不同硒累積型水稻耐高硒毒害差異特征研究

卜少騰 李衍亮 李玉義 譚卓賢 張 木

（1東莞理工學院生態環境與建筑工程學院，廣東 東莞 523808；2廣東省農業科學院農業資源與環境研究所/農業農村部南方植物營養與肥料重點實驗室/廣東省養分資源循環利用與耕地保育重點實驗室，廣東 廣州 510640；3中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081；4仲愷農業工程學院資源與環境學院，廣東 廣州 510225）

硒（selenium，Se）是人和動物所必需的微量營養元素，在維持健康的免疫系統和降低疾病風險方面起到關鍵作用［1］。我國大面積土壤缺硒，加之部分富硒地區因土壤偏酸而導致硒有效性較低，植物吸收困難，作物產品中的硒含量普遍偏低，人們通常采用外源施硒的手段來提升作物產品中的硒含量［2-4］。硒并非植物所必需的營養元素，有益和有害的界限較窄，低濃度硒可提高葉綠素含量、增強植物抗逆性，進而促進植物生長，高濃度硒則會對植物造成嚴重毒害作用［5-6］。不同種類的植物富硒能力不同，同種作物不同品種之間的富硒能力有時也存在較大差異，對硒的敏感性也不同［7］。不同種類植物體中硒對抗氧化系統的作用閾值存在差異，適量硒可能起到正向調節作用，過量硒則會誘導氧化應激產生過量活性氧并造成細胞膜損傷［8-9］。植物可以通過自身防御系統調節酶類抗氧化劑超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）及非酶類抗氧化劑抗壞血酸（ascorbic acid，ASA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和類胡蘿卜素（carotene，CAR）等活性氧的過度積累，以保護植物細胞組織免受自由基的毒害。逆境條件下，碳氮代謝產物含量的增加能夠為植物生長提供能量以及建構物質，是植物抵御逆境脅迫的物質基礎［10］，且對植物抵抗硒毒害具有重要作用。除此之外，硒超累積植物還能將更多的硒結合在非關鍵代謝組織，避免過量的硒直接參與核心代謝過程，從而具有較強的耐高硒毒害能力［11］。水稻并非硒超累積植物，不同水稻品種對硒的富集能力差別較大，硒高累積水稻品種耐高硒毒害的能力要強于硒低累積水稻品種，但其具體生長、生理作用差異機制仍不明確。因此，本研究以硒高、低累積水稻品種為研究對象，通過盆栽試驗研究硒高累積水稻和硒低累積水稻在不同硒水平下的生長特征差異，旨在為生產富硒水稻提供技術和理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻（OryzasativaL.）品種為華南雙季稻區廣泛種植的常規水稻品種美香占和晚絲香，均由廣東省農業科學院水稻研究所提供（為廣東省農業科學院農業資源與環境研究所土壤與肥料項目團隊在華南雙季稻區長期開展水稻增效富硒技術試驗研究中篩選所得）。其中美香占為相對硒高累積水稻品種（H-Se），晚絲香為相對硒低累積水稻品種（L-Se）。試驗試劑為亞硒酸鈉（Na2SeO3），由農業農村部南方植物營養與肥料重點實驗室提供。供試土壤為廣東省佛山市高明區更合鎮的粘壤土，基本理化性質如下：pH值4.70、有機質含量27.10 g·kg-1、堿解氮172.90 mg·kg-1、有效磷25.60 mg·kg-1、速效鉀141.00 mg·kg-1、總硒0.21 mg·kg-1。

