VEGF及其相關低氧因子在不同發育階段牦牛腎臟中的表達分布研究

周熳琳 董仕慧 張伊陽 李 睿 楊映雪 柴雅靜 喬自林 楊 琨，*

（1西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2西北民族大學生物醫學研究中心甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅 蘭州 730030；3西北民族大學生物醫學研究中心生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

牦牛（Bosgrunniens）是高原地區的特有牛種，具有耐低氧、低溫和強紫外輻射的特點［1］。由于牦牛具有與低氧適應的解剖特征和生理特征的多種器官，如較大的心和肺、較厚的體表覆蓋物和無功能的汗腺，使其能夠適應高海拔低氧環境［2-3］。腎臟在諸多臟器中更易受到缺氧影響，這是由于缺氧條件下氧氣在腎血管和動脈血管之間擴散分流，引起腎髓質的供氧量降低，同時腎小管耗氧量較高，從而無法維持正常生理功能［4］。

血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）又稱為血管通透因子（vascular permeability factor，VPF），是Senger 等［5］在腫瘤分泌物中發現的一種糖基化分泌性多肽因子，分子量約為34～45 kDa，是一種生物活性強烈、結構高度保守的糖蛋白［6］。有研究發現VEGF 在腎臟組織中含量較高，主要由腎小球足細胞合成并在生理環境中通過旁分泌和自分泌發揮生理功能，如腎胚胎的生長發育、保護腎小球內皮細胞完整性和腎毛細血管的再生與修復［7］。VEGF 的生物學功能是通過與內皮細胞中存在的特異性受體血管內皮生長因子受體-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）相結合來促進內皮細胞的增殖、提高血管通透性以及促進新血管生成，有研究表明VEGF/VEGFR-2 與低氧引起的腎臟疾病密切相關［8-9］。VEGF是低氧誘導因子-1α（hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α）的下游靶基因，低氧狀態中HIF-1α與VEGF基因的5′-端增強子結合位點相互作用，調節VEGF的轉錄激活以及表達［10-11］。缺氧過程中，腎臟中VEGF與HIF-1α的mRNA 同步變化，上調HIF-1αmRNA 可激活VEGF基因轉錄，促進血管重塑，便于將血液運送至腎小管的缺氧區域，減少腎損傷［12］。有研究表明，VEGF可通過細胞外信號調節激酶1/2（extracellular signalregulated kinase，ERK1/2）和激活轉錄因子-2（activating transcription factor，ATF-2）的磷酸化特異性刺激血管細胞粘附因子-1（vascular cell adhesion mole-1，VCAM-1）的表達，可介導細胞間或細胞與基質間的接觸與結合，進而促進細胞黏附和增殖，并與缺氧引起血管的重塑密切相關［13-14］（圖1）。

圖1 VEGF及其相關低氧因子相互關系示意圖Fig.1 Correlation diagram of VEGF and its related hypoxic factors

目前對腎臟的研究主要集中在成年動物腎臟的結構特征，如大鼠、小鼠和狗等［15］；對不同年齡段腎臟的研究主要集中在小鼠和大鼠［16-17］；關于VEGF 等因子在牦牛腎臟發育過程中的高原低氧適應性仍鮮見報道。因此，本試驗通過伊紅-蘇木精（hematoxylin-eosin，H&E）染色、免疫組織化學染色（immunohistochemical staining，IHC）和實時熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）方法檢測不同發育階段牦牛腎臟VEGF 及其受體VEGFR-2、HIF-1α 和VCAM-1 的表達分布差異，結合VEGF 的生物學功能推測其與牦牛高原低氧適應的關系，以期為進一步探究牦牛腎臟對高原低氧環境的適應性提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品

研究對象為15 頭高原牦牛，均采集自甘肅省甘南藏族自治州某屠宰場。將15 頭臨床表現正常的牦牛分為三個年齡組：新生牦牛（1～7 d，n=5）、9 月齡牦牛（9 月，n=5）和成年牦牛（6 歲，n=5）。所有組均包括雄性和雌性。在牦牛放血后15 min內立即采集腎臟組織并用4%的多聚甲醛固定。

