長枝木霉菌非核糖體肽合成酶基因啟動子NP249的克隆及功能驗證

官萌嬌,孫旭杰,夏卓林,任愛芝,趙培寶

(聊城大學 農學與農業工程學院,山東 聊城 252000)

木霉菌(Trichodermaspp.)屬半知菌亞門,多數菌株進行無性繁殖,有性階段為肉座菌,是重要的生防真菌。對環境適應性強,生防機制多樣,已被廣泛應用于防治由真菌、細菌和線蟲引起的植物病害[1-2]。木霉菌對植物也有一定的促生作用,能夠提高植物對逆境的適應能力,最終促進植物的生長。木霉產生的次級代謝產物及抗生素在生防過程中起著重要的作用。

木霉菌次生代謝產物多樣,Peptaibols是真菌的次生代謝產物之一,是由非核糖體多肽合成酶(Nonribosomal peptide synthetase,NRPS)合成的多肽類抗菌物質,具有抗病毒、抗真菌和抗癌等多種生物學活性[3-6]。長枝木霉SMF2(TrichodermaLongibrachiatumSMF2)為一株高產Peptaibols的菌株,該菌株能夠產生Peptaibols類抗菌素康寧霉素(Trichokonins,TKs),其中Trichokonin VI含量最高[7]。Trichokonin VI能夠抑制革蘭氏陽性細菌枯草芽孢桿菌的生長[8],對臭椿苗期病害以及灰葡萄孢菌引起的蝴蝶蘭灰霉病也有一定的防治效果[9-10];激活水楊酸信號途徑,增加大白菜對軟腐病的抗性[11];通過激活多條防御信號通路增加煙草對煙草花葉病毒侵染的防御反應和系統抗性,誘導煙草體內ROS的產生、施藥部位酚類化合物的積累和對病毒的抗性[12]。由此可見,Trichokonin VI在生物防治方面具有廣闊的應用前景,但其合成機制尚不清楚,因此,研究其合成機制,提高Trichokonin VI產量使其在生物防治中發揮作用是至關重要的。隨著長枝木霉SMF2基因組序列的公布,長枝木霉SMF2合成Peptaibols機制的研究揭開了新篇章,除了添加特定氨基酸和調控培養基的碳氮源配比等條件來調控Peptaibols的產生,Peptaibols的生物合成還受到多種基因的調控。Peptaibols是一類由非核糖體合成酶系統合成的多肽,其氨基酸序列分別與NRPS上的各個組件相對應,這就為Peptaibols的分子改造提供了可能[13]。通過對長枝木霉菌 SMF2 菌株產生的抗菌素進行深入研究,明確了該菌株產生的Peptaibols短肽TrichokoninVI,由 NRPS 基因簇TPX1合成[14]。

為進一步探究非核糖體肽類抗菌素的合成機制,本研究以長枝木霉SMF2菌株為材料,克隆了NRPS的啟動區域,構建綠色熒光表達載體,采用REMI介導的原生質體轉化法,將重組的攜帶GFP基因的質粒pCX-62-GFP-249轉入長枝木霉SMF2野生型菌株中,驗證啟動子功能。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與引物 長枝木霉SMF2由聊城大學農學院趙培寶實驗室保存;綠色熒光蛋白GFP基因來自pCX-62-GFP由本實驗室前期構建;引物249-1:5′-ATGTGGGAAATAGCGAGAT-3′(60);249-4:5′-GGGCTGCCAGGTCTTTT-3′(NRPS22);249-1B:5′-CGGGATCCATGTGGGAAATAGCGAGTA-3′;249-4X:5′-TCCCCCCGGGCTTGGCGGGTTGGGCG-3′,由上海生工合成。

1.1.2 主要試劑 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、高純質粒小量制備試劑盒、真菌基因組DNA提取試劑盒百泰克(BioTeke)公司;T4DNA連接酶、XmaⅠ、BamH Ⅰ、pMD-18T載體等購自寶生物(TaKaRa)公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 將長枝木霉轉接到PDA培養基上培養5 d,刮取菌絲烘干。烘干后加入液氮研磨,使用真菌基因組DNA試劑盒提取DNA,-20 ℃保存備用。

