黃綠卷毛菇胞外多糖發酵條件的優化及其生物活性研究

吳夢園 徐慧敏 張 鑫 朱青永 陳宇杰 陳啟和 劉政捷，，*

（1浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316022；2浙江大學食品科學與營養系，浙江 杭州 310058）

真菌胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS）是一種由微生物在其生長代謝過程中分泌到細胞外的天然水溶性大分子物質［1］。EPS 具備多種生物學功能，包括抗癌、抗氧化、抗炎、免疫調節、保濕、降血糖、降血脂等，已廣泛應用于食品、生物醫學、化妝品和制藥行業［2-4］。據報道，裂褶菌多糖有助于預防高膽固醇血癥和糖尿病等多種疾病，并降低化療的副作用，還可作為護膚品添加劑用于保濕和抗衰老［5-6］。香菇多糖、靈芝多糖等其他真菌多糖均被報道具有潛在的免疫調節、抗腫瘤和抗癌活性［7-8］。因此，開發野生珍稀食藥用菌的生物資源在滿足人們對活性成分的需求方面具有很大的前景。

黃綠卷毛菇（Floccularialuteovirens），又叫黃蘑菇，屬于擔子菌門（Basidiomycota），傘菌綱（Agaricomycetes），傘菌目（Agaricales），傘菌科（Agaricaceae），卷毛菇屬（Floccularia）［9］，是我國青藏高原特有的一種珍稀食藥用菌，富含多糖、麥角硫因、黃酮、生物堿等多種生物活性成分［10-12］，具有顯著的抗炎、抗輻射、抗氧化、抗癌等生理功能［13］。作為一種傳統的藏藥，黃綠卷毛菇經常被用于治療神經衰弱、頭暈、失眠、頭痛等癥狀［14］。多糖作為其中主要的生物活性成分之一，已被證實具有抗氧化和抗腫瘤作用［11］。但由于黃綠卷毛菇特殊的生長環境和生理特性，其子實體每年只能收獲一次，因此從子實體中提取多糖成本較高。相比于從子實體中提取多糖，利用液體深層發酵產胞外多糖的方法不僅有利于資源的可持續發展，起到保護種子資源和環境的目的，而且具備發酵條件易于控制等優勢，可獲得更高的經濟效益。因此，通過優化深層發酵條件來提高黃綠卷毛菇胞外多糖（Floccularialuteovirensexopolysaccharide，FLEP）產量的方法具有重要意義。

本研究在黃綠卷毛菇液體發酵過程中，采用在培養基中添加表面活性劑吐溫80、微顆粒氧化鋁，并利用超聲輔助的方法來提高FLEP 產量。在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化FLEP 的積累，并探究FLEP的體外抗氧化活性及吸濕保濕特性，旨在為促進黃綠卷毛菇液體發酵生產胞外多糖及其在食品、藥品和化妝品行業的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株 黃綠卷毛菇菌株WMY10 由浙江大學陳啟和教授提供。

1.1.2 試劑 葡萄糖、磷酸氫二鉀、乙醇、吐溫80、硫酸、磷酸二氫鉀、七水合硫酸鎂、苯酚、甲醇（分析純），國藥集團（上海）化學試劑有限公司；酵母浸粉、中性氧化鋁微顆粒，上海麥克林生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）、丁基羥基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）、乙二胺四乙酸二鈉鹽（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate，EDTA-2Na），上海阿拉丁生化科技有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒［2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid），ABTS］，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

LRH-70 恒溫培養箱，成都蘇凈科學器材有限公司；LDZF-50KB 高壓滅菌鍋，愛寶來（濟南）醫療科技有限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺，上海昕儀儀器有限公司；HYC-A 全溫搖床，上海璽袁科學儀器有限公司；FC 全自動酶標儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；KQ-500E 型超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃綠卷毛菇菌株的培養 菌株的培養：將WMY10 接種于PDA 平板上，于恒溫培養箱中25 ℃培養10 d。種子液的培養：用接種鏟從長滿菌絲體的平板上取大小約為0.5 cm2的菌絲體5塊接種于液體培養基中，25 ℃、120 r·min-1條件下培養14 d （液體培養基包括［15］：葡萄糖31.26 g·L-1，磷酸氫二鉀1 g·L-1，酵母提取物1.06 g·L-1，磷酸二氫鉀0.5 g·L-1，七水合硫酸鎂0.45 g·L-1）。液體發酵培養時，按接種量10%（v/v），取種子液10 mL 接種于90 mL 液體培養基中，于25 ℃、120 r·min-1條件下在恒溫搖床中培養25 d。

