發根農桿菌介導的閩楠遺傳轉化體系構建與優化

吳夢潔 洪家都 李芳燕 周生財 林二培 程龍軍，*

（1浙江農林大學林業與生物技術學院/亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300；2麗水職業技術學院，浙江 麗水 323000）

閩楠屬于樟科（Lauraceae）楠屬（Phoebe）植物，是我國重要的珍貴樹種［1］。閩楠的木材材質堅韌，是上等建筑和家具的優良木材原料［2］；同時，其樹體高大通直，枝繁葉茂，樹形優美，是優良的園林綠化樹種。但由于氣候環境變化和人為砍伐等因素，閩楠資源大量減少，目前僅在江西、福建、浙江、廣東、廣西、湖南、湖北和貴州呈零星分布［3］，被列為國家二級珍稀漸危種［4］。

隨著國家對珍貴樹種種質資源保護和栽培利用的重視，楠木人工培育及應用推廣已進入快速發展階段。生產中對楠木優良品種的需求也越來越大，但木本植物傳統育種方式周期較長，應用現代分子輔助育種技術成為了突破傳統林木育種瓶頸的一個重要手段［5］。目前，楠木中的閩楠基因組測序已經完成，其研究開始邁入分子生物學水平［6］。但閩楠尚未建立完善的遺傳轉化體系，限制了其重要經濟性狀相關的遺傳研究。建立一套穩定的遺傳轉化體系對楠木的遺傳研究和育種工作具有重要意義。

發根農桿菌（Agrobacteriumrhizogenes）是一類宿主范圍廣泛的革蘭氏陰性菌，屬根瘤菌科（Rhizobiaceae）農桿菌屬（Agrobacterium）。其Ri 質粒上的T-DNA 片段能在植物基因組中插入、整合并表達，誘導植物產生轉基因毛狀根［7］，是植物遺傳轉化的一種重要手段［8］。發根農桿菌誘導產生的毛狀根具有生長速度快，生理生化和遺傳性穩定等優點［9］，遺傳轉化后的毛狀根可以進行植物基因功能和次生代謝等方面的研究［10-11］，目前該技術已在多個物種中得到應用［12-13］。一些植物甚至可以在發根基礎上進行植株再生，獲得完整轉基因植株，如棉花（Gossypiumhirsutum）［14］、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）［15］、紫花苜蓿（MedicagosativaL.）［16］等，從而實現培育和創制新種質。

基于此，本研究利用非組培依賴的發根農桿菌誘導轉化，通過研究侵染方法、農桿菌菌株、菌液濃度和植株苗齡對閩楠毛狀根誘導率和遺傳轉化率的影響，建立并優化閩楠的遺傳轉化體系，以期為閩楠分子水平上的遺傳研究提供良好的技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

閩楠種子采集自浙江省慶元縣實驗林場楠木種子園。K599、C58C1、MSU440 菌株購自上海唯地生物技術有限公司。pCAMBIA1300-GFP 載體保存于浙江農林大學國家重點實驗室超低溫冰箱。閩楠幼苗培養于MC1000 微氣候控制生長箱（Snijders，荷蘭），基質成分體積占比為：50%泥炭土（1～10 mm），25%珍珠巖（3～6 mm），25%蛭石（1～3 mm）。

1.2 閩楠種子儲存

將采集的成熟閩楠果實去掉果皮，清洗干凈，陽光下晾曬至表面無水分附著。按重量比1∶5 的比例，將種子與干凈濕河沙（濕度約為60%）混合均勻裝入網紗袋，放入帶蓋泡沫箱，并用保鮮膜封好，4 ℃冰箱冷藏。每兩周打開泡沫箱檢查河沙濕度，噴壺噴灑適量水進行保濕，盡量保持濕度與初始沙藏時一致。沙藏時間為3個月。

1.3 閩楠種子播種與幼苗培養

閩楠種子播種于濕度為70%的濕河沙中，播種深度1 cm左右，播種后噴水濕潤，在盆上方覆蓋保鮮膜進行保濕，育苗盆置于濕度70%、溫度26 ℃/22 ℃（晝/夜）、光照16 h/黑暗8 h、光照強度為50 μmol·m-2·s-1的培養箱中，每2 d 噴灑適量水，保證種子萌發和幼苗生長過程的水分和濕度。