1.2 試驗方法

試驗于2021年7月在廣東省農業科學院農業資源與環境研究所盆栽場的溫室大棚中開展，盆栽裝置為聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）材質桶，每桶裝土3 kg，土壤裝桶前先過2 cm 網篩。試驗設置0、0.5、25 mg·kg-1共3 個硒處理，以Na2SeO3為硒源。大量元素肥料用量為每千克土壤施N 0.2 g、P2O50.15 g、K2O 0.2 g，分別以尿素［CO（NH2）2］、磷酸二胺［（NH4）2HPO4］、氯化鉀（KCl）作為肥源。其中鉀、磷肥全部作基肥施入，氮肥基施60%，拔節期追施40%。為保證植株營養需求，每千克土壤再補施1 mL 濃縮1 000 倍的阿農微量元素營養液。所有肥料均配成溶液施入土壤。水稻生長期從7月20日持續到11月25日，水稻采用移栽的方式，每桶定苗1 株，每個處理重復8 次。水稻生長期間定期定量進行水分澆灌，嚴格進行病蟲害防治，各環節均按照盆栽模擬試驗技術規范進行，最大程度上保證數據的準確性和可靠性。

1.3 測定項目與方法

土壤基本理化性質測定參照《土壤農化分析》［12］中的常規分析方法。其中堿解氮含量采用堿解擴散法測定；有效磷含量采用鉬藍比色法測定；速效鉀含量采用火焰光度法測定；有機質含量采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測定。土壤pH 值采用PHS-3E 型實驗室pH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司）測定。土壤總硒含量的測定參照《NY/T 1104-2006 土壤中全硒的測定》［13］，消解后采用AFS-9230 原子熒光光度計（北京吉天儀器有限公司）測定。

于拔節期采集各處理4 個重復水稻葉片，測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、抗氧化酶活性、抗氧化物質和碳氮代謝產物含量，以及硒結合蛋白基因（selenium-binding protein 1，SBP1）的相對表達量。其中，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性分別采用氮藍四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）光還原法、紫外吸收法、愈創木酚法測定［14］；類胡蘿卜素含量采用乙醇提取比色法測定，抗壞血酸含量采用2，6-二氯靛酚滴定法測定，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）顯色法測定，還原性谷胱甘肽（GSH）采用二硫代雙二硝基苯甲酸（5，5′-dithio-bis-nitrobenzoic acid，DTNB）比色定量法測定，可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸等碳氮代謝產物含量分別采用蒽酮比色法、考馬斯亮藍法、酸性茚三酮法測定［15-16］。SBP1基因采用實時熒光定量PCR 進行測定（正向引物：5′-GTATCAACCTCGTCACA AG-3′；反向引物：3′-CTTCCATAGAGACCATCCT-5′）。

于成熟期將各處理剩余4 個重復的水稻穗取下，在室內風干、考種測定水稻的實際產量。之后將各處理的水稻植株按根、莖葉和谷粒分開清洗干凈并吸干水分，將水稻植株樣品置于烘箱中105 ℃殺青30 min，最后在75 ℃下烘干至恒重，用于后續試驗分析。分別稱量水稻莖葉和根系干重，并記為地上部和根系干物質量。按公式（1）和（2）計算地上部和根系硒累積量。水稻組織硒含量測定采用微波消解-原子熒光氫化物發生法，將烘干至恒重的水稻樣品粉碎過篩，稱取0.2 g于消解罐中，依次加入4 mL 濃硝酸、1 mL 雙氧水和1 mL 去離子水進行微波消解，消解結束后再加入5 mL 1∶1的鹽酸，隨后于電熱板上加熱趕酸至澄清，在剩余溶液為2～3 mL 時停止加熱，冷卻至室溫，轉移至25 mL 容量瓶定容，采用原子熒光測定溶液中的硒含量［17］。水稻植株硒含量的分析檢測過程采用空白對照、樣品4次重復、標準曲線校正等進行數據質量控制。

1.4 數據處理

使用Sigma Plot 12.5 軟件繪圖，采用SPSS 12.0 軟件進行數據處理和方差分析，文中數據為平均值±標準誤。各處理平均值的多重比較采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 施硒對兩個水稻品種產量、地上部和根系干物質量的影響

由圖1 可知，不施硒時，兩個水稻品種的單株產量、地上部和根系干物質量均無顯著差異。施用低濃度硒（0.5 mg·kg-1）時，硒低累積水稻的單株產量和地上部干物質量較不施硒無顯著差異，但顯著提升了硒高累積水稻的產量和地上部干物質量。與不施硒相比，施用高濃度硒（25 mg·kg-1）顯著降低了兩個水稻品種的單株產量、地上部和根系干物質量，但硒低累積水稻的降幅更大，其中硒高累積水稻的單株產量和地上部干物質量顯著高于硒低累積水稻，而兩者間根系干物質量則無顯著差異。