1.2.2 啟動子預測 采用Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)、TFSEARCH(http://www.Gene-regulation.com)等在線軟件,參考EPD(Eukaryotic promoter database,http://www.epd.Isb-sib.ch/)、TRANSFAC(http://www.Gene-regulation.com)等啟動子數據庫,并結合真菌啟動子的結構特征,對NRPS基因TPX1上游DNA序列進行分析,尋找其順式元件,例如TATA盒、CAAT盒、GC盒及其他可能的調控元件,并結合熒光蛋白GFP等報告基因的融合與表達分析來確定啟動子。

1.2.3 啟動區擴增 以長枝木霉SMF2的DNA為模板,249-1和249-4為引物進行PCR擴增,95 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30個循環;72 ℃最終延伸10 min。得到1 204 bp的目的基因249的片段,送去測序。

測序后的片段與pCX-62所含的酶切位點相比較分析,在249-1和249-4的5′端添加酶切位點和保護堿基設計帶有酶切位點的引物249-1B和249-4X。PCR擴增以擴增出的片段為模板,249-1B和249-4X為引物進行PCR擴增,95 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s,68 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30個循環;72 ℃最終延伸10 min。

膠回收純化后得到NP249基因啟動子片段,將目的片段DNA連接到pMD-18T載體上,在PCR儀內過夜連接得到重組載體NP249-pMD-18T,通過大腸桿菌熱激法轉化將重組質粒249-pMD-18T轉化至DH5α菌體內實現重組質粒的擴增。

1.2.4 GFP融合載體構建 用XmaⅠ、BamH Ⅰ對pCX-62-GFP和249-pMD-18T進行酶切,T4DNA連接酶16 ℃過夜連接,將連接后的質粒通過大腸桿菌熱激轉化法導入到大腸桿菌DH5α感受態細胞內。以菌液為模板,249-1B和249-4X為引物,進行PCR擴增驗證菌液是否為陽性,菌液PCR結果為陽性后提取重組質粒249-pCX-62-GFP雙酶切鑒定。

1.2.5 遺傳轉化和轉化子篩選 制備長枝木霉SMF2原生質體,保存的長枝木霉菌SMF2轉接于PDA上,28 ℃培養3～5 d后刮取孢子,置于50 mL PDB培養基中,28 ℃,150 r/min振蕩培養12 h。等量分裝于25 mL離心管中,放入高速冷凍離心機中,4 000 r/min,4 ℃離心10 min,收集菌絲。加入10 mL 0.7 mol/L NaCl溶液沖洗菌絲,4 000 r/min,4 ℃離心10 min,棄上清液,后重復此步驟1次。稱取0.1 g溶壁酶與4 mL 0.7 mol/L NaCl溶液混合,混勻后用0.22 μm水相針式濾器過濾,過濾后的溶液加入收集菌絲的離心管內,混合均勻,置于恒溫振蕩培養箱中30 ℃,150 r/min培養3.5 h得到原生質體。制備好的原生質體中加入28 mL 0.7 mol/L的NaCl溶液,用3層擦鏡紙過濾至新的離心管中,4 000 r/min,4 ℃離心7 min,收集原生質體。

使用限制性內切酶介導的轉化(REMI)技術對長枝木霉SMF2原生質體進行轉化,在含原生質體的離心管內加入10 mL STC溶液沖洗離心棄掉上清液,加入150 μL STC備用。將50 μL STC溶液、50 μL線性化質粒、2 μL限制性內切酶Hind Ⅲ加入1.5 mL離心管中,混合均勻后加入上述含150 μL STC的原生質體中,冰浴20 min。加入2 mL預冷的PTC,冰浴20 min,室溫20 min。加入20 mL STC,4 000 r/min,4 ℃離心7 min,棄掉上清液,加入2 mL再生PDB置于28 ℃過夜培養,將過夜培養的長枝木霉原生質體與再生PDA混合均勻倒平板,待長出微菌落后覆上10 mL含100 μg/mL潮霉素的0.7%水瓊脂,28 ℃培養。

1.2.6 轉化子篩選 待長出轉化子后將長出的轉化子轉接到含潮霉素抗性的培養基上,連續轉接3代篩選穩定的轉化子,提取轉化子DNA,以Hph1和Hph2為引物進行PCR驗證。挑取轉化子的菌絲置于熒光顯微鏡下檢測熒光表達狀態,驗證啟動子功能。

2 結果與分析

2.1 啟動子預測

通過網站獲取TPX1基因轉錄起始點上游1 204 bp作為啟動子序列,根據啟動子預測結果(圖1),可見大號的A是酶轉錄起始堿基,上游30 bp處有一個TATA box。

圖1 啟動子預測Fig.1 Promoter predictions

2.2 啟動區的擴增

以長枝木霉SMF2基因組DNA為模板進行PCR擴增,擴增產物回收測序結果顯示成功克隆NP249啟動子序列(圖2)。將測序正確的片段連接到pMD-18T載體上,提取質粒,經1%瓊脂糖凝膠電泳分析可見目的基因條帶,大小與預期一致(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker;1,2.NP249基因片段。M.DL2000 DNA Marker;1,2.NP249 gene fragment.

