基于網絡藥理學和分子對接探析三黃瀉心湯加味治療上消化道出血的作用機制※

方灶軍 王 倩

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院急診內科,上海 230012)

上消化道出血(upper gastrointestinal bleeding,UGIB)即十二指腸懸韌帶以上的消化道出血,是臨床上常見的危害患者健康的急癥之一,具有高發病率、高死亡率、起病急、進展快等特點。因此,對于該病的治療需要及時且有效。西藥治療UGIB主要是積極止血、抑制胃酸分泌、修復受損黏膜,具有吸收快、起效快等特點,但西藥易引起不良反應[1-2],如頭暈乏力、惡心嘔吐、白細胞減少、便秘、腹瀉等,不利于患者預后。而中藥在治療UGIB中可顯著減少不良反應發生[3]。

UGIB歸屬于中醫 “血證”“吐血”“便血”等范疇。中醫學認為,UGIB的本質是絡傷血溢[4]。根據多數學者的觀點[5],絡傷血溢主要責之于“熱”和“虛”?！盁帷闭?包括胃熱、肝火、陰虛火旺,主要由情志不遂、飲食不節所致;因熱盛傷津傷絡,迫血妄行而離經成瘀,臨床表現為胃脘灼熱疼痛,血色鮮紅,口苦,便秘,出血臭穢,舌紅,苔黃,脈滑。對于該類患者當治以清熱解毒、涼血止血,予三黃瀉心湯加味[6]。

三黃瀉心湯出自《金匱要略》,由黃連、黃芩、大黃組成,主要作用為清熱解毒、涼血止血。本研究采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)篩選出三黃瀉心湯加味中6味中藥的化學活性成分及相應靶點,而后于Gene Gards、OMIM、Pharmgkb及DrugBank數據庫中檢索UGIB靶點,并將二者靶點相交,作蛋白質-蛋白質相互作用(PPI) 網絡分析并分別篩選關鍵化學成分核心靶點,進行基因本體(Gene Ontology, GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,最后對關鍵化學成分及靶點分子進行分子對接。最終對三黃瀉心湯加味治療UGIB的有效成分及靶點進行預測,探討其產生作用的信號通路,對三黃瀉心湯加味治療UGIB的作用機制提供新思路。

1 資料與方法

1.1 三黃瀉心湯加味活性成分篩選 通過檢索TCMSP[7]搜索出三黃瀉心湯加味中6味中藥單藥(黃連、黃芩、大黃、白及、側柏炭、仙鶴草)的活性成分,活性成分中的有效化合物篩選標準設定為口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18,由此得到符合條件的活性成分靶點信息。最后,通過UniPort(https://www.uniprot.org/)規范靶點信息[8-9]。

1.2 UGIB疾病靶點篩選 以“Upper gastrointestinal bleeding”為關鍵詞,通過Gene Cards數據庫、OMIM數據庫、Pharmgkb數據庫和DrugBank數據庫搜集UGIB的疾病靶點,合并4個數據庫靶點,并繪制韋恩(Venn)圖。

1.3 中藥-活性成分-靶點網絡圖的構建及網絡拓撲分析 通過Bioinformatics &Evolutionary Genomics(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在線工具對得到的三黃瀉心湯加味活性成分靶點和疾病相關靶點進行篩選,獲得兩者交集靶點,將得到的交集靶點導入Cytoscape 3.9.0軟件[10]。通過Cytoscape 3.9.0軟件構建出中藥-活性成分-靶點網絡圖,然后運用該軟件的Network Analyzer功能進行網絡拓撲分析。網絡中的節點以度值(Degree)為單位表示[11],其自由度的高低通過節點靶點的大小展示。

1.4 構建PPI網絡,篩選關鍵靶點 將交集靶點導入至STRING數據庫(https://www.string-db.org/)[11],限定物種為“Homosapiens”,設置minimum required interaction score為highest confidence (0.900),構建PPI網絡,得到交集靶點的PPI網絡信息,獲取相關生物過程、分子作用和通路信息。通過Cytoscape 3.9.0的Cyto NCA插件進行拓撲分析,以介數中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC)、度中心性(degree centrality,DC)、特征向量中心性(Eigenvector centrality,EC)、局部連通性(local average connectivity-based method, LAC)、網絡中心性(network centrality, NC)等條件篩選出關鍵靶點 ,利用Cytoscape 3.9.0軟件將其可視化。

1.5 交集靶點基因富集分析 將交集靶點導入DAVID數據庫,進行GO富集分析和KEGG通路富集分析,用R軟件Bioconductor庫進行繪圖將其可視化。篩選標準為P<0.05、Q<0.05、物種為Homo sapiens,輸出結果按照QValue或PValue值排序并將其可視化。GO富集分析按照生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function,MF)3個方面輸出前10位結果, KEGG富集分析輸出前30位結果,并通過條形圖、氣泡圖將其可視化[12]。