1.3.2 菌絲體生物量和胞外多糖含量的測定 發酵結束后，采用抽濾的方法將菌絲體和發酵液分離。用蒸餾水將菌絲體清洗3 次以除去培養基成分，烘干至恒重后計算菌絲體生物量。發酵液于5 000 r·min-1離心20 min 后收集上清液，加入無水乙醇充分混勻，4 ℃醇沉24 h。將醇沉的液體于5 000 r·min-1離心15 min取沉淀，用適量蒸餾水溶解，采用硫酸-苯酚法［14］測定胞外多糖含量。

1.3.3 微顆粒對菌絲體生物量和胞外多糖含量的影響 選取不同粒徑的氧化鋁微顆粒（60～100、100～200、200～300、300～400 目），添加到液體培養基中（含有0.4 g·L-1吐溫80）至質量濃度為10 g·L-1。將種子液按照10%的接種量接入液體培養基中，于25 ℃、120 r·min-1條件下在恒溫搖床中培養6 d 后取出超聲波處理15 min，放入搖床中繼續培養19 d。取出測定菌絲體生物量和胞外多糖含量，探究加入微顆粒的最適粒徑。

1.3.4 超聲時間對菌絲體生物量和胞外多糖含量的影響 在接種發酵后的第6 天開始用超聲波分別處理0、5、10、15、20、25 min，然后放入搖床中繼續培養19 d（液體培養基中含有0.4 g·L-1吐溫80，200～300目氧化鋁10 g·L-1），培養結束后取出測定菌絲體生物量和胞外多糖含量，探究最適超聲時間。

1.3.5 吐溫80 對菌絲體生物量和胞外多糖含量的影響 將種子液接入含有不同質量濃度吐溫80（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0，3.0 g·L-1）的液體培養基，放入搖床中培養25 d （液體培養基含有200～300 目氧化鋁10 g·L-1，超聲處理15 min），測定菌絲體生物量和胞外多糖含量，探究加入吐溫80的最適質量濃度。

1.3.6 響應面試驗設計 基于上述單因素試驗結果，以胞外多糖含量（Y）為響應值，選取吐溫80 質量濃度（A）、微顆粒粒徑（B）、超聲時間（C）3 個因素，根據Design Expert 10.0.7 軟件中Box-Behnken Design 原理對其進行響應面試驗設計，因素的水平與設計見表1。

1.3.7 DPPH 自由基清除能力的測定 參照楊靜等［16］的方法并稍加改動，用無水乙醇將DPPH 配制成0.2 mmol·L-1的DPPH 溶液，將干燥的FLEP 樣品配制成1～5 mg·mL-1不同質量濃度的溶液，分別取不同質量濃度的FLEP 溶液4 mL 與1 mL 的DPPH 溶液混勻，使其充分反應，室溫下避光靜置30 min 后，在517 nm處測定混合溶液的吸光度值。以合成抗氧化劑（BHA）作為陽性對照，根據公式（1）計算DPPH 自由基清除率：

式中，A0為DPPH溶液的吸光度；A1為樣品或陽性對照加DPPH溶液的吸光度；A2為樣品溶液的吸光度。

1.3.8 亞鐵離子螯合能力的測定 參照高凡等［17］的方法并稍加改動，將干燥的FLEP樣品配制成1～5 mg·mL-1不同質量濃度的溶液，分別取1 mL 不同質量濃度的FLEP溶液與0.1 mL的氯化亞鐵（2 mmol·L-1）和0.2 mL啡啰嗪-鈉鹽溶液（5 mmol·L-1）混合，用3.7 mL的甲醇溶液補至5 mL混合均勻，室溫下靜置20 min后于562 nm處測定吸光度。以EDTA-2Na為陽性對照，按照公式（2）計算亞鐵離子清除率：

式中，A0為空白對照組的吸光度；A1為樣品或陽性對照的吸光度；A2為含樣品的空白對照組的吸光度。

1.3.9 ABTS自由基清除能力的測定 采用總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS 法）評價ABTS 自由基清除能力。步驟參考試劑盒說明書，Trolox 作為陽性對照。以不同濃度的Trolox 溶液作標準曲線定量測定FLEP的ABTS 自由基清除能力，結果以mmol·g-1Trolox 當量值表示。

