腸道菌群易位與老年糖尿病患者發(fā)生主要不良心血管事件的關(guān)系研究

陸水英，湯之明，陳力行，劉琳

糖尿病是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素，而心血管疾病是老年糖尿病患者最常見的死亡原因［1］。因此，闡明老年糖尿病患者發(fā)生心血管事件的病理生理學(xué)機(jī)制及尋找新的生物標(biāo)志物或靶點(diǎn)十分必要。研究表明，腸道微生物群可參與慢性病（如炎癥性腸病、肝硬化、關(guān)節(jié)炎和2型糖尿病）的發(fā)生發(fā)展［2］，如紊亂的腸道微生物群與大鼠心肌梗死易感性有關(guān)［3］。此外，從腸腔逸出的微生物代謝產(chǎn)物三甲胺N-氧化物（trimethylamine N-oxide，TMAO）進(jìn)入體循環(huán)后可通過觸發(fā)單核細(xì)胞募集而激活免疫炎癥反應(yīng)［4］。但少有研究探討腸道菌群及其代謝產(chǎn)物在糖尿病心血管事件中的作用。本研究假設(shè)糖尿病導(dǎo)致機(jī)體腸道屏障功能衰竭和腸道黏膜通透性增加，促使腸道細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物易位進(jìn)入全身循環(huán)，從而過度激活免疫炎癥反應(yīng)并增加患者心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。為此，本研究招募了50例健康對照者和100例老年糖尿病患者，通過宏基因組測序分析其全身微生物組，進(jìn)而分析腸道菌群易位與老年糖尿病患者發(fā)生主要不良心血管事件（major adverse cardiac events，MACE）的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019年1月至2021年1月在肇慶市第一人民醫(yī)院治療的100例老年糖尿病患者作為研究對象，其均接受至少6個(gè)月的降血糖治療。根據(jù)隨訪期間患者是否發(fā)生MACE將其分為MACE（+）組23例和MACE（-）組77例。另選取同期在肇慶市第一人民醫(yī)院接受健康體檢的非糖尿病者50例作為對照組。本研究經(jīng)肇慶市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過（倫審2018-055-03），所有受試者簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥65歲；（2）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并腫瘤等嚴(yán)重疾病或嚴(yán)重外傷者。

1.3 觀察指標(biāo) （1）全身微生物組多樣性指標(biāo)。使用十六烷基三甲基溴化銨法從三組受試者血液樣本中提取基因組DNA，然后將基因組DNA稀釋至1 ng/μl作為模板，以16 S V4區(qū)域作為靶標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTCHVGGGTWTCTAAT-3'）。使用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix進(jìn)行PCR，通過Thermo Scientific試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。使用Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒構(gòu)建DNA文庫，并進(jìn)行Qubit定量和文庫測試，然后使用Ion S5TM或Ion S5TMXL測序平臺進(jìn)行測序。使用Cutadapt V1.9.1軟件獲得原始數(shù)據(jù)，然后再進(jìn)行質(zhì)控過濾以獲得有效數(shù)據(jù)。使用UPARSE軟件對所有有效堿基進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析。采用QIIME 1.9.1軟件計(jì)算血液樣本的OUT總數(shù)和香農(nóng)指數(shù)，使用R軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析以挖掘三組受試者血液細(xì)菌特征的差異。（2）血漿腸道菌群百分比。記錄三組受試者血漿腸道菌群百分比。（3）收集MACE（+）組和MACE（-）組患者臨床資料、實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)及左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricle ejection fraction，LVEF），其中臨床資料包括性別、年齡、BMI、吸煙情況、高血壓發(fā)生情況及用藥情況，實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)包括空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、估算腎小球?yàn)V過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）、超敏C反應(yīng)蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）、CD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)及血漿TMAO、D-乳酸。并計(jì)算ΔCD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、ΔTMAO、ΔD-乳酸，以反映CD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、TMAO、D-乳酸變化情況，ΔCD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)=CD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)病第2天-CD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)病第1天，ΔTMAO=TMAO發(fā)病第2天-TMAO發(fā)病第1天，ΔD-乳酸=D-乳酸發(fā)病第2天-D-乳酸發(fā)病第1天。然后基于ΔTMAO和ΔD-乳酸構(gòu)建一個(gè)新的變量——Z評分，首先計(jì)算ΔTMAO和ΔD-乳酸的Z分?jǐn)?shù)，計(jì)算公式：Z分?jǐn)?shù) = （x-μ）/σ，其中x為需要標(biāo)準(zhǔn)化的原始分?jǐn)?shù)，μ為平均值，σ為標(biāo)準(zhǔn)偏差，然后將ΔTMAO和ΔD-乳酸Z分?jǐn)?shù)的平均值作為Z評分。