1.6 分子對接驗證 首先從PDB數據庫下載關鍵靶點蛋白3D結構,從TCMSP下載活性成分的MOL2文件,然后通過PyMOL軟件對關鍵靶點蛋白結構進行加氫、去除水分子等操作,利用AutoDock Tools 1.5.6、AutoDock Vina對關鍵靶點蛋白和主要活性成分進行分子對接,記錄結合能,并用PyMol對部分結果進行可視化。

2 結果

2.1 三黃瀉心湯加味活性成分篩選及潛在作用靶點收集 通過TCMSP檢索到符合篩選標準的三黃瀉心湯加味活性成分共有87個,其中黃連14個,黃芩36個,大黃16個,白及9個,側柏炭7個,仙鶴草5個。然后將得到的活性成分預測作用靶點導入到UniProt數據庫進行標準化,刪除重復值,最后得到靶點基因共183個。

2.2 UGIB靶點收集 利用Gen Cards、OMIM、DrugBank、PharmGkb疾病數據庫分別獲得潛在靶點3319個、10個、50個、6個,整合后共有3385個,刪除重復值,最后得到3350個UGIB相關靶點。見圖1。

圖1 疾病靶點韋恩圖

2.3 中藥-活性成分-靶點網絡圖構建及網絡拓撲分析 三黃瀉心湯加味靶點183個和疾病相關靶點3350個進行重復比較,最終得到141個交集靶點,說明三黃瀉心湯可通過141個靶點作用于UGIB。通過Cytoscape 3.9.0軟件構建出中藥-活性成分-靶點網絡圖。網絡拓撲分析結果:該網絡共包括204個節點(63個成分節點,141個靶點節點)和 738 條邊,節點平均自由度為 7.235。做網絡拓撲分析的時候,按照Degree值由大到小排列,選取排名前10的活性成分。見圖2、3,表1。

表1 活性成分排名前10信息(按Degree值排序)

圖2 三黃瀉心湯加味與疾病靶點韋恩圖

表格成分節點中綠色正方形代表靶點,圓形代表藥物活性成分(灰色代表白及,黑色代表側柏葉,黃色代表大黃,紫色代表黃連,紅色代表黃芩,藍色代表仙鶴草)。

2.4 PPI網絡分析 將2.3中獲得的141個交集靶點導入至STRING數據庫存進行PPI分析,得到PPI網絡圖。將PPI關系導入Cytoscape 3.9.0軟件,運用 CytoNCA 插件進行網絡拓撲分析結果顯示:該網絡 BC、CC、DC、EC、LAC、NC中位數分別為13.9、0.6、24、0.16、12.86、14.44,提取這些參數均大于中位數的節點共15個;再次進行子網絡拓撲分析,以同樣的方法提取核心節點4個,分別為ESR1、MYC、TP53 和 HIF1A,表明這些基因在三黃瀉心湯加味治療UGIB的過程中具有重要意義。見圖4、5。

圖4 PPI網絡圖

圖5 核心靶點篩選

2.5 GO功能富集與KEGG通路富集分析 將141個交集靶點用 R 軟件進行 GO 富集分析,共得到 2149個BP條目,63 個CC條目,179 個MF條目(結果均滿足P<0.05 且Q<0.05)。分別對3個方面QValue排名前10的條目進行可視化。在BP分析中,主要涉及對氧化應激的反應(response to oxidative stress)、細胞對化學應激的反應(cellular response to chemical stress)、對藥物的反應(response to drug)、對氧含量的反應(response to oxygen levels)等。在CC分析中,主要涉及膜筏(membrane raft)、膜微區(membrane microdomain)、轉移酶復合物,轉移含磷基團(transferase complex,transferring phosphorus containing groups)、蛋白激酶復合物(protein kinase complex)等。在MF分析中,主要涉及DNA結合轉錄因子結合(DNA binding transcription factor binding)、泛素樣蛋白連接酶結合(ubiquitin like protein ligase binding)、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合(RNA polymerase Ⅱ specific DNA binding transcription factor binding)、泛素蛋白連接酶結合(ubiquitin protein ligase binding)、絲氨酸水解酶活性(Serine Hydrolase Activity)等。

KEGG富集分析共得到168個條目(結果均滿足P<0.05 且Q<0.05),對其按QValue 排名前 30 的結果進行可視化。主要富集通路有:脂質與動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、流體剪切應力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、前列腺癌(prostate cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、內分泌抵抗(endocrine resistance)、小細胞肺癌(small cell lung cancer)、白細胞介素17(IL-17)、信號通路(IL-17 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、丙型肝炎(hepatitis C)、人類巨細胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、胰腺癌(pancreatic cancer)、麻疹(measles)、細胞衰老(cellular senescence)、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、弓形體病(toxoplasmosis)、P13K-Akt信號通路(P13K-Akt signaling pathway)、癌癥中的蛋白多糖(proteoglycans in cancer)、結腸直腸癌(colorectal cancer)、鉑耐藥性(platinum drug resistance)、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)、恰加斯病(chagas disease)等。結果表明,三黃瀉心湯加味的活性成分靶點分布于不同的信號通路,說明三黃瀉心湯加味可以通過對多條通路的調節作用達到治療UGIB的目的。見圖6、7。