1.4 發根農桿菌轉化

從超低溫冰箱中取出K599、C58C1 和MSU440 的發根農桿菌感受態于冰上融化，每100 μL 感受態加入1 μg以pCAMBIA1300為骨架含35S∶GFP的載體質粒，吹打混勻后依次置于冰上靜置5 min，液氮5 min，37 ℃水浴5 min，冰浴5 min。冰浴后加入700 μL 無抗生素的Luria-Bertani（LB）液體培養基，28 ℃振蕩培養2 h，6 000 r·min-1離心1 min，留取100 μL左右的上清并輕輕吹打混勻菌液，涂布于含50 mg·L-1鏈霉素和50 mg·L-1卡那霉素的固體LB 平板（LB 液體培養基加15 mg·L-1瓊脂），28 ℃倒置培養2～3 d。挑取單克隆于600 μL 含50 mg·L-1鏈霉素和50 mg·L-1卡那霉素的液體LB 培養基中，28 ℃ 200 r·min-1振蕩培養過夜。第2 天進行菌液PCR，鑒定結果正確后，吸取500 μL 菌液加500 μL 50%甘油，保存于-80 ℃冰箱。

1.5 侵染液制備

從-80℃冰箱中取出已轉化的發根農桿菌菌液，在含鏈霉素和卡那霉素的固體LB平板上劃線活化，28 ℃倒置培養2～3 d。挑取單克隆于10 mL 含50 mg·L-1鏈霉素和50 mg·L-1卡那霉素的液體LB 培養基中，28 ℃下200 r·min-1振蕩培養14 h，然后吸取200 μL加入到50 mL含鏈霉素和卡那霉素的液體LB培養基，28 ℃ 200 r·min-1振蕩培養至菌液濃度［以光密度（optical density，OD）表示］OD600=0.8，將培養好的菌液于室溫下4 722×g離心10 min，倒掉上清，加入等體積重懸液：10 mmol·L-1MgCl2，100 mmol·L-1乙酰丁香酮（acetosyringone，AS），2-嗎啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulf-onic acid，MES）調pH值至5.2，制備成侵染液。

1.6 閩楠植株的遺傳轉化

1.6.1 侵染方法選擇 （1）注射法：用5 mL 注射器抽取侵染液注射到幼苗種子上方0～1 cm 處的上胚軸部分，每株注射5 個部位。（2）菌液浸泡法：用注射器或細針扎幼苗種子上方0～1 cm 的上胚軸部分5 處，隨后將侵染部位及根完全浸入侵染液中，真空抽氣5 min，結束后取出用紙吸干多余菌液。兩種處理的材料為二葉期的閩楠幼苗，菌株為K599，菌液濃度OD600=0.8。

1.6.2 共培養及毛狀根誘導 侵染后把幼苗移栽到已吸滿水的基質中，侵染部位要被基質覆蓋，并蓋上育苗盤的透明保濕塑料罩，在溫度26 ℃/22 ℃（晝/夜）、濕度70%、黑暗條件下共培養2 d。共培養后進行毛狀根的誘導培養，條件為溫度26 ℃/22 ℃（晝/夜）、光照16 h/黑暗8 h、光照強度50 μmol·m-2·s-1。誘導期間，全程用育苗盤的透明保濕塑料罩覆蓋進行保濕，培養一周后可打開罩子的通氣孔，誘導培養45 d。誘導期間，每周澆灌促根營養液一次，促根營養液為1/4 Hoagland’s營養液基礎上添加0.1 mg·L-1的1-萘乙酸（naphaleneacetic acid，NAA），以基質充分吸收營養液為標準，育苗盤中不留多余水分。

1.6.3 毛狀根和轉基因根的鑒定及統計分析 計數成功誘導毛狀根的植株，用LUYOR-3415 型便攜式熒光蛋白激發光源（LUYOR，美國）篩選含有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）熒光的植株，并在SZX7熒光體視顯微鏡（奧林巴斯，日本）下觀察、拍照。提取轉基因根和未進行遺傳轉化根的DNA，以GFP基因為目標基因進行PCR驗證。

根據載體序列合成GFP引物：上游引物（5′→3′）：TTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACT；下游引物（5′→3′）：TCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA。分子水平驗證中，PCR 反應體系共25 μL：1.1×T3 PCR Mix（TSE030，北京擎科）22 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板1 μL。PCR 反應程序為：98 ℃預變性3 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，35 個循環；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。對PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳，有大小正確（720 bp）的目的條帶即為陽性植株。誘導率和轉化率計算公式如下：