1.4 隨訪 所有患者進(jìn)行電話隨訪和門診隨訪，主要終點(diǎn)事件為MACE（包括急性非致死性心肌梗死、急性缺血性腦卒中、心源性死亡及血運(yùn)重建），隨訪截止時(shí)間為2022年3月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；ΔTMAO、ΔD-乳酸與ΔCD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析；老年糖尿病患者發(fā)生MACE的影響因素分析采用多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，繪制ROC曲線以評估ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z評分及Z評分+hs-CRP+CD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)對老年糖尿病患者發(fā)生MACE的預(yù)測價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組、MACE（-）組及MACE（+）組全身微生物組多樣性指標(biāo)和血漿腸道菌群百分比 對照組、MACE（-）組及MACE（+）組OTU總數(shù)、香農(nóng)指數(shù)及血漿腸道菌群百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MACE（+）組OTU總數(shù)、香農(nóng)指數(shù)及血漿腸道菌群百分比均高于對照組和MACE（-）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示，MACE（+）組血液細(xì)菌特征與對照組或MACE（-）組明顯分開（P值均 ＜ 0.001），見圖1。

圖1 三組血液細(xì)菌特征的主坐標(biāo)分析結(jié)果Figure 1 Results of principal coordinate analysis of three groups of blood bacterial characteristics

表1 對照組、MACE（-）組及MACE（+）組OTU總數(shù)、香農(nóng)指數(shù)及血漿腸道菌群百分比比較（±s）Table 1 Comparison of total number of OTU，Shannon index and percentage of plasma intestinal flora in control group，MACE（-）group and MACE（+）group

表1 對照組、MACE（-）組及MACE（+）組OTU總數(shù)、香農(nóng)指數(shù)及血漿腸道菌群百分比比較（±s）Table 1 Comparison of total number of OTU，Shannon index and percentage of plasma intestinal flora in control group，MACE（-）group and MACE（+）group

注：MACE=主要不良心血管事件，OTU=操作分類單元；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與MACE（-）組比較，P＜0.05

組別例數(shù)OTU總數(shù)香農(nóng)指數(shù)血漿腸道菌群百分比（%）對照組501 488±1042.62±0.268.26±0.54 MACE（-）組771 105±1322.41±0.228.42±0.35 MACE（+）組231 587±140ab3.26±0.28ab10.77±0.61ab F值3.1463.3154.035 P值0.0290.0200.005

2.2 MACE（-）組和MACE（+）組臨床資料、實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)及LVEF比較 MACE（-）組和MACE（+）組女性占比、年齡、BMI、吸煙率、高血壓發(fā)生率、空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、eGFR及胰島素、口服降糖藥、阿司匹林、他汀類藥物、鈣通道阻滯劑、ACEI/ARB使用率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MACE（+）組hs-CRP、CD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、TMAO、D-乳酸、ΔCD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、ΔTMAO、ΔD-乳酸及Z評分高于MACE（-）組，LVEF低于MACE（-）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 MACE（-）組和MACE（+）組臨床資料、實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)及LVEF比較Table 2 Comparison of clinical data，laboratory examination indexes and LVEF between MACE（-）group and MACE（+）group

2.3 老年糖尿病患者發(fā)生MACE影響因素的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析 將老年糖尿病患者是否發(fā)生MACE（賦值：否=0，是=1）作為因變量，排除存在多重共線性的指標(biāo)后，將hs-CRP（賦值：＞2.64 mg/L=1，≤2.64 mg/L=0）、CD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)（賦值：＞25.8細(xì)胞/μl=1，≤25.8細(xì)胞/μl=0）、Z評分（賦值：＞0.71=1，≤0.71=0）、LVEF（賦值：＞50%=0，≤50%=1）作為自變量，采用向前逐步選擇法，進(jìn)行多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，結(jié)果顯示，hs-CRP、CD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、Z評分是老年糖尿病患者發(fā)生MACE的獨(dú)立影響因素（P＜0.05），見表3。

表3 老年糖尿病患者發(fā)生MACE影響因素的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析Table 3 Multivariate Cox proportional hazard regression analysis of influencing factors of MACE in elderly patients with diabetic mellitus

2.4 ROC曲線 ROC曲線分析結(jié)果顯示，ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z評分、Z評分+hs-CRP+CD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)預(yù)測老年糖尿病患者發(fā)生MACE的AUC分別為0.647〔95%CI（0.533，0.761）〕、0.630〔95%CI（0.527，0.725）、0.681〔95%CI（0.567，0.794）、0.822〔95%CI（0.738，0.906），見表4。

表4 ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z評分及Z評分+hs-CRP+CD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)對老年糖尿病患者發(fā)生MACE的預(yù)測價(jià)值Table 4 Predictive value of ΔTMAO，ΔD-lactic acid，Z score and Z score+hs-CRP+CD14+CD16+ monocyte count for MACE in elderly patients with diabetic mellitus