1.2 試驗試劑

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖鹽、伊紅、蘇木精、Histostatim Plus 試劑盒（SP-0023）、抗VEGF 多克隆抗體（BS-1665R）、抗VEGFR-2 多克隆抗體（BS-0565R）、抗HIF-1α 多克隆抗體（BS-20398R）、抗VCAM-1 多克隆抗體（BS-8994R），北京博奧森生物技術有限公司；抗體結合用二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）底物試劑盒（DA1010），北京索萊寶科技有限公司；反轉錄試劑盒（AG11711），湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.3 H&E染色檢測及指標測定

1.3.1 H&E 染色 將牦牛腎臟組織切成體積為1 cm3的小塊后按照石蠟包埋的常規方法進行包埋，再對包埋好的蠟塊進行修塊和切片（厚度為5 μm），用于后續處理。使用H&E 染色方法觀察樣本的組織學特征。

1.3.2 指標測定 隨機選取不同發育階段牦牛腎臟組織切片各5 張，在400 倍視野下隨機選取5 個不同區域拍攝，用Image J 軟件觀察并測量不同發育階段牦牛腎臟皮質中腎小球和腎小管直徑及腎小球和腎小管上皮細胞、腎間質細胞面積。

1.4 免疫組化檢測

使用Histostatim Plus 試劑盒進行免疫組化染色，用于研究VEGF、VEGFR-2、HIF-1α 和VCAM-1 的表達水平，腎組織切片在二甲苯中脫蠟，并通過梯度酒精水化。經PBS沖洗后，放入0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液（pH 值6.0）對切片進行高壓滅菌（在微波爐中15 min），以回收抗原。內源性過氧化物酶在37 ℃下用3% H2O2滅活10 min。然后用抗VEGF 多克隆抗體、抗VEGFR-2 多克隆抗體、抗HIF-1α 多克隆抗體和抗VCAM-1 多克隆抗體（1∶200 稀釋度）在濕潤的4 ℃室內過夜培養。抗體結合用DAB 底物試劑盒染色，用蘇木精對細胞核進行復染。對照組使用牛血清蛋白作為一抗，其他步驟和條件保持不變。

1.5 qRT-PCR 檢測腎組織內VEGF、VEGFR-2、HIF-1α和VCAM-1表達

1.5.1 引物的設計與合成 根據GenBank 中的VEGF、VEGFR-2、HIF-1α和VCAM-1基因序列，采用Primer Premier 6.0 設計VEGF、VEGFR-2、HIF-1α和VCAM-1基因引物，同時以ACTB基因為內參基因，引物序列信息見表1，送至湖南艾科瑞生物工程有限公司合成。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.5.2 qRT-PCR 檢測腎組織內VEGF、VEGFR-2、HIF-1α和VCAM-1表達 按照反轉錄試劑盒說明書提取總RNA并將其反轉成cDNA后進行qRT-PCR。反應總體系為20 μL：H2O 8.2 μL，正反引物各0.4 μL，2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 10 μL，cDNA 1 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火35 s，40 個循環。qRT-PCR 反應在Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀（伯樂，上海）中進行，所得數值均用內參ACTB進行標準化。qRT-PCR結果采用2-ΔΔCt運算方法進行分析。

1.6 統計學分析

通過光學顯微鏡（奧林巴斯，日本）觀察并捕獲染色組織切片圖像，并通過圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0 進行定量檢測VEGF、VEGFR-2、HIF-1α 和VCAM-1 陽性表達結果。使用GraphPad Prism8.0 進行統計分析，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 H&E染色結果

觀察H&E 染色結果可知，不同發育階段牦牛腎臟的結構組織完整，發育狀況良好，無病變部位（圖2）。并且如表2 所示，腎小球和腎小管直徑、腎小球和腎小管上皮細胞以及腎間質細胞面積均隨年齡增長而逐漸增加，其中，新生和9 月齡牦牛的腎小球直徑、腎小球面積顯著低于成年牦牛（P<0.05），而腎小管直徑、腎小管上皮細胞面積和腎小管間質細胞面積在3 個發育階段之間均有顯著差異（P<0.05）。

表2 不同發育階段牦牛腎組織學指標測量數據Table 2 Measurement data of kidney histological indicators in yaks at different developmental stages