1.3.10 吸濕保濕性的測定 吸濕性測定：參考文獻［18］并稍加改動。精密稱取0.2 g 干燥FLEP 樣品、甘油、透明質酸、殼聚糖于恒重的稱量瓶中，然后分別敞口放置于溫度25 ℃、相對濕度43%和81%的恒溫恒濕培養箱中，于0、3、6、9、12、24、36、48 h取出稱量記錄Mt，按照公式（3）計算吸濕率：

式中，Mt為吸濕t時間的樣品質量；M0為干燥樣品質量。

保濕性測定：參照文獻［19］并稍加改動。精密稱取0.2 g 干燥FLEP 樣品、甘油、透明質酸、殼聚糖于恒重的稱量瓶中，加入5 g 蒸餾水將樣品均勻潤濕，然后分別放入溫度25 ℃、相對濕度43%和干燥的硅膠環境中使其脫水，于0、3、6、9、12、24、36，48 h 取出稱量，按照公式（4）計算保濕率：

式中，H0為樣品放置前的水分質量；Hn為樣品放置后的水分質量。

1.4 數據處理

采用SPSS 21.0 和Origin 2021 軟件進行數據處理與分析，采用單因素方差分析顯著性（Duncan’s multiple range test），顯著性水平為0.05；利用Origin 2021 軟件制圖；響應面試驗設計分析采用Design Expert 10.0.7軟件，所有試驗設置3組平行。

2 結果與分析

2.1 微顆粒對菌絲體生物量和胞外多糖含量的影響

絲狀真菌在液體培養過程中大多以球狀、團簇狀及游離狀存在。在培養基中添加微顆粒可以通過阻礙菌絲體的聚集來改變菌絲體形態，從而促進發酵產物的增加［20-21］。不同粒徑的微顆粒對黃綠卷毛菇液體發酵產胞外多糖及菌絲體生物量的影響如圖1 所示。隨著微顆粒粒徑變小，胞外多糖（FLEP）含量呈現出先升高后降低的趨勢。即：60～100、100～200、200～300 目的微顆粒可以促進FLEP 的產生，其中100～200目促進效果最好，為1.91 g·L-1，是對照組（1.40 g·L-1）的1.36 倍；添加300～400 目的微顆粒則抑制了FLEP 的產生。由圖1 還可知，微顆粒對菌絲體的生長起到了促進作用，粒徑越細促進效果越好，在300～400 目微顆粒的作用下，菌絲體生物量達到最大，為1.68 g·L-1，是對照組（1.21 g·L-1）的1.39倍。綜上所述，微顆粒粒徑越小，對菌絲體生物量和胞外多糖含量的促進效果越好。

圖1 微顆粒粒徑對菌絲體生物量和胞外多糖含量的影響Fig.1 Effects of particle size on mycelial biomass and exopolysaccharide content

2.2 超聲時間對菌絲體生物量和胞外多糖含量的影響

研究發現，低頻率的超聲（20～50 kHz）可以有效促進微生物細胞的生長及次級代謝產物的合成［22-23］。由圖2 可知，隨著超聲時間的延長，FLEP 含量表現為先上升后下降，在超聲時間5～20 min 范圍內，FLEP 含量不斷上升，并在超聲時間為20 min 時達到最高值（2.15 g·L-1），是對照組（1.63 g·L-1）的1.32倍。隨著超聲時間的延長，菌絲體的生物量呈現先上升后下降再趨于平穩的趨勢，在超聲時間為5 min時，菌絲體的生物量達到1.65 g·L-1，為對照組（1.15 g·L-1）的1.43倍，超聲時間5和10 min時的菌絲體生物量無顯著差異，繼續延長超聲時間，菌絲體的生物量均低于超聲時間5 min。綜上所述，超聲時間20 min 是促進FLEP 產量的最佳時間，而在超聲時間5 min時，菌絲體生物量達到最大。

圖2 不同超聲時間對菌絲體生物量和胞外多糖含量的影響Fig.2 Effects of different ultrasonic time on mycelial biomass and exopolysaccharide content

2.3 吐溫80對菌絲體生物量和胞外多糖含量的影響

吐溫80 作為一種表面活性劑，具備良好的乳化性、溶解性以及降低表面張力的能力，已被證明可以促進大多數微生物菌絲體的生長及胞外多糖的產生［8，24］。由圖3 可知，隨著吐溫80 質量濃度的不斷增加，FLEP含量和菌絲體生物量均呈現先上升后下降的趨勢。在吐溫80質量濃度范圍為0.2～0.6 g·L-1時，對FLEP 含量表現出促進作用，并在0.4 g·L-1時達到最大值（2.30 g·L-1），為對照組（1.85 g·L-1）的1.24倍，而在質量濃度為0.8～3 g·L-1時表現為抑制作用。菌絲體生物量在吐溫80 質量濃度為0.2～0.6 g·L-1時呈增加趨勢，并在0.4 g·L-1時達到最大值（2.06 g·L-1），為對照組（0.95 g·L-1）的2.17 倍。綜上所述，選擇0.4 g·L-1作為促進FLEP 產量與菌絲體生長的最佳吐溫80質量濃度。

