MDR1基因多態性與耐藥結核的相關性研究

魏清雯 王 慧 張文麗 姚 文 萬毅新

1.蘭州大學第二醫院呼吸科，甘肅蘭州 730030；2.蘭州市肺科醫院二病區，甘肅蘭州 730046

耐藥結核在我國已非常多見，且全球感染排列靠前，其治療的成功率為54%[1]，近幾年利福平等一線藥物的耐藥顯著增加[2]。目前其病因研究表明結核分枝桿菌耐藥與其藥物相關酶活性、藥物靶點基因等突變有關[3]。結核分枝桿菌的耐藥機制較為復雜多變，新的抗結核藥物研發緩慢，部分患者無藥可選[4]。感染了結核分枝桿菌（mycobacteria tuberculous，MTB）的人群僅5%～10%發展為結核病[5]，這表明人群中對于結核病的易感性存在明顯的個體差異性。研究表明人群攜帶有白介素-23受體[6]、白介素-17[7]、溶質載體家族11 成員1 基因[8]、人類白細胞抗原基因[9]等可能為結核易感基因，以及近年新出現的雌激素相關受體β 基因[10]等都與結核病的發展存在相關性，其中部分人類白細胞抗原基因研究涉及了耐藥結核易感基因[11]。人體細胞膜上三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白家族參與藥物在細胞內外的轉運，其中之一為多藥耐藥基因1（multidrug resistance gene 1，MDR1）家族，編碼了P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp），其分布在人體多部位細胞膜上，P-gp 參與藥物細胞內外轉運，其在藥物吸收、轉運、分布和清除等方面具有重大意義[12]。MDR1 基因單核苷酸多態性影響P-gp 性能，乙胺丁醇、利福平等藥物又是P-gp 的底物[13]。本研究將MDR1 基 因c.2677G＞T/A（rs2032582）、c.3435C＞T（rs1045642）和c.1236C＞T（rs1128503）位點單核苷酸多態性與國內漢族肺結核患者關系進行進一步研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年10 月至2021 年1 月就診于蘭州市肺科醫院的漢族肺結核患者共97 例，其中藥物敏感肺結核38 例，耐藥型肺結核59 例。耐藥組中男34 例，女25 例，平均年齡（38.78±6.13）歲；藥物敏感組中男20 例，女18 例，平均年齡（40.03±5.85）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05），具有可比性。本研究經過蘭州市肺科醫院醫學倫理委員會同意，入組者均簽署知情同意書。

1.2 入組標準

診斷標準為《肺結核診斷標準（WS 288-2017）》[14]、《耐藥結核病化學治療指南（2019）》[15]；初治肺結核患者：①不規則抗結核治療小于1 個月者；②初次抗結核治療療程未完成者；③未使用過結核藥物的患者。復治肺結核患者：①復發或初治失敗者；②抗結核藥物使用不規律、不合理大于1 個月者。納入標準：肺部影像資料證實有肺內結核病變；結培陽性且鑒定為結核分枝桿菌者；漢族。排除標準：不足16 歲者；合并塵肺、肺癌等患者；有腦膜炎等嚴重合并癥者；合并糖尿病者；正在服用奎尼丁、維拉帕米等屬于P-gp 的競爭性藥物的患者；哺乳期或妊娠期者；正在服用免疫抑制藥物者或有免疫系統的疾病者。

1.3 質量控制

結核菌培養和菌種鑒定由專人負責，嚴格按照結核病實驗室相關規定進行。

1.4 方法

對全血脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）進行提取（北京天根生化科技有限公司的DP349-02），確保每份樣本DNA 濃度不小于10 ng/μl，OD260/OD280=1.7～1.9，編碼DNA樣本并存儲于1.5 ml離心管中，-20℃保存。在NCBI 數據庫中查詢MDR1，由諾賽基因公司完成其引物設計、合成（表1）。

表1 引物序列表

樣本DNA 常溫解凍后，與引物進行聚合酶鏈反應擴增，反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s、59℃退火30 s、72℃延伸1 min，擴增35 個循環，72℃延伸大于10 min，置于冰箱4℃保存。參照標記（DL2000）和樣品各5 μl 放入凝膠膠孔，電壓180 V，電泳分離，紫外燈下對照切下目的條帶膠塊回收（圖1）；融化吸附DNA 后，用滅菌水將其溶解，制得模板。由ABI 3730xl 測序儀進行測序，得峰圖和序列，分析得各位點基因型。

圖1 4 例標本rs1045642 位點凝膠電泳圖

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件對數據進行統計處理，符合正態分布且方差齊性的計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，計數資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 耐藥及分型情況統計