2.2 免疫組織化學染色和光密度分析結果

免疫組織化學和光密度分析結果顯示，與陰性對照組相比，VEGF、VEGFR-2、HIF-1α 和VCAM-1 主要表達在不同發育階段牦牛腎臟近端小管和遠端小管上皮細胞、腎小球細胞中。VEGF 在成年組表達最強，9 月齡組次之，新生組最弱（圖3-A～C），三組之間均存在顯著差異（P<0.05）（圖4-A）；VEGFR-2的表達隨著年齡的增長而增加，成年組表達最強，其次為9 月齡組，新生組最弱（圖3-D～F），三組之間均存在顯著差異（P<0.05）（圖4-B）；HIF-1α 在成年組表達最強，其次為9 月齡組，新生組最弱（圖3-G～I），三組之間均存在顯著差異（P<0.05）（圖4-C）；VCAM-1 在不同發育階段牦牛腎臟中均有表達（圖3-J～L），在9 月齡和成年組的表達量較高，兩者差異不顯著，在新生組表達量較低，與其他兩組相比差異顯著（P<0.05）（圖4-D）；不同發育階段牦牛腎臟陰性對照如圖3-M～O所示。

圖4 不同發育階段牦牛腎臟VEGF、VEGFR-2、HIF-1α和VCAM-1的平均光密度值Fig.4 Mean optical density value of VEGF，VEGFR-2，HIF-1α and VCAM-1 in the kidneys of yaks at different developmental stages

2.3 qRT-PCR檢測結果

qRT-PCR 結果顯示，VEGF、VEGFR-2、HIF-1α和VCAM-1在新生、9 月齡和成年組腎臟組織中均有表達。VEGF相對表達量在新生組最高，與9 月齡和成年組之間差異顯著（P<0.05），9 月齡組和成年組之間表達差異不顯著（圖5-A）；VEGFR-2相對表達量在新生組和成年組較高，兩者差異不顯著，在9 月齡組的表達量最低，與其他兩組相比差異均顯著（P<0.05）（圖5-B）；HIF-1α相對表達量在新生組最高，與其他兩組相比差異顯著（P<0.05），9 月齡組和成年組之間差異不顯著（圖5-C）；VCAM-1的相對表達量在9 月齡組和新生組較高，兩組相比差異不顯著，在成年組的表達量最低，與其他兩組相比均差異顯著（P<0.05）（圖5-D）。

圖5 不同發育階段牦牛腎臟VEGF、VEGFR-2、HIF-1α和VCAM-1的相對表達量Fig.5 Relative expression levels of VEGF，VEGFR-2，HIF-1α and VCAM-1 in the kidneys of yaks at different developmental stages

3 討論

本研究H&E 染色結果發現，不同發育階段牦牛腎臟的腎小球和腎小管直徑、腎小管上皮和腎小球細胞面積均隨年齡的增長而增大，這與Goyal等［18］和Davies等［19］對增齡小鼠腎小球和腎小體的組織結構觀察，以及王婷等［20-21］對新生至成年時期的牦牛腎小管的形態結構觀察結果一致。腎間質細胞可以分泌多種因子，如表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF），促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）等，參與調控紅細胞生成和腎臟生長發育［22-23］。本試驗結果發現，牦牛腎臟發育過程中，腎小管間質成分逐漸增多，與上述報道相符。可見，隨著年齡的增長，牦牛腎小管和腎小球逐漸增大，腎間質細胞增多，腎功能逐漸成熟，以適應高原的低氧環境。