M.DL5000 DNA Marker;1.pMD-18T重組質粒。M.DL5000 DNA Marker;1.pMD-18T recombinant plasmid.

2.3 融合載體的構建

連接過夜的質粒轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞內,菌液PCR驗證為陽性(圖4)。249-pCX-62-GFP的雙酶切(XmaⅠ、BamH Ⅰ)產物經1%瓊脂糖凝膠電泳可見2條條帶,載體條帶和目的基因條帶,大小與預期一致,表明獲得了249啟動子的GFP融合載體(圖5)。

M.DL2000 DNA Marker;1.目的片段;2.GFP融合載體菌液PCR。M.DL2000 DNA Marker;1.Target fragment;2.GFP fusion vector bacterial solution PCR.

M.DL5000 DNA Marker;1.GFP融合載體雙酶切。M.DL5000 DNA Marker;1.Double enzyme digestion of GFP fusion vector.

2.4 轉化子的熒光檢測

提取轉化子DNA,進行PCR擴增,擴增得到潮霉素抗性條帶(圖6),表明載體已整合到基因組中。使用熒光顯微鏡對轉化子菌絲進行熒光檢測,檢測到GFP熒光信號(圖7),表明克隆到的基因啟動子能夠啟動GFP的表達,具有啟動子功能。

M.DL2000 DNA Marker;1.野生型長枝木霉SMF2 DNA;2,3.轉化子DNA。M.DL2000 DNA Marker;1.DNA of Trichoderma longibrachiatum SMF2;2,3.DNA of transformants.

圖7 轉化子菌絲熒光檢測Fig.7 Fluorescent detection of transformant hypha

3 結論與討論

綜上所述,本試驗擴增到的1 204 bp大小的NRPS啟動子序列能夠啟動GFP的表達,具有啟動子的功能。該啟動子的克隆為進一步研究NRPS合成Peptaibols的機制奠定了基礎。

Peptaibols是木霉最主要的次級代謝產物之一,是由NRPS催化單個氨基酸殘基添加至肽鏈合成的非核糖體肽類。非核糖體合成酶合成多肽過程遵循共線性裝配規則,非核糖體合成酶途徑通過利用除20種氨基酸外的稀有氨基酸或脂肪酸為原料,在多酶或多結構域合成系統的參與下合成非核糖體肽(Nonribosomal Peptides,NRPs),合成機理為多載體巰基化模板[15]。

NRPSs是一種分子量巨大的多功能酶系,是合成NRPs的關鍵。它由一系列模塊按順序排列作為多肽合成的模板,因而模塊的種類、數量和空間排列順序決定了多肽的特異性,且模塊在基因組上成簇排列。每一個模塊由負責識別并活化特定底物為相應的腺苷酸化合物的腺苷酸化結構域(Adenylation,A)、起反應中間物硫脂固定作用的巰基化結構域(Thiolation,T)和負責肽鍵形成的縮合結構域(Condensation,C)共同組成,從而實現將一種氨基酸整合至產物骨架中[16-20]。鞏志廷[21]發現,在長枝木霉SMF2中,TPX1和TPX2基因分別控制含有20個氨基酸殘基和12 個氨基酸殘基的Peptaibols的生物合成;Zhou等[22]通過敲除TISTP1基因使Trichokonin A的產量增加了5倍,Trichokonin B的產量增加了2.6倍;Shi等[23]發現敲除偏甲基轉移酶基因TLIae1下調了Tlx1和Tlx2的表達,抑制了Trichokonin A和Trichokonin B的產生。生物信息學分析發現,在長枝木霉SMF2中有NRPSs的同源基因,該基因可能與NRPSs合成Peptaibols相關,但對其如何發揮作用還不清楚。

通過對啟動子進行克隆明確該基因具有啟動子功能,繼而尋找反式作用因子,來研究NRPS基因表達調控方式,為NRPS轉錄調控,高水平合成非核糖體抗菌肽提供幫助。