miR-519d-3p靶向HIF-1α抑制高糖誘導的人視網膜微血管內皮細胞功能障礙及血管生成

蔡 暉,宋 穎,石華宗,楊豫湘

0 引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)作為糖尿病患者眼部的最常見并發癥,是導致視力下降、甚至失明的主要原因[1]。目前全球DR患者超過9300萬,伴隨糖尿病發病率的持續攀升和發病年齡逐漸年輕化,DR已成為全球性的公共衛生問題。目前針對DR的治療方法,如抗血管內皮生長因子藥物的使用、玻璃體內注射類固醇激素、激光光凝和手術治療等,雖然可以部分緩解疾病進展,但療效仍不能令人滿意[2]。DR的主要病理變化是視網膜微血管病變,與高糖誘導的人視網膜微血管內皮細胞(human retinal microvascular endothelial cells,HRMEC)功能障礙和血管生成增加密切相關。因此,如何逆轉HRMEC功能障礙和抗血管生成是眼科專業領域亟需解決的關鍵問題。作為一類非編碼RNA,微小核糖核酸(microRNA,miRNA)參與多種病理生理過程,包括調節細胞增殖、凋亡、分化和各種代謝過程,維持干細胞的干性潛能,參與炎癥和免疫反應等[3]。近期研究發現,miR-519d-3p參與調控腫瘤進展、骨關節炎和心肌梗死等疾病進展[4-6],但在DR中的研究較少。本團隊前期已報道,低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor 1 subunit alpha,HIF-1α)在視網膜內皮細胞增殖、炎癥、血管生成等方面具有重要作用[7],但調控HIF-1α的miRNA尚不清楚。基于生物信息學分析推測HIF-1α可能是miR-519d-3p的靶基因,值得對該現象進行進一步研究。基于以上依據,本研究采用高糖誘導HRMEC制作細胞模型,旨在明確miR-519d-3p對高糖誘導的HRMEC功能障礙和血管生成的影響,并闡明其對HIF-1α的調控機制,以期從細胞層面證實miR-519d-3p/HIF-1α軸在DR中的重要作用。

1 材料和方法

1.1 材料HRMEC,由中山大學中山眼科中心提供;內皮細胞培養基(1001)、胎牛血清、生長因子、青霉素/鏈霉素溶液,上海中喬新舟生物科技有限公司;D-(+)-葡萄糖(ST1228)、細胞增殖/毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)(C0038)、Hoechst 33342染色試劑盒(C1029),上海碧云天生物技術公司;陰性對照模擬物(5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)、miR-519d-3p模擬物(5’-CAAAGUGCCUCCCUUUAGAGUG-3’)、HIF-1α過表達載體[將HIF-1α mRNA(NM_001530.4)編碼區序列插入pcDNA3.1(+)載體構建],上海吉瑪基因公司;Lipofectamine 3000轉染試劑盒(L3000-015),美國賽默飛世爾科技公司;實時熒光定量PCR檢測試劑盒(638315),北京寶日醫生物技術公司;HIF-1α抗體(ab179483)、β-肌動蛋白(β-actin)(ab8227)抗體,上海艾博抗公司;酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)相關人腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)檢測試劑盒(EH0302)、人白細胞介素(interleukin,IL)-1β檢測試劑盒(EH0185)、人IL-6檢測試劑盒(EH0201),武漢菲恩生物科技有限公司;Matrigel基質膠(354234),美國康寧公司;HIF-1α野生型報告載體[包含miR-519d-3p結合位點(HIF-1α-wt)]、HIF-1α突變型報告載體[不包含miR-519d-3p結合位點(HIF-1α-mut)],廣州伯信生物科技公司;熒光素酶報告基因檢測試劑盒(E1910),美國普洛麥格公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養HRMEC復蘇后采用內皮細胞培養基進行培養,培養箱條件設定為37℃、5% CO2、95%空氣。當細胞生長至約90%融合時,用0.25%胰蛋白酶消化細胞,按1∶4傳代培養。當細胞傳至2～3代后,取生長狀態良好的細胞進行實驗。

1.2.2 制作高糖細胞模型將D-(+)-葡萄糖用適量PBS溶液配制成5、30mmol/L濃度。取HRMEC在6孔板中鋪板,每孔細胞數約為5×106個。向細胞中分別加入5、30mmol/L濃度葡萄糖培養48h,建立正常(NG)和高糖(HG)細胞模型。