圖1 施硒對兩個水稻品種產量、地上部和根系干物質量的影響Fig.1 Effects of selenium application on yield，shoot and root dry matter quality of two rice varieties

2.2 施硒對兩個水稻品種硒含量及累積量的影響

由圖2 可知，隨著施硒水平的提高，兩個水稻品種的谷粒、莖葉和根中硒含量均顯著增加。不施硒時，兩個水稻品種各部位硒含量無顯著差異。在0.5 mg·kg-1的施硒水平下，兩個水稻品種硒含量僅在谷粒中存在顯著性差異，且硒高累積水稻的谷粒硒含量顯著高于硒低累積水稻。當施硒水平為25 mg·kg-1時，硒高累積水稻的谷粒、莖葉和根中硒含量均顯著高于硒低累積水稻。

圖2 施硒對兩個水稻品種各組織硒含量的影響Fig.2 Effects of Selenium application on Selenium content in tissues of two rice varieties

由圖3可知，在0.5 mg·kg-1施硒水平下，兩個水稻品種的地上部和根系硒累積量與不施硒相比均顯著增加，增幅分別為226.10%、311.10% 和331.56%、348.47%，并且硒高累積水稻的地上部硒累積量顯著高于硒低累積水稻。兩個水稻品種的地上部和根系硒累積量均在25 mg·kg-1施硒水平下達到最大值，其中硒高累積水稻的地上部和根系硒累積量分別是硒低累積水稻的1.60和1.20倍。

圖3 施硒對兩個水稻品種地上部和根系硒累積量的影響Fig.3 Effects of selenium application on selenium accumulation in shoots and roots of two rice varieties

2.3 施硒對兩個水稻品種MDA含量的影響

由圖4 可知，隨著施硒水平的提高，硒低累積水稻的MDA含量顯著升高，而硒高累積水稻的MDA含量僅在25 mg·kg-1施硒水平下顯著升高。不施硒條件下兩個水稻品種的MDA 含量無顯著差異。0.5 和25 mg·kg-1施硒水平下，硒低累積水稻的MDA 含量均顯著高于硒高累積水稻。與不施硒相比，高施硒水平（25 mg·kg-1）下硒低累積水稻和硒高累積水稻的MDA 含量增幅分別為175.20 %和118.50 %。

圖4 施硒對兩個水稻品種MDA含量的影響Fig.4 Effects of Selenium application on MDA content in two rice varieties

2.4 施硒對兩個水稻品種抗氧化酶活性的影響

由圖5 可知，隨著施硒水平的提高，兩個水稻品種的SOD、POD 和CAT 活性均呈現出先升高而后降低的變化趨勢。不施硒條件下兩個水稻品種的SOD、POD和CAT 活性均無顯著差異。而0.5 和25 mg·kg-1施硒水平下兩水稻品種間的SOD、POD 和CAT 活性均存在顯著差異，且硒高累積水稻的SOD、POD 和CAT 活性顯著高于硒低累積水稻。

圖5 施硒對兩個水稻品種SOD、POD和CAT活性的影響Fig.5 Effects of selenium application on SOD，POD and CAT activities in two rice varieties

2.5 施硒對兩個水稻品種非酶類抗氧化物質含量的影響

由圖6 可知，隨著施硒水平的提高，兩個水稻品種的ASA 和CAR 含量均呈現出先升高再降低的變化趨勢，而GSH 含量則持續增加。不施硒條件下兩水稻品種間的ASA、GSH 和CAR 含量均無顯著差異。在0.5 mg·kg-1施硒水平下，硒高累積水稻的ASA、GSH和CAR 含量分別比硒低累積水稻顯著提高了16.20%、14.30%和15.80%。高施硒水平（25 mg·kg-1）下，硒高累積水稻的ASA 含量顯著高于硒低累積水稻，而CAR含量則無顯著差異。