圖3 吐溫80質量濃度對菌絲體生物量和胞外多糖含量的影響Fig.3 Effect of Tween 80 mass concentration on mycelial biomass and exopolysaccharide content

2.4 響應面試驗結果與分析

2.4.1 響應面試驗結果與方差分析 綜合單因素試驗結果，以胞外多糖含量（Y）為響應值，對吐溫80質量濃度（A）、微顆粒粒徑（B）、超聲時間（C）三因素進行響應面試驗優化設計，試驗設計與結果見表2，對回歸方程進行方差分析，得到的結果見表3。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface experimental design and results

表3 回歸方程的方差分析表Table 3 Analysis of variance table of regression equation

利用Design-Expert 10.0.7 軟件對試驗數據進行多元回歸擬合，得到FLEP 的回歸方程：Y=2.42+0.08A+0.13B+0.16C-0.04AB+0.05AC+0.03BC-0.15A2-0.23B2-0.20C2。對回歸方程進行方差分析，結果見表3。響應面的回歸模型F=71.62，P值為<0.000 1，說明響應面模型顯著，失擬項P=0.094 2>0.05，模型失擬不顯著；模型相關系數R2=0.989 3，表明該模型的擬合程度較好，實際試驗中約98.93%的結果可以通過擬合模型進行解釋；校正系數RAdj2=0.975 4 與R2值接近，說明該模型有充分的準確性和通用性，因此可以用此模型對黃綠卷毛菇發酵產胞外多糖進行分析和預測。在該模型中一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2對FLEP 含量影響極顯著，交互項AC對FLEP 含量影響顯著，其他項因素影響不顯著。從表中可得影響FLEP含量的因素大小順序為超聲時間>微顆粒粒徑>吐溫80質量濃度。

2.4.2 不同因素間交互作用分析 通過響應曲面圖和等高線可以直觀地反映各因素及其交互作用對胞外多糖含量的影響，響應曲面圖越陡，說明因變量對響應值的影響越大，等高線越接近橢圓，說明二者交互作用顯著，反之越弱［25-26］。如圖4-a、b、e、f 所示，響應曲面圖較陡，說明3 個因素對FLEP 含量的影響較大。等高線接近圓形，說明因素間的交互作用對FLEP 含量影響不顯著。由圖4-c、d 可知，超聲時間和吐溫80 質量濃度對FLEP 含量影響的曲線較陡，且等高線呈現橢圓形，表明二者之間的交互作用對FLEP 含量的影響較顯著。這與上文方差分析的結果一致。

圖4 各因素間交互作用對胞外多糖含量影響的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour map of the interaction between factors on the content of exopolysaccharide

2.4.3 模型驗證試驗 通過Design Expert軟件分析得到最佳的產糖條件為：吐溫80 質量濃度0.454 g·L-1，微顆粒粒徑207.466 目，超聲時間20.953 min，此時FLEP 的理論產量為2.47 g·L-1。因試驗實際需要，將試驗條件調整為吐溫80 質量濃度0.4 g·L-1、微顆粒粒徑100～200 目、超聲時間20 min，在此條件下進行3 組驗證性試驗，FLEP 的平均產量為2.44 g·L-1，與預測值接近，說明使用該回歸模型優化黃綠卷毛菇液體發酵產胞外多糖的條件是可行的。

2.5 FLEP對DPPH自由基的清除能力

DPPH 自由基通常用于評價新型抗氧化劑的自由基清除活性［27］。由圖5可知，在1～5 mg·mL-1的質量濃度范圍內，FLEP 對DPPH 自由基的清除率呈現濃度依賴性的升高，但當FLEP質量濃度高于1 mg·mL-1后，清除率的增加逐漸趨于平緩。FLEP 的清除能力僅次于同質量濃度的BHA。當質量濃度為5 mg·mL-1時，FLEP的清除率為71.0%，接近于對照組BHA的76.4%。