誘導率=(毛狀根植株數/侵染植株數) × 100%；

轉化率=(陽性植株數/侵染植株數) × 100%。

1.6.4 閩楠轉基因植株培養 將轉基因植株轉移到1/4 Hoagland’s 營養液進行水培，或在基質中繼續培養，每周澆灌促根營養液1 次。轉基因根系發育充分后去除非轉化的根系，繼續培養得到具轉基因毛狀根系的閩楠植株。

1.7 閩楠遺傳轉化體系的優化

根據試驗過程中可能影響轉化率情況的觀察，對轉化體系進行優化，針對菌株種類、菌液濃度和苗齡（苗齡分為一葉期、二葉期、三葉期，三個時期對應的時間分別為播種后40、45、50 d）開展三因素三水平的正交試驗（表1），設計L9（33）正交試驗表（表2），每個處理20 株苗，侵染方法采用注射法。對試驗結果進行統計，并利用SPSS 16.0 軟件進行極差分析和方差分析，篩選出影響閩楠遺傳轉化的關鍵因素，從而優化遺傳轉化體系。

表2 三因素三水平正交試驗設計表Table 2 Three factors and three levels of orthogonal experimental design table

1.8 不同光照強度對閩楠遺傳轉化體系的影響

根據閩楠幼苗生長環境及生長狀態的觀察，針對幼苗培養條件和遺傳轉化過程中的光照強度，對幼苗的管理條件進行優化。設置對照組的光強為50 μmol·m-2·s-1，處理組的光強為100 μmol·m-2·s-1。其他試驗條件相同，均采用菌液濃度OD600=0.8 的K599菌株，注射法侵染苗齡為三葉期的閩楠幼苗。

1.9 數據處理

利用SPSS 16.0 軟件對試驗數據進行處理。并進行極差分析和方差分析，P<0.05為顯著水平。

2 結果與分析

2.1 不同侵染方法對閩楠幼苗毛狀根誘導和轉化的影響

采用注射和菌液浸泡兩種侵染方法對二葉期閩楠幼苗進行侵染，發現兩種方法均能誘導產生毛狀根。注射法的毛狀根誘導率為80.0%，遺傳轉化率為66.7%；菌液浸泡法的誘導率為41.2%，轉化率為35.5%。結果表明，注射法的誘導率和轉化效率均較菌液浸泡法更高。因此在后續試驗中均采用注射法。

2.2 閩楠遺傳轉化體系的建立與優化

利用一葉期、二葉期和三葉期的閩楠實生苗進行菌株種類、菌液濃度、苗齡的正交試驗，以期得到閩楠最優遺傳轉化條件。正交試驗各處理的誘導率和轉化率如表3。其中誘導率最高為87.5%，其處理條件為K599菌株、菌液濃度0.8、苗齡為三葉期。轉化效率最高為70.6%，其處理條件為K599 菌株、菌液濃度1.2、苗齡為二葉期。

表3 正交試驗結果Table 3 Orthogonal test result

對各處理的誘導率和轉化率進行極差分析，由極差值（表4）可知，各因素對閩楠毛狀根誘導率和遺傳轉化率的影響表現為菌株種類>苗齡>菌液濃度。菌株種類中，三個菌株在三個水平下誘導率的均值大小為：MSU440（80.5%）>K599（75.7%）>C58C1（46.4%）。三個菌株在三個水平下轉化率的均值大小為：K599（60.5%）>MSU440（20.6%）>C58C1（1.75%）。MSU440和K599 的誘導率較高，但K599 的轉化率均值明顯高于MSU440。在菌液濃度的三個水平中，菌液濃度為0.8的誘導率均值最大，菌液濃度為1.2的轉化率均值最大。苗齡為二葉期和三葉期的誘導率和轉化率均值相近且大于一葉期。

表4 正交試驗結果的極差分析Table 4 Range analysis of orthogonal test results

進一步進行方差分析發現（表5、6），菌株種類對毛狀根誘導率和遺傳轉化率影響最大且達到顯著水平（P<0.05），苗齡和菌液濃度對誘導率和轉化率的影響不顯著。根據對正交試驗的極差分析結果可得，誘導率高的最佳處理條件為：MSU440 菌株、菌液濃度OD600=0.8、苗齡為二葉期；轉化率高的最佳處理條件為：K599菌株、菌液濃度OD600=1.2、苗齡為三葉期。