圖6 施硒對兩個水稻品種ASA、GSH和CAR含量的影響Fig.6 Effects of selenium application on ASA，GSH and CAR contents in two rice cultivars

2.6 施硒對兩個水稻品種碳氮代謝物質含量的影響

由圖7 可知，隨著施硒水平的提高，兩個水稻品種的可溶性糖和可溶性蛋白含量均呈現出先升高后降低的變化趨勢，而脯氨酸含量則持續增加。不施硒條件下兩個水稻品種的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量均無顯著差異。當施硒水平為0.5 和25 mg·kg-1時，與硒低累積水稻相比，硒高累積水稻的可溶性糖含量均顯著增加了0.01 個百分點，可溶性蛋白含量則分別顯著增加了13.20%和24.60%。兩個水稻品種間的脯氨酸含量僅在高施硒水平下達到顯著差異，以高施硒水平下硒高累積水稻的脯氨酸含量為最高。

圖7 施硒對兩個水稻品種可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響Fig.7 Effects of selenium application on the contents of soluble sugar，soluble protein and proline in two rice varieties

2.7 施硒對兩個水稻品種硒結合蛋白基因相對表達量的影響

由圖8 可知，不施硒條件下，硒低累積水稻的硒結合蛋白基因SBP1相對表達量顯著高于硒高累積水稻，施硒整體顯著提高了硒高累積水稻的SBP1相對表達量，但降低了硒低累積水稻的SBP1相對表達量。在0.5 和25 mg·kg-1施硒水平下，硒高累積水稻的SBP1相對表達量均高于硒低累積水稻，并且在高硒水平下達到顯著差異。

圖8 施硒對兩個水稻品種SBP1相對基因表達量的影響Fig.8 Effects of selenium application on relative expression of SBP1 gene in two rice varieties

3 討論

施用適量硒可增強植物的抗氧化能力，進而提升冬小麥［18］、甜玉米［19］、谷子［20］等多種作物的產量。當硒濃度過高時，硒可作為促氧化劑介導發生氧化應激反應，導致植物代謝紊亂和生物量降低［21］。本研究發現，施用低濃度硒（0.5 mg·kg-1）對硒高累積水稻的單株產量和地上部干物質量均有顯著提升作用，但對硒低累積水稻的提升不明顯。施用高濃度硒（25 mg·kg-1）顯著降低了兩個水稻品種的單株產量和地上部干物質量，且對硒低累積水稻的降幅更大。值得注意的是，在高濃度硒水平下，硒高累積水稻的各部位硒含量及單株產量和地上部干物質量均顯著高于硒低累積水稻，這充分表明硒高累積水稻具有更強的硒適應性。不同種類植物對硒的吸收、積累能力不同，同種作物不同品種對硒的吸收、積累能力有時也存在較大差異［7］。本研究中，在25 mg·kg-1施硒水平下，硒高累積水稻的地上部、根系硒含量和硒累積量均顯著高于硒低累積水稻，說明硒高累積水稻對硒的吸收積累能力顯著高于硒低累積水稻。此外，根系的生長和形態分布是體現其吸收功能和吸收效率的重要指標之一，硒高累積水稻的根系干物質量要高于硒低累積水稻，這也可能是硒高累積水稻吸收、積累硒較多的原因之一。

在遭受脅迫時，植物組織內的活性氧（ROS）不斷累積，當ROS 累積量超過一定閾值時會對細胞結構產生不利影響［22］。丙二醛（MDA）作為判斷植物氧化應激和監測ROS 的良好生物標志物［23］，可通過測定其含量變化來推測植物受損的嚴重程度。有研究表明，水稻幼苗在不同硒濃度水溶液中培養5 d 后，其葉片MDA含量隨硒濃度的增加而顯著增加［24］。本研究結果與之相符，即兩個水稻品種的MDA 含量隨施硒水平的增加而增加。在兩個硒水平上，硒低累積水稻的MDA含量均顯著高于硒高累積水稻，表明硒高累積水稻在不同硒濃度下的氧化應激調控能力均強于硒低累積水稻。