圖5 FLEP對DPPH自由基清除率Fig.5 The scavenging rate of FLEP to DPPH free radicals

2.6 FLEP對亞鐵離子的螯合能力

亞鐵離子被認為是大多數氧化反應催化劑的活性中心，因此抑制亞鐵離子與催化劑的基體結合可起到一定的抗氧化作用［28］。不同質量濃度的FLEP 對亞鐵離子的螯合能力如圖6所示。結果表明，在1～5 mg·mL-1的質量濃度范圍內，FLEP對亞鐵離子的螯合能力呈現濃度依賴性的增長，在5 mg·mL-1下達到最高的清除率（58.2%），雖然低于對照組EDTA-2Na 在5 mg·mL-1的清除率（94.4%），但仍然可以有效地結合亞鐵離子，表現出較好的抗氧化活性。

圖6 FLEP對亞鐵離子的螯合能力Fig.6 The chelating ability of FLEP for ferrous ions

2.7 FLEP對ABTS自由基的清除能力

ABTS 自由基清除能力被廣泛用于評估化合物的總抗氧化能力［29］。以不同濃度的Trolox溶液作標準曲線，y為Trolox溶液標準濃度（mmoL·L-1），x為測量的光密度（optical density，OD）值，得到擬合標準曲線回歸方程y=-0.749 1x+1.008 5（R2=0.990 4）。計算得出FLEP的ABTS 自由基清除能力為0.044±0.001 mmol·g-1Trolox，表明FLEP具有一定的清除ABTS自由基能力。

2.8 FLEP的吸濕性和保濕性

多糖通常具有強親水性，有利于吸濕和保濕，這是用來對抗衰老的重要因素［30］。在溫度25 ℃、相對濕度43%和81%的環境下，4 種樣品的吸濕性結果如圖7 所示。結果表明，吸濕率大小均為甘油>透明質酸>FLEP>殼聚糖。在0～3 h內，所有樣品吸濕率增長速度都較快，3 h 后增長速度逐漸趨于平穩。在相對濕度43%的環境下（圖7-A），甘油的吸濕率顯著高于透明質酸、FLEP和殼聚糖，48 h時，FLEP的吸濕率為8.9%，優于殼聚糖（8.8%），次于透明質酸（12.2%）。在相對濕度81%條件下（圖7-B），48 h 時，FLEP 的吸濕率為15.8%，高于殼聚糖（13.4%），次于甘油和透明質酸。雖然甘油的吸濕效果優于另外3 種樣品，但甘油使用過多會給皮膚造成黏膩感，而且不宜在干燥的環境中使用。

圖7 不同濕度環境下的4種物質的吸濕率Fig.7 Moisture absorption rate of four substances in different humidity environments

在溫度為25 ℃、相對濕度為43%和干燥環境中，4 種樣品的保濕性結果如圖8 所示。在相對濕度43%的環境下（圖8-A），保濕率大小表現為甘油>FLEP>透明質酸>殼聚糖。48 h時，FLEP 的保濕率為89.5%，顯著高于透明質酸的89.2%，僅次于甘油的89.8%。在干燥環境中（圖8-B），FLEP 的保濕率大于其他3 種樣品，48 h 時，FLEP 的保濕率為55.4%，顯著高于甘油（53.4%）、透明質酸（51.2%）、殼聚糖（50.9%）的保濕率。

圖8 不同濕度環境下的4種物質的保濕率Fig.8 Moisture retention rate of four substances in different humidity environments

3 討論

EPS 因具備多種生物活性、生產條件簡便、易分離純化等優點而引起國內外許多學者的關注。提高EPS的產量是深入研究EPS 的前提，目前大多數研究主要集中在發酵培養基的組成（碳源、氮源的種類及濃度），發酵條件（溫度、pH 值、轉速、接種量）及發酵時間等方面［31-33］。

研究表明，在發酵培養基中添加微顆粒有利于EPS的合成和積累［34］。本研究發現添加氧化鋁微顆粒可以有效促進FLEP 的產生。可能是震蕩培養過程中微顆粒與菌絲體之間發生碰撞產生剪切力，阻礙了菌絲體之間的直接相互作用，改變了菌絲體形態，從而有利于傳熱和傳質［20］。也可能是微顆粒影響了與多糖合成相關酶的活性。如，Tao 等［21］研究發現，微顆粒提高了灰樹花（Grifolafrondosa）多糖合成相關酶的活性，將一部分單糖轉化，通過影響單糖組成促進了EPS 的產生。此外，陳瀟筱等［34］發現添加氧化鋁也有助于提高灰樹花EPS 產量，這與本研究結果一致。對于菌絲體來說，300～400 目的微顆粒使生物量達到最大，說明粒徑較細的微顆粒可以更好地促進菌絲體的生長，但對FLEP 表現出抑制作用，可能與菌絲體濃度過高時會抑制其他分泌物的產生有關［29］。

