞，然后顯微鏡下拍照計算染色細胞數目。侵襲實驗需在小室上室提前鋪滿基質膠，其余步驟同遷移實驗。實驗重復3 次。

1.2.7 蛋白質印跡（Western blot）法檢測細胞中相關蛋白的表達MCF-7 細胞轉染72 h 后，用放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）細胞裂解液裂解細胞，裂解完成后用超微量核酸蛋白檢測儀檢測蛋白濃度，加熱變性后加至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate- polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）中分離蛋白并轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂牛奶封閉2.5 h，兔抗人cyclin D1、MMP2 和β-actin 抗體（1∶1500）于4 ℃冰箱中孵育過夜，然后二抗IgG 抗體（1∶5000）室溫孵育2 h，最后顯影液顯影，采用Image J 軟件進行半定量分析。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 軟件制圖，SPSS 19.0 統計軟件分析數據。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組比較采用t檢驗；以P﹤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同乳腺細胞株中UCA1 表達情況的比較

人乳腺癌細胞株MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231 和正常乳腺上皮細胞株MCF-10A 中UCA1的表達水平比較，差異有統計學意義（P﹤0.01）。人乳腺癌細胞株MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231 中UCA1 的表達水平均高于正常乳腺上皮細胞株MCF-10A，差異均有統計學意義（P﹤0.05）（表1）。其中，UCA1 在MCF-7 細胞中的表達水平最高，故后續實驗選擇MCF-7 細胞。

表1 不同乳腺細胞株中UCA1 表達情況的比較（±s）

表1 不同乳腺細胞株中UCA1 表達情況的比較（±s）

注：*與MCF-10A比較，P<0.05

細胞株MCF-10A MCF-7 SK-BR-3 MDA-MB-231 F值P值UCA1 1.00±0.09 9.95±0.50*2.76±0.36*6.40±0.90*158.700 0.000

2.2 敲低UCA1 對MCF-7 細胞增殖和集落形成能力的影響

si-NC 組MCF-7 細胞中UCA1 的表達水平為（1.01±0.03），明顯高于si-UCA1組的（0.58±0.05），差異有統計學意義（t=12.770，P﹤0.01）。培養24、48、72、96 h，si-UCA1 組MCF-7 細胞OD 值均明顯低于si-NC 組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）（表2）。si-UCA1 組MCF-7 細胞克隆形成數為（42.67±5.03）個，少于si-NC 組的（61.33±8.39）個，差異有統計學意義（t=3.306，P﹤0.05）（圖1）。

圖1 si-NC組和si-UCA1組MCF-7細胞的克隆形成數

表2 不同時間si-NC 組和si-UCA1 組MCF-7 細胞OD 值的比較（±s）

表2 不同時間si-NC 組和si-UCA1 組MCF-7 細胞OD 值的比較（±s）

組別si-NC組si-UCA1組t值24 h 0.44±0.02 0.37±0.01 4.350 48 h 0.58±0.02 0.48±0.00 8.883 72 h 0.75±0.05 0.54±0.02 7.191 96 h 1.08±0.03 0.84±0.06 6.246 P值0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 敲低UCA1 對MCF-7 細胞周期相關基因及蛋白的影響

si-UCA1 組MCF-7 細胞中cyclin D1基因和蛋白表達量均明顯低于si-NC 組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表3、圖2）

圖2 Western blot法檢測si-NC組和si-UCA1組MCF-7細胞中cyclin D1蛋白表達情況

表3 si-NC 組和si-UCA1 組MCF-7 細胞中cyclin D1 基因和蛋白表達情況的比較（±s）

表3 si-NC 組和si-UCA1 組MCF-7 細胞中cyclin D1 基因和蛋白表達情況的比較（±s）

組別si-NC組si-UCA1組t值P值cyclin D1基因1.00±0.07 0.39±0.06 10.910 0.000 cyclin D1蛋白1.00±0.09 0.63±0.08 5.711 0.000

2.4 敲低UCA1 對MCF-7 細胞遷移和侵襲的影響

培養48、72、96 h，si-UCA1 組MCF-7 細胞遷移率均明顯低于si-NC 組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。si-UCA1 組MCF-7 細胞中MMP2 蛋白表達量、細胞遷移數和細胞侵襲數均明顯低于si-NC組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表4、圖3、表5、圖4、圖5）