抗氧化酶系統在緩解植物氧化脅迫方面也發揮著重要功能，SOD、CAT 和POD 等抗氧化酶能夠清除ROS，保護細胞免受氧化應激引起的損傷［25］。本研究中，施用低濃度硒能顯著提升硒高累積水稻的SOD、CAT 和POD 活性，但對硒低累積水稻影響不大。在高硒水平下，雖然兩個水稻品種的抗氧化酶活性均有所降低，但硒高累積水稻的3 種抗氧化酶活性均顯著高于硒低累積水稻，說明硒高累積水稻在高硒脅迫下具有更強的氧化脅迫緩解能力。ASA、GSH 和CAR 等非酶物質也在植物氧化應激防御中發揮重要作用［26-27］。低濃度硒提高了兩個水稻品種的ASA 含量，而高濃度硒則降低了其含量，且在兩個硒水平上硒高累積水稻的ASA 含量均顯著高于硒低累積水稻。GSH 是重要的非酶類抗氧化劑，其主要作用是清除過氧化氫和修復細胞損傷。施硒顯著提高了兩個水稻品種的GSH含量，但高硒水平下硒低累積水稻的GSH 含量高于硒高累積水稻。相關研究表明，在亞硒酸鹽及其代謝物存在的情況下，GSH 能促進ROS 的產生，過高濃度的硒也可能通過誘導GSH 含量增加及ASA 含量降低而導致ROS 過度產生，加劇硒低累積水稻的氧化應激和膜損傷［28-29］。CAR 可在光合作用中吸收并傳遞光電子，增強植物對光能的捕捉能力，同時也具備較強的抗氧化能力［30-31］。低硒水平下硒高累積水稻體內的CAR含量顯著高于硒低累積水稻，但兩個水稻品種在高硒水平下的CAR 含量無顯著差異。總體而言，硒高累積水稻擁有更強的酶類及非酶類抗氧化系統，具有更強的氧化應激調控能力。

蛋白質和糖類可為植物的生長發育提供建構物質和能量，并在脅迫開始時增強植物的免疫力。有研究表明，鎘脅迫下施用適量硒可提高芥菜體內可溶性糖和可溶性蛋白含量，為植物提供物質和能量供給，進而增強植物的抗脅迫能力［32］。本研究中，施硒處理下硒高累積水稻的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量均高于硒低累積水稻，這可能是由于硒高累積水稻能夠積極地調控水稻碳氮代謝水平，從而緩解高硒誘導的脅迫。此外，由于脯氨酸含量隨施硒水平的增加而持續增加，因此推測脯氨酸含量可作為水稻植株在硒脅迫期間的重要觀測指標。

硒結合蛋白基因（SBP1）編碼的蛋白質對硒具有結合特性，該種結合方式類似于絡合，可降低硒在植物體內的生物學活性［33］。SBP1基因的相對表達量增強，代表可以捕捉到更多活性硒，進而緩解過多的硒參與代謝過程所導致的毒害［33-35］。本研究中，施硒顯著提高了硒高累積水稻的SBP1基因相對表達量，但降低了硒低累積水稻的SBP1相對表達量，表明硒高累積水稻組織內過量的硒會更多地與硒結合蛋白結合而降低其生物學活性，進而在一定程度上緩解高硒對水稻所造成的毒害。

4 結論

本研究結果表明，在遭受硒脅迫時，硒高累積水稻擁有更高的單株產量和地上部干物質量，說明硒高累積水稻對硒的耐受性較硒低累積水稻強。硒脅迫下，硒高累積水稻擁有更強的酶類和非酶類抗氧化系統、自由基清除能力及碳氮代謝能力，能提供更多的碳氮代謝產物以維持細胞的滲透壓平衡。此外，硒高累積水稻硒結合蛋白基因（SBP1）的相對表達更強，能夠避免更多的硒參與核心代謝過程而減輕其毒害作用。綜上所述，硒高累積水稻較硒低累積水稻擁有更強的耐高硒毒害能力。