1.2.3 實驗分組和細胞轉染對照組:HG細胞模型轉染陰性對照模擬物;甘露醇組:在對照組基礎上加入25mmol/L甘露醇;miR-519d-3p過表達組:HG細胞模型轉染miR-519d-3p模擬物;miR-519d-3p聯合HIF-1α過表達組:HG細胞模型共轉染miR-519d-3p模擬物和HIF-1α過表達載體。取HRMEC在6孔板中鋪板,每孔細胞數約為5×106個,培養過夜。當細胞生長至約70%～90%融合時,利用Lipofectamine 3000轉染試劑進行細胞轉染。對照組、甘露醇組、miR-519d-3p過表達組、miR-519d-3p聯合HIF-1α過表達組分別轉染100pmol陰性對照模擬物、100pmol陰性對照模擬物、100pmol miR-519d-3p模擬物、50pmol miR-519d-3p和2.0μg HIF-1α過表達載體。繼續培養24h后,收集細胞供后續使用。

1.2.4 實驗指標

1.2.4.1 實時熒光定量PCR法檢測各組miR-519d-3p的表達情況提取各組細胞總RNA,并逆轉錄為cDNA。利用cDNA作為模版在ABI 7100熒光定量PCR儀上進行擴增反應。擴增條件為:95℃ 20min,隨后95℃ 10s,58℃ 30s,72℃ 30s,共40個循環。miR-519d-3p引物:5’- CAAAGTGCCTCCCTTTAGAGTG -3’(正向),5’- CGCAGGGTCCGAGGTATTC -3’(反向); U6引物:5’- CTCGCTTCGGCAGCACA -3’( 正向),5’- AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’( 反向)。以U6為內參對照,采用2-ΔΔCt法計算各組中miR-519d-3p的相對表達水平。

1.2.4.2Westernblotting法檢測各組HIF-1α蛋白的表達情況采用RIPA蛋白裂解液提取各組細胞總蛋白,BCA法測定總蛋白濃度。取40μg總蛋白依次進行電泳、轉膜和封閉過程。隨后加入HIF-1α抗體(1∶1000稀釋)4℃過夜,以β-actin抗體(1∶10000稀釋)為內參對照。第2d利用辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗(1∶5000)37℃孵育1h后,暗室添加超敏發光液并曝光膠片。利用Quantity-one軟件對蛋白條帶進定量分析,計算HIF-1α蛋白的相對表達水平。

1.2.4.3 熒光素酶報告基因實驗檢測miR-519d-3p和HIF-1α的結合位點情況取對照組和miR-519d-3p過表達組細胞在24孔板中鋪板,每孔細胞數約為2×105個,培養過夜。利用Lipofectamine 3000轉染試劑向細胞中分別轉染0.8μg HIF-1α-wt和0.8μg HIF-1α-mut報告載體。培養24h后,裂解細胞,利用熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定各組螢火蟲熒光值和海腎熒光值。以螢火蟲熒光值為內參對照,計算相對熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=(海腎熒光值/螢火蟲熒光值)×100%。

1.2.4.4CCK-8法檢測各組細胞增殖情況取各組細胞在96孔板中鋪板,每孔細胞數約為7×103個。培養24、48、72h后分別向細胞中加入12μL CCK-8溶液,繼續培養3h。采用多功能酶標儀測定各組450nm波長時的吸光度(A)值。

1.2.4.5Hoechst33342染色法檢測各組細胞凋亡情況取各組細胞在24孔板細胞爬片中鋪板,每孔細胞數約為2×105個,培養48h。取出細胞爬片,采用4%多聚甲醛37℃固定30min,并以5%牛血清白蛋白37℃封閉1.5h。利用Hoechst 33342溶液在暗室中染色2min,通過熒光顯微鏡觀察凋亡細胞,并計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=[凋亡細胞數量(5個隨機視野)/總細胞數量(5個隨機視野)]×100%。

1.2.4.6ELISA法檢測各組細胞外液TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的表達情況取各組細胞在24孔板中鋪板,每孔細胞數約為2×105個,培養48h。收集各組細胞外液,將細胞外液加入反應板中37℃孵育1h,并加入生物素化抗體工作液37℃孵育1h。隨后加入酶結合物工作液37℃避光孵育30min。最后加入顯色底物37℃避光孵育15min。通過多功能酶標儀分析各組450nm波長下的A值,對比標準曲線,計算TNF-α、IL-1β、IL-6濃度。