表5 菌種、菌液濃度和苗齡對誘導率的方差分析Table 5 Variance analysis of strain types、bacterial solution concentration and seedling stage on induction efficiency

表6 菌種、菌液濃度和苗齡對轉化率的方差分析Table 6 Variance analysis of strain types、bacterial solution concentration and seedling stage on transformation efficiency

2.3 閩楠轉基因毛狀根的鑒定

先通過便攜式熒光蛋白激發光源對轉基因毛狀根進行篩選，有綠色熒光信號的毛狀根進一步利用熒光體視顯微鏡進行觀察。結果表明，成功被發根農桿菌誘導、轉化的毛狀根能被激發出明顯的GFP 熒光信號（圖1-A、B）。提取毛狀根DNA 進行分子鑒定，利用GFP 特異引物對DNA 進行擴增，轉基因毛狀根提取的DNA 能擴增出GFP 基因特異產物，而未轉化植株的根DNA無法擴增出GFP特異產物（圖1-C）。將轉化成功的植株進行培養，即可獲得生長正常的含轉基因毛狀根的閩楠植株（圖1-D、E）。

2.4 不同光照強度對閩楠遺傳轉化的影響

由于較強的光照會阻礙閩楠幼苗的生長，為了進一步探討不同光照強度對發根農桿菌介導的閩楠幼苗遺傳轉化是否有影響，在不同光強下分別進行閩楠的遺傳轉化試驗。結果表明，較強光照（100 μmol·m-2·s-1）處理組植株的生長狀態與弱光強（50 μmol·m-2·s-1）處理的植株相比生長緩慢，植株矮小（圖2）。同時，毛狀根的誘導率、遺傳轉化率都更低（表7）。弱光強處理的閩楠幼苗生長良好，侵染后毛狀根的誘導率達78.9%，遠高于強光處理組的45.0%；轉化率為68.4%，高于強光處理的25.0%。說明光照條件對發根農桿菌介導的閩楠幼苗遺傳轉化非常重要。

圖2 不同光照強度下發根農桿菌轉化的閩楠幼苗生長狀況Fig.2 Growth of P. bournei transgenic seedlings mediated by A. rhizogenes under high and low light intensity

表7 不同光照強度處理的閩楠轉化結果Table 7 The transformation results of P. bournei under different light intensity

3 討論

農桿菌介導的遺傳轉化是植物中占主導地位的轉基因方法，包括根癌農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）Ti 質粒轉化和發根農桿菌Ri 質粒轉化。根癌農桿菌介導的遺傳轉化一般需要通過對植物愈傷組織的誘導、侵染轉化，進而再生以獲得轉化植株［17］。但大部分木本植物遺傳復雜，次生代謝物含量較多，如茶樹中的多酚類物質是影響農桿菌生長和植物轉化的關鍵化學成分［18］，通過組培再生的方式利用根癌農桿菌進行轉化比較困難。而發根農桿菌介導的遺傳轉化可通過直接侵染植物組織的方式誘導轉基因毛狀根的產生，進而在此基礎上直接進行相關的遺傳研究，或者通過毛狀根的再生獲得完整轉基因植株，因此在木本植物上較根癌農桿菌更容易實現植株的遺傳轉化［19］。目前在茶樹［20］、棗樹（Ziziphusjujuba）［21］、光皮樺（Betula luminifera）［22］、橡膠樹［23］上都已有成功的案例。閩楠同樣存在組培再生困難的問題，目前尚鮮有根癌農桿菌介導成功轉化的報道。因此，本研究構建了發根農桿菌介導的閩楠遺傳轉化體系，具體轉化過程如圖3所示。

圖3 閩楠遺傳轉化過程Fig.3 Genetic transformation process of P. bournei

在發根農桿菌介導的遺傳轉化中，侵染部位和侵染方式是影響誘導和轉化的一個重要因子［24］，所以本研究選擇上胚軸處作為侵染位置，比較了注射和菌液浸泡兩種不同的侵染方法對毛狀根誘導和轉化效率的影響。結果表明注射法毛狀根的誘導率和轉化率更高，因此，后續正交試驗均采用注射法進行。