圖3 si-NC組和si-UCA1組MCF-7細胞的遷移情況

圖4 si-NC組和si-UCA1組MCF-7細胞的遷移和侵襲情況（結晶紫染色，×200）

圖5 Western blot法檢測si-NC組和si-UCA1組MCF-7細胞中MMP2蛋白表達情況

表4 不同時間si-NC組和si-UCA1組MCF-7細胞遷移率的比較（%，±s）

表4 不同時間si-NC組和si-UCA1組MCF-7細胞遷移率的比較（%，±s）

組別si-N C組si-UCA1組t值P值48 h 19.67±3.36 12.17±0.36 3.848 0.000 72 h 32.80±2.17 17.30±1.09 11.050 0.000 96 h 43.57±1.08 23.43±1.10 22.610 0.000

表5 si-NC組和si-UCA1組MCF-7細胞中MMP2蛋白表達量、細胞遷移數和細胞侵襲數的比較（±s）

表5 si-NC組和si-UCA1組MCF-7細胞中MMP2蛋白表達量、細胞遷移數和細胞侵襲數的比較（±s）

組別si-NC組si-UCA1組t值P值MMP2蛋白1.01±0.03 0.47±0.18 5.131 0.000細胞遷移數26.33±4.51 11.67±0.58 5.588 0.000細胞侵襲數32.33±7.23 14.33±2.52 4.070 0.000

2.5 過表達UCA1 對MCF-7 細胞增殖和集落形成能力的影響

pcDNA-UCA1 組MCF-7 細胞中UCA1 的表達水平為（57.25±6.15），明顯高于vector 組的（1.00±0.08），差異有統計學意義（t=15.840，P﹤0.01）。培養24、48、72、96 h，pcDNA-UCA1組MCF-7細胞OD值均明顯高于vector 組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）（表6）。pcDNA-UCA1 組MCF-7 細胞克隆形成數為（59.00±2.65）個，多于vector組的（31.00±9.54）個，差異有統計學意義（t=4.899，P﹤0.05）（圖6）。

圖6 pcDNA-UCA1組和vector組MCF-7細胞的克隆形成數

表6 不同時間pcDNA-UCA1 組和vector 組MCF-7 細胞OD 值的比較（±s）

表6 不同時間pcDNA-UCA1 組和vector 組MCF-7 細胞OD 值的比較（±s）

組別vector組pcDNA-UCA1組t值P值24 h 0.35±0.01 0.41±0.01 8.211 0.000 48 h 0.42±0.01 0.46±0.01 5.075 0.000 72 h 0.45±0.02 0.61±0.03 6.941 0.000 96 h 0.63±0.05 0.82±0.03 5.403 0.000

2.6 過表達UCA1 對MCF-7 細胞周期相關基因及蛋白的影響

pcDNA-UCA1 組MCF-7 細胞中cyclin D1基因和蛋白表達量均明顯高于vector 組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表7、圖7）

圖7 Western blot法檢測pcDNA-UCA1組和vector組MCF-7細胞中cyclin D1蛋白表達情況

表7 pcDNA-UCA1 組和vector 組MCF-7 細胞中cyclin D1基因和蛋白表達情況的比較（±s）

表7 pcDNA-UCA1 組和vector 組MCF-7 細胞中cyclin D1基因和蛋白表達情況的比較（±s）

組別vector組pcDNA-UCA1組t值P值cyclin D1基因1.00±0.08 1.26±0.09 3.690 0.000 cyclin D1蛋白1.00±0.00 1.80±0.20 6.991 0.000

2.7 過表達UCA1對MCF-7細胞遷移和侵襲的影響

培養48、72、96 h，pcDNA-UCA1 組MCF-7 細胞遷移率均明顯高于vector 組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。pcDNA-UCA1 組MCF-7 細胞中MMP2 蛋白表達量、細胞遷移數和細胞侵襲數均明顯高于vector 組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表8、圖8、表9、圖9、圖10）

圖8 pcDNA-UCA1組和vector組MCF-7細胞的遷移情況

圖9 pcDNA-UCA1組和vector組MCF-7細胞的遷移和侵襲情況（結晶紫染色，×200）

圖10 Western blot法檢測pcDNA-UCA1組和vector組MCF-7細胞中MMP2蛋白表達情況

表8 不同時間pcDNA-UCA1組和vector組MCF-7細胞遷移率的比較（%，±s）

表8 不同時間pcDNA-UCA1組和vector組MCF-7細胞遷移率的比較（%，±s）

組別vector組pcDNA-UCA1組t值P值48 h 30.66±0.14 37.78±0.84 14.500 0.000 72 h 41.10±1.52 50.06±1.72 6.774 0.000 96 h 54.18±2.50 64.72±5.24 3.144 0.000

表9 pcDNA-UCA1組和vector組MCF-7細胞中MMP2蛋白表達量、細胞遷移數和細胞侵襲數的比較（±s）

表9 pcDNA-UCA1組和vector組MCF-7細胞中MMP2蛋白表達量、細胞遷移數和細胞侵襲數的比較（±s）

組別vector組pcDNA-UCA1組t值P值MMP2蛋白1.00±0.00 2.21±0.53 3.934 0.000細胞遷移數10.33±1.53 22.33±4.93 4.025 0.000細胞侵襲數16.67±3.21 52.67±1.53 17.52 0.000