有研究報道，超聲波可有效促進微生物代謝產物的合成［23，35-36］。如Zhang 等［23］發現超聲波刺激可顯著提高桑黃（Phellinusigniarius）多糖產量。而本研究發現，超聲波刺激在5～25 min 范圍內顯著提高了FLEP含量，并在20 min時達到最高。究其原因，一是超聲波的空化作用降低了微生物細胞膜中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例，改變了細胞膜的滲透性，進而促進了營養物質與代謝產物的交換［35］。其次，超聲波通過激活Ca2+通道，促進細胞內核酸和蛋白質的釋放，從而提高傳質效率［22，35］。而對菌絲體來說，生物量在超聲時間5 min時達到最大值，之后均無顯著增長。推測是由于過長的超聲處理導致菌絲體部分破裂，從而使得菌絲體生物量減少［23］，這與Lu等［35］的研究結果一致。

本研究還發現，培養基中添加吐溫80 可有效提高FLEP的含量和菌絲體生物量。這可能是因為吐溫80可以增大菌絲體顆粒的比表面積并提高多糖合成相關基因的轉錄水平［8］。磷酸葡糖變位酶（phosphoglucomutase，PGM）和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase，UGP）是合成多糖的關鍵酶，Yang 等［37］在研究靈芝液體發酵過程時發現，吐溫80 的加入顯著提高了PGM 與UGP 的轉錄水平。同時，吐溫80 可提高細胞的ATP 水平，促進細胞對葡萄糖的攝取，從而有利于EPS 的生產［8，37］。本研究中，吐溫80 的最優濃度為0.4 g·L-1，繼續提高吐溫80 濃度會對FLEP 產量和菌絲體生物量產生不利影響，這可能與高濃度的吐溫80 產生過多泡沫，不利于傳質和傳熱有關［38］。而Meng等［8］則發現，深層發酵裂褶菌時，吐溫80 最適濃度為1 g·L-1，這可能是由于吐溫80對不同物種作用效果不同。

在抗氧化水平測試中，FLEP表現出較強的抗氧化活性，對DPPH 的清除能力優于香菇多糖［39］，對亞鐵離子螯合能力略低于靈芝多糖［40］，而ABTS 的清除能力優于猴頭菇多糖［41］。一方面可能是由于超聲處理破壞了多糖的天然氫鍵，使其可以提供更大的表面積與自由基反應［23，42］；另一方面可能與不同食用菌多糖的單糖組成、分子量及構象不同有關［4］。

在實際應用方面，本研究發現FLEP 的吸濕性優于殼聚糖，而在干燥環境中，FLEP 的保濕效果高于其他3 種樣品。前人研究表明，多糖中的羥基、羧基及其他極性基團可與水分子形成氫鍵，結合大量的水，FLEP的吸濕性取決于其所含的親水基團［43-44］。冬蟲夏草多糖Cs-HK1 在24 h、相對濕度81%條件下的吸濕性為14.0%［45］，而FLEP在48 h、相對濕度81%條件下的吸濕率為15.8%，效果優于前者，說明FLEP具有更多的親水基團。而多糖的保濕效果往往取決于多糖鏈之間相互交織形成的網狀結構［46］。如在48 h、干燥環境中，FLEP的保濕率為55.4%，優于Shao 等［44］報道的Sargassum horneri多糖的保濕率（49.1%）。說明FLEP 具有比后者更密集的網狀結構，可結合并保持更多的水分子。綜合吸濕保濕能力的結果，本研究認為FLEP 具有作為天然護膚品添加劑的潛力。

4 結論

本研究發現，微顆粒、超聲波和表面活性劑對FLEP 的產量有顯著影響。通過單因素試驗和響應面優化得到黃綠卷毛菇產胞外多糖的最佳條件為吐溫80質量濃度0.4 g·L-1、微顆粒粒徑100～200目、超聲時間20 min，在此條件下得到FLEP 產量為2.44 g·L-1，是對照組的1.5 倍。此外，FLEP 具有較好的體外抗氧化活性和吸濕保濕性能，在天然保健品和化妝品行業的應用中具有廣闊的開發前景和使用價值。