進行侵染的菌株種類、菌液濃度和侵染植株苗齡等同樣是影響發根農桿菌轉化效率的重要因素［25-26］。本研究利用正交試驗研究上述因素對閩楠毛狀根誘導率和遺傳轉化率的影響，結果表明菌株種類對誘導率和轉化率的影響都達到顯著水平，說明閩楠對菌株的選擇性比較強。根據Ri 質粒合成冠癭堿（opine）的不同，可將其分為4 種類型：甘露堿型（mannopine type）、黃瓜堿型（cucumopine type）、農桿堿型（agropine type）、米奇矛型（mikimopine type）［10］。本研究使用的菌株為K599、C58C1、MSU440，其中C58C1、MSU440 含農桿堿型Ri 質粒，K599 含黃瓜堿型Ri 質粒［10］。K599 的轉化率優于MSU440 和C58C1，推測其差異可能由菌株所含Ri質粒不同所致。K599對閩楠的轉化率最高，推測黃瓜堿型Ri 質粒能促進閩楠毛狀根的轉化。其他植物中也有類似現象，如木豆（Cajanuscajan）［19］、薄殼山核桃（Caryaillinoinensis）［24］、檸條（Caraganaintermedia）［27］等木本植物的最優轉化菌株也是K599。但在尾巨桉（Eucalyptusurophylla×E.grandis）中，無論以葉片還是莖段為外植體時，K599 都無法誘導毛狀根產生［28］，說明不同物種對菌株的選擇性存在差異。MSU440 的轉化率雖然低于K599，但其誘導率更高，這為以促進生根為主要目的的物種提供了很好的選擇途徑，在尾巨桉［28］、柑橘（Citrussinensis）［29］等木本植物中，MSU440也是誘導生根的最優菌株，暗示MSU440 在誘導生根方面可能優于其他菌株。

雖然菌液濃度對毛狀根誘導率和遺傳轉化率的影響未達到顯著水平，但其不同水平仍對毛狀根誘導率和遺傳轉化率產生了不同的影響。極差分析結果表明，菌液濃度OD6000.8和1.2分別為誘導率和轉化率最高的水平，可見閩楠遺傳轉化的最適菌液濃度高于毛狀根誘導最佳的菌液濃度。其他木本植物中，沾化冬棗［30］在OD600為0.6～0.8 之間的轉化率最高，薄殼山核桃［24］在OD600=0.8 時的誘導率最高；而尾巨桉［28］和木豆［19］均在OD600=0.3時的誘導率最高，這表明不同木本植物轉化的最適菌液濃度不同，物種間差異較大。

閩楠苗齡差異也會使誘導率和轉化率存在不同，如本研究發現二葉期和三葉期的閩楠幼苗轉化率和誘導率高于一葉期。在非組培依賴的遺傳體系中，薄殼山核桃［24］在子葉期，即兩片子葉展開而真葉未露頭時的誘導率更高，與本試驗中閩楠的二葉期相近，一般認為較為幼嫩的植株，因其細胞分裂旺盛更有利于接受外源基因［9］。由此可知，植株的發育階段對發根農桿菌介導的轉化也至關重要。對于閩楠而言，選擇二葉期和三葉期植株進行轉化能夠達到較高的轉化效率。

田肖簫等［31］發現，強光對閩楠幼苗生長產生脅迫，全光照下幼苗的生長和生理生化受到明顯抑制，而較弱光強（全光照的40%～55%）更適宜幼苗生長。本研究同樣發現，轉化后在較弱的光強條件下培養植株，會使毛狀根的誘導率和轉化率較高光強更好。說明閩楠幼苗期的光照條件在一定程度上會影響發根農桿菌介導的轉化效率。

本研究中采用的非組培依賴的發根農桿菌介導閩楠幼苗轉化，轉化效率高且穩定。而且，相比利用組培方式進行的發根農桿菌介導轉化，資源成本和時間成本的投入都大大降低。該閩楠遺傳轉化體系的建立為閩楠分子遺傳學方面的研究、閩楠關鍵性狀相關基因資源挖掘以及新種質創建和品種遺傳改良都奠定了良好的基礎。

4 結論

本研究建立了非組培依賴的發根農桿菌介導的閩楠遺傳轉化體系，該體系穩定且毛狀根誘導率和遺傳轉化率高。此外，本研究發現注射法的轉化效果優于菌液浸泡法。影響發根農桿菌侵染閩楠轉化效率的主要因素為菌株種類。該體系的最優組合為：菌液濃度OD600=1.2 的K599 菌株注射法侵染三葉期的閩楠幼苗。在閩楠幼苗的管理中，較弱的光照強度更有利于閩楠幼苗的生長和遺傳轉化。