IHC 結果顯示，VEGF、VEGFR-2、HIF-1α 和VCAM-1主要分布在腎小管上皮細胞和腎小球細胞胞質，且表達量與年齡呈正相關。在低氧環境下，腎臟通過調控促血管生成、紅細胞生成和糖酵解的因子來適應環境［24］。VEGF 是血管生成和血管發育的中樞，缺氧時，靶組織響應缺氧而調控多種血管生成因子產生［25］。低氧刺激下，VEGF 激活血管內皮細胞上的受體VEGFR-2，以促進血管內皮細胞的增殖、遷移和血管形成［26］。HIF-1α 信號傳導參與低氧條件下VEGF介導的血管生成，且在腎臟微血管發育過程中起著重要作用［27］，例如Kotch 等［28］發現HIF-1α完全缺乏會引起鼠胚胎在低氧時不能誘導VEGFmRNA的生成，導致腎微血管生成異常。VEGF 通過ATF-2 刺激VCAM-1的表達以及內皮細胞和白細胞的粘附與遷移［14］。本研究中，牦牛VEGF 蛋白及其受體VEGFR-2 在腎臟不同發育階段的腎小球和腎小管中均高表達。這與Doi等［29］報道的VEGF主要分布于人類腎中腎小球的足細胞、遠曲小管和近曲小管的結果基本相符。腎臟在缺氧刺激下調控VEGF 和VEGFR-2 蛋白表達以維持腎小球和腎小管毛細血管網絡和腎小球濾過屏障［24，26-27，30］。據此推測，VEGF 及其受體在發育階段可能對牦牛腎血管及腎小球維持器官正常生理功能發揮作用。而牦牛腎臟中VEGF 及VEGFR-2 蛋白的表達與年齡呈正相關，這與郭潔等［16］和張雪光等［17］報道的鼠腎組織內VEGF 及VEGFR-2 表達量隨著年齡的增長而增加的結果相一致。推測VEGF 及VEGFR-2 蛋白在成年牦牛腎臟高表達可能與腎臟的低氧適應性以及預防低氧引起的腎損傷有關。Freeburg 等［31］研究了腎小球足細胞中HIF 產生的機制，并證實了在發育期間，集合管和大部分腎小管處于較嚴重的低氧狀態，這與本試驗結果中HIF-1α 蛋白高表達于牦牛腎小管上皮細胞相一致。Xu 等［32］研究顯示，在10%的氧濃度中，VEGF 的表達趨勢與HIF-1α 相同，均隨缺氧時間的延長和缺氧程度的增加而增加。這與本試驗結果相同，即：VEGF 及其受體VEGFR-2 蛋白的表達趨勢與HIF-1α 相同，其表達量均隨年齡的增長而增加，在成年組表達最高。據此推測，在發育期間，低氧刺激HIF-1α 誘導VEGF 及VEGFR-2 的表達上調并增加向組織的氧氣輸送來使牦牛適應低氧環境。本試驗發現，VCAM-1 蛋白在牦牛腎臟中的表達與年齡成正相關，且主要分布于腎小管上皮細胞。這與Hill 等［33］發現在人正常腎臟中，VCAM-1 的表達僅限于壁上皮細胞和少數近端小管細胞的基底外側表面的結果基本相符，不同的是牦牛腎小管上皮細胞表達更為豐富且均勻。而新生牦牛腎臟VCAM-1 蛋白的表達較低，可能與新生牦牛仍未適應低氧環境有關。VCAM-1的表達受低氧和VEGF 的調控，由此推測低氧刺激腎小球分泌VEGF，進而特異性誘導VCAM-1 的表達，以促進細胞的黏附和分化，在牦牛腎臟適應低氧過程中起促進作用。

本試驗qRT-PCR 結果表明，隨著年齡的增長，HIF-1α和VEGF表達量呈遞減趨勢，VEGFR-2在成年表達較高，VCAM-1在成年表達最低，與免疫組化光密度分析蛋白結果有所不同。推測造成這種差異的原因，首先可能是由于兩種試驗方法分析的角度不同，qRT-PCR 分析的是腎組織平均表達量，而免疫組化分析的是特定區域細胞組織的蛋白表達量。其次，VEGF等因子是調節血管生成及血管重塑的主要調控因子，VEGF、VEGFR-2、HIF-1α和VCAM-1表達減少可能使腎血管隨增齡出現生成異常現象［18-19］。再次，通過H&E 和IHC 觀察發現，隨著年齡增長，腎間質細胞面積增加，由于其幾乎不表達上述相關蛋白，所以對qRT-PCR結果會產生影響。

4 結論

本研究發現，VEGF、VEGFR-2、HIF-1α和VCAM-1的表達與年齡呈正相關，其表達分布特點相似，主要分布于牦牛腎臟的近端小管和遠端小管上皮細胞及腎小球細胞的胞質中。推測在低氧條件下，VEGF、VEGFR-2、HIF-1α 和VCAM-1 通過調控促進血管生成、紅細胞生成和糖酵解過程，對牦牛腎臟發育過程中適應低氧環境起重要作用，但具體調控機制還需進一步深入研究。