59 例耐藥結核中以耐多藥結核最多，占52.5%，其次為單耐藥、多耐藥、廣泛耐藥，單耐藥中以耐利福平者占到80%，耐異煙肼者占20%；藥物耐藥情況從低到高依次是左氧氟沙星、乙胺丁醇、鏈霉素、異煙肼和利福平。見表2。

表2 耐藥及分型情況統計[n（%）]

2.2 堿基測定結果

chromas 軟件讀判基因型，查找、比對后確認位點堿基峰圖。

2.3 中國漢族人群次等位基因頻率

從數據庫查詢南方漢族和北方漢族人群3 個位點基因頻率，見表3。

表3 中國漢族人群次等位基因頻率

2.4 耐藥組和敏感組基因型Hardy-Weinberg平衡檢驗

對敏感結核組和耐藥結核組rs1045642、rs2032582、rs1128503 位點基因型進行檢驗，差異無統計學意義（P＞ 0.05），見表4。分別將耐乙胺丁醇者、耐利福平者設為病例組，對其敏感者設為對照組，在上述病例組、對照組中進行平衡檢驗，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。

表4 耐藥組和敏感組基因型Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.5 耐藥組和敏感組基因型頻率分布比較

按照藥物敏感結核組、耐藥結核組分別對MDR1 基因上述3 個位點的等位基因、基因型頻率進行比較，耐藥結核組rs2032582 位點AA 基因型、rs1128503 位點AG 基因型頻率明顯高于敏感結核組，經χ2檢驗，差異無統計學意義（P＞ 0.05），見表5。因乙胺丁醇、利福平均為MDR1 的底物，將耐乙胺丁醇者、耐利福平者分別設為病例組，對其敏感者設為對照組，分別經χ2檢驗，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。MDR1 基因多態性可能與漢族人群耐藥結核、利福平耐藥、乙胺丁醇耐藥的易感基因無關。

表5 耐藥組和敏感組基因型頻率分布比較[n（%）]

3 討論

人體內結核分枝桿菌分代謝狀態活躍、半靜止狀態和休眠狀態，藥物對不同菌群的作用各異，初治采用聯合治療并全程督導化療，通過聯合用藥防止耐藥結核產生。不規律使用藥物、藥物中斷是耐藥結核發生的一部分機制。耐藥結核社會危害大，個體預后差，全療程費用高昂。2012 年的流調報告中結核初治耐藥率為42.7%，復治結核患者的耐藥率為38.5%[16]。而在2002 年的流調報告中初治耐藥率僅為18.6%[17]。十年間初治結核耐藥率明顯升高，說明耐藥結核在人群間的傳播明顯增多。耐藥結核的防控，需要更多可選的抗結核藥物，但十年間僅有兩種抗結核新藥上市，且均已出現其耐藥病例，進一步加大了耐藥結核的控制難度。從上述數據中可看出，復治結核患者中耐藥結核達93.1%（27/29），復治患者中耐藥比例明顯高，但仍有一定比例患者復治而不耐藥達6.9%（2/29），表明復治不是耐藥結核的唯一因素，所以人群對于耐藥結核的易感性研究成為熱點。

MDR1 基因突變可影響藥物的藥效學或藥代動 力 學[18]。一 研 究 發 現MDR1 的c.1236C＞T 基因多態性與結核耐藥有關[19]，另一研究發現其c.2677G＞A 多態性與耐藥結核相關[20]。本研究對MDR1 基因多態性與中國漢族結核耐藥的關系進行探討。

本研究選取MDR1 基因rs1045642[A/C/G/T]、rs2032582[A/C/T]和rs1128503[A/G]位點進行研究，檢測其基因單核苷酸多態性，通過Hardy-Weinberg平衡檢驗后，分別比較耐藥結核組與藥物敏感組、乙胺丁醇耐藥組與乙胺丁醇敏感組、利福平耐藥組與利福平敏感組間上述3 個位點的基因型和等位基因頻率，耐藥結核組rs2032582 位點AA 基因型、rs1128503 位點AG 基因型頻率明顯高于敏感結核組，經比較差異無統計學意義（P＞ 0.05），結果與上述研究結論不完全相同。本研究與其不同之處在于選擇了中國的漢族人群，研究表明MDR1 基因單核苷酸多態性可能與漢族人群患耐藥結核、乙胺丁醇耐藥結核、利福平耐藥結核的易感基因無關。本研究不足之處在于入選病例數少，希望將來有更多致力于耐藥結核機制的研究，以更好地防控耐藥結核。