2.5 相關(guān)性分析 Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，ΔTMAO與老年糖尿病患者ΔCD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)（rs=0.200，P=0.047）；ΔD-乳酸與老年糖尿病患者ΔCD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)無直線相關(guān)關(guān)系（rs=0.119，P＞0.05）。ΔTMAO和ΔD-乳酸與MACE（+）組患者ΔCD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)（rs值分別為 0.322、0.290，P值分別為0.028、0.048）。

3 討論

研究表明，約有1012種細(xì)菌定植在人類胃腸道，其中機(jī)會(huì)性病原體有109種［5］。本研究結(jié)果顯示，MACE（+）組OTU總數(shù)、香農(nóng)指數(shù)及血漿腸道菌群百分比均高于對照組和MACE（-）組；主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示，MACE（+）組血液細(xì)菌特征與對照組或MACE（-）組明顯分開，提示發(fā)生MACE的老年糖尿病患者全身微生物組與未發(fā)生MACE的老年糖尿病患者和對照者不同，其主要表現(xiàn)為全身微生物組多樣性增加，而腸道菌群可能是導(dǎo)致全身微生物組多樣性增加的主要原因。

TMAO和D-乳酸是腸道菌群的代謝產(chǎn)物，二者均被認(rèn)為是腸道菌群易位和腸道黏膜通透性增加的標(biāo)志物［6］。臨床研究表明，TMAO與糖尿病患者發(fā)生心血管并發(fā)癥有關(guān)［7］。在糖尿病患者中，TMAO是其發(fā)生心血管事件的重要標(biāo)志物［8］。此外，TMAO水平升高的糖尿病患者心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)和主要心臟事件發(fā)生率升高［9］。血漿TMAO水平升高與舒張功能障礙發(fā)生率和死亡率增加有關(guān)［10］。本研究結(jié)果顯示，MACE（+）組TMAO、ΔTMAO高于MACE（-）組。D-乳酸是腸道屏障喪失和腸道黏膜通透性增加的標(biāo)志物［11］。本研究結(jié)果顯示，MACE（+）組D-乳酸和ΔD-乳酸高于MACE（-）組；多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果顯示，hs-CRP、CD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、Z評分是老年糖尿病患者發(fā)生MACE的獨(dú)立影響因素，提示腸道菌群易位是老年糖尿病患者發(fā)生MACE的影響因素。

ROC曲線分析結(jié)果顯示，ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z評分、Z評分+hs-CRP+CD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)預(yù)測老年糖尿病患者發(fā)生MACE的AUC分別為0.647、0.630、0.681、0.822，提示與ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z評分單獨(dú)預(yù)測相比，Z評分+hs-CRP+CD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)預(yù)測老年糖尿病患者發(fā)生MACE的價(jià)值較高，腸道菌群易位進(jìn)入全身循環(huán)可能是誘導(dǎo)老年糖尿病患者發(fā)生MACE的主要原因之一。

本研究結(jié)果顯示，ΔTMAO與老年糖尿病患者ΔCD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，ΔTMAO和ΔD-乳酸與MACE（+）組患者ΔCD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)。推測腸道菌群代謝產(chǎn)物在體循環(huán)中的積累會(huì)觸發(fā)單核細(xì)胞的募集，從而激活全身炎癥反應(yīng)并最終導(dǎo)致心臟損傷［12］。研究表明，采用TMAO等腸道菌群代謝產(chǎn)物刺激單核細(xì)胞亞群可產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子TNF-α，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)［13］。這種腸道菌群的驅(qū)動(dòng)作用也得到了既往研究的支持，即腸道菌群可以通過調(diào)節(jié)造血功能而直接影響先天免疫細(xì)胞的發(fā)育［14］。有證據(jù)表明，人骨髓含有CD14+CD16+單核細(xì)胞庫［15］，表明MACE發(fā)生后血液循環(huán)中的CD14+CD16+單核細(xì)胞可能直接從骨髓或脾臟庫中調(diào)動(dòng)。

綜上所述，發(fā)生MACE的老年糖尿病患者全身微生物組多樣性增加，腸道菌群易位是老年糖尿病患者發(fā)生MACE的影響因素；且與ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z評分單獨(dú)預(yù)測相比，Z評分+hs-CRP+CD14+CD16+單核細(xì)胞計(jì)數(shù)預(yù)測老年糖尿病患者發(fā)生MACE的價(jià)值較高。但本研究樣本量有限，可能影響結(jié)果的可信度。未來仍需通過前瞻性、大樣本量研究進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果。

作者貢獻(xiàn)：陸水英進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，結(jié)果分析與解釋，負(fù)責(zé)撰寫、修訂論文；劉琳進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；陳力行進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；湯之明負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。