3 討論

乳腺癌是目前威脅女性健康的主要腫瘤，也是導致女性死亡的主要原因之一[13]。對于乳腺癌的治療，除了手術，還包括免疫治療在內的生物治療。雖然乳腺癌的治療有了長足進步，但是手術、放療和化療會抑制正常細胞生長，并且有很大的不良反應和高毒性[14-15]。乳腺癌的發病原因、發病機制仍然沒有得到完全闡明，但是早診斷、早治療仍然是降低乳腺癌復發和轉移的最有效的方法之一。因此尋找新的乳腺癌早期診斷分子標志物以及精準的治療靶點迫在眉睫。lncRNA 的異常表達發揮著抑癌或促癌的作用，被認為在腫瘤發展過程中發揮關鍵作用。lncRNA 可以與細胞質中的蛋白相互作用[16]，也可以作為內源性競爭性RNA與微小RNA（microRNA，miRNA）相互作用[17-18]。近年來，大量研究發現lncRNA UCA1 在多種腫瘤的發生發展中均扮演了重要的角色。研究表明，沉默UCA1后可顯著抑制卵巢癌細胞SKOV-3 的增殖和遷移，并且可以下調增殖和遷移相關蛋白的表達[19]。Cao 等[20]研究顯示，UCA1 在結腸癌中高表達，敲低UCA1可抑制結腸癌細胞的侵襲、遷移以及上皮-間充質轉化，并且在體內試驗中也可抑制腫瘤形成。另一項研究發現，下調UCA1的表達可明顯抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移[21]。此外，研究發現，乳腺癌組織中UCA1 的表達顯著高于癌旁組織[22-23]。本研究發現，UCA1 在乳腺癌細胞株MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231 中的表達均高于正常乳腺上皮細胞株MCF-10A，與臨床研究一致，表明UCA1 在乳腺癌的發生發展中發揮重要作用。

lncRNA 在調控乳腺癌的細胞周期中發揮重要作用。cyclin D1 是細胞周期相關蛋白，是連接外界生長因子、信號轉導與細胞周期調控的紐帶，可調節細胞增殖、分化和凋亡過程[24]。在乳腺癌細胞中誘導cyclin D1表達可使G1期細胞數量增加，并加速從G1期向S 期的轉變，進而加速乳腺癌進程[25]。乳腺癌細胞中lncRNA BCRT1 敲低后，細胞的增殖和集落形成能力下降，凋亡率增加；并且體內試驗也證實，BCRT1 過表達后腫瘤重量和腫瘤體積均顯著增加[26]。另有研究發現，乳腺癌中過表達LINC00969 后G1期細胞數量顯著多于對照組，S 期細胞數量少于對照組；并且Western blot 結果顯示過表達LINC00969 組cyclin D1 蛋白的表達量顯著降低，說明lncRNA 可能通過調控cyclin D1 進而影響乳腺癌的增殖[27]。本研究結果顯示，敲低UCA1后MCF-7 細胞增殖和克隆形成能力受到抑制，cyclin D1基因和蛋白表達量也下降；過表達UCA1后細胞增殖和克隆形成能力明顯增強，cyclin D1基因和蛋白表達量也升高，提示UCA1可以通過促進cyclin D1基因和蛋白表達從而影響乳腺癌細胞的增殖和克隆形成能力。

MMP 是一種鋅依賴的蛋白水解酶，可以降解膠原蛋白和彈性蛋白等多種蛋白質組分，在腫瘤的侵襲轉移中發揮關鍵作用[28]。Xu 等[29]發現，MMP2 上調可以增強乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，參與乳腺癌轉移的過程。并且，敲低lncRNA PPANDAR 后乳腺癌細胞遷移和侵襲的數量變少，MMP2 和MMP9 的蛋白表達量也降低[30]。本研究發現，敲低UCA1后MCF-7 細胞的劃痕愈合能力下降，細胞的遷移和侵襲數量減少，并且MMP2 蛋白表達量也下降；而過表達UCA1后MCF-7 細胞的劃痕愈合能力加快，細胞的遷移和侵襲數量增加，并且MMP2 蛋白表達量也升高，提示UCA1可以通過促進MMP2 蛋白表達從而影響乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，UCA1在乳腺癌細胞中表達升高，可能是通過調控cyclin D1 和MMP2 促進乳腺癌的增殖、遷移和侵襲，但其具體分子機制還有待進一步研究。