圖6 GO富集分析圖

圖7 KEGG富集分析圖

2.7 關鍵成分與靶點蛋白的分子對接分析 三黃瀉心湯加味排名前3的活性成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚,同時由PPI的結果可知基因ESR1、MYC、TP53、HIF1A為關鍵靶點,故利用AutoDock Vina對上述3種活性成分與4個靶點蛋白進行對接,驗證化合物和靶點的結合活性。對結合能統計可知平均結合能為-7.7 kcal/mol,均小于-5 kcal/mol,表明關鍵靶點與化合物之間具有較強的結合活性。然后用 PyMOL 軟件對部分對接結果進行可視化,直觀展示其構象關系,從圖表發現這些蛋白和化合物結合至少形成了一個氫鍵相互作用力,使他們能夠穩定的結合。因此,三黃瀉心湯加味可能通過以上關鍵靶點干預UGIB的相關通路,達到改善或者治療UGIB的作用。見表2、圖8。

表2 三黃瀉心湯加味關鍵成分與靶點蛋白分子對接信息 (kcal/mol)

圖8 分子對接圖

3 討論

三黃瀉心湯加味方中以大黃為君藥,黃芩、黃連共為臣藥,白及、側柏炭、仙鶴草為佐藥,六藥配伍重在瀉火,佐以止血。其中大黃有清熱瀉火通肺之效,黃連有瀉心清胃、燥濕解毒的功效,黃芩有瀉肺燥濕的功效,可提升瀉火清熱的效果,仙鶴草收斂止血,兼解毒補虛,白及收斂止血,消腫生肌,側柏炭涼血以止血,全方可達到清熱止血、瀉火化瘀之效,實現不止血而血自止的效果?，F代藥理研究顯示[13],三黃瀉心湯加減可對內源性凝血系統產生作用,達到止血效果,同時可抑制胃蛋白酶活性,以保護胃黏膜;大黃對改善血管脆性效果明顯,可通過增強毛細血管通透性,加速血管收縮活性,促使血液凝固;此外,大黃對胃黏膜還具有修復作用。因此在UGIB治療中聯合應用三黃瀉心湯加味可提升止血效果,同時對受損的胃黏膜進行修復。

本研究以三黃瀉心湯加味的化學成分、靶點及通路信息等多項數據,構建網絡對其功能分析,系統預測其對UGIB可能分子機制。UGIB的病因主要為非靜脈曲張性上消化道出血(non-variceal upper gastrointestinal bleeding ,NVUGIB)和食管胃底靜脈曲張出血(esophageal and gastric varices bleeding ,EGVB)[14]。

NVUGIB 通常是由消化性潰瘍引起,這通常與幽門螺桿菌(helicobacter pylori,HP)感染、非甾體抗炎藥有關。EGVB 是由食管或胃靜脈曲張破裂引起,通常與慢性肝病和(或)門靜脈高壓有關。各病因均涉及多個功能蛋白和代謝通路。本研究發現三黃瀉心湯加味中的141個靶點與UGIB的治療密切相關,篩選得到前10個關鍵活性成分為: 槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素等,并且通過PPI網絡圖分析可知側柏葉、仙鶴草、黃連主要通過ESR1、MYC、TP53 、HIF1A靶點發揮作用。分析可得槲皮素是三黃瀉心湯加味的主要活性成分,存在于側柏葉、仙鶴草、黃連中,研究表明槲皮素[15]可能是通過調節信號通路的活性和基因表達來對人類健康產生影響,槲皮素對神經退行性疾病、肝臟疾病和糖尿病具有有益作用,其中PI3K/Akt 是與槲皮素最相關的途徑。山柰酚[16]通過調節AMPK、NOX4、核因子κB及Notch信號通路起到抗氧化應激、抑制胞外基質積聚、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、增強機體免疫等多種作用。由此可見,三黃瀉心湯加味對治療UGIB的相關活性成分可能是通過多途徑同時調控各信號通路。

分子對接結果顯示關鍵活性成分與核心靶點蛋白的結合能均<-5 kcal/mol,提示其結合比較穩定,證實了三黃瀉心湯加味對治療UGIB的靶向作用。

綜上所述,本研究通過網絡藥理學的方法,初步闡明三黃瀉心湯加味治療UGIB的潛在活性成分、關鍵靶點、關鍵通路,并對主要活性成分和關鍵靶點蛋白進行分子對接,驗證了分析結果。結果提示,三黃瀉心湯加味可通過多靶點、多通路、多方向對UGIB產生治療作用,延緩其進展,關鍵靶點及主要通路可成為未來治療UGIB的方向。