1.2.4.7 小管形成實驗檢測各組新生毛細血管管腔樣結構形成情況將24孔板用Matrigel基質膠均勻鋪墊,放置30min使其硬化。取各組細胞在24孔板中鋪板,每孔細胞數約為2×105個,培養24h。采用倒置顯微鏡觀察新生毛細血管樣結構形成情況。采用Image-J軟件計算各組單個視野下新生毛細血管管腔樣結構數量。

2 結果

2.1NG和HG細胞模型中miR-519d-3p和HIF-1α蛋白的表達情況比較實時熒光定量PCR法檢測NG和HG細胞模型中miR-519d-3p的表達水平分別為0.039±0.005和0.022±0.003,且與NG比較,HG中miR-519d-3p表達水平顯著減少,差異有統計學意義(t=9.62,P<0.01)。Western blotting法檢測NG和HG細胞模型中HIF-1α蛋白的表達水平分別為0.104±0.009和0.627±0.044,且與NG比較,HG中HIF-1α蛋白表達水平顯著增加,差異有統計學意義(t=26.53,P<0.01),見圖1。

圖1 Western blotting法檢測NG和HG細胞模型中HIF-1α蛋白的表達情況。

2.2 各組細胞中miR-519d-3p和HIF-1α蛋白的表達情況比較實時熒光定量PCR法檢測各組細胞中miR-519d-3p的表達情況比較,差異有統計學意義(F=171.89,P<0.01),且與對照組比較,miR-519d-3p過表達組和miR-519d-3p聯合HIF-1α過表達組細胞中miR-519d-3p表達水平均顯著增加,差異有統計學意義(t=38.90、29.16,均P<0.01)。Western blotting法檢測各組細胞中HIF-1α蛋白的表達情況比較,差異有統計學意義(F=126.53,P<0.01),且與對照組比較,miR-519d-3p過表達組細胞中HIF-1α蛋白表達水平顯著減少,而miR-519d-3p聯合HIF-1α過表達組細胞中HIF-1α蛋白表達水平顯著增加,差異有統計學意義(t=16.21、44.72,均P<0.01)。對照組和甘露醇組細胞中miR-519d-3p和HIF-1α蛋白的表達情況比較,差異無統計學意義(t=0.17、0.13,均P>0.05),見圖2,表1。

表1 各組細胞中miR-519d-3p和HIF-1α蛋白的表達情況比較

圖2 Western blotting法檢測各組細胞中HIF-1α蛋白的表達情況 A:對照組;B:甘露醇組;C:miR-519d-3p過表達組;D:miR-519d-3p聯合HIF-1α過表達組。

2.3miR-519d-3p和HIF-1α的結合位點檢測生物信息學分析顯示,HIF-1α可能是miR-519d-3p的靶基因,miR-519d-3p中“CGUGAAA”序列可以與HIF-1α 3’-非編碼區(3’-UTR)中“GCACUUU”序列特異性結合,見圖3。熒光素酶報告基因實驗檢測對照組和miR-519d-3p過表達組細胞中HIF-1α-wt載體的相對熒光素酶活性分別為5.237±0.485和2.309±0.183,且與對照組比較,miR-519d-3p過表達組細胞中HIF-1α-wt載體的相對熒光素酶活性顯著減少,差異有統計學意義(t=10.44,P<0.01);對照組和miR-519d-3p過表達組細胞中HIF-1α-mut載體的相對熒光素酶活性分別為5.081±0.357和4.837±0.392,差異無統計學意義(t=0.497,P>0.05)。

圖3 miR-519d-3p和HIF-1α 3’-UTR之間的結合位點預測。

2.4 各組細胞增殖和凋亡情況比較CCK-8法檢測各組細胞A值(24、48、72h)比較,差異有統計學意義(F=39.57、28.29、52.14,均P<0.01)。Hoechst 33342染色法檢測各組細胞凋亡率比較,差異有統計學意義(F=74.46,P<0.01)。與對照組比較,miR-519d-3p過表達組細胞24、48、72h A值均顯著增加,細胞凋亡率顯著減少,差異有統計學意義(t=14.19、17.23、9.88、26.07,均P<0.01)。與miR-519d-3p過表達組比較,miR-519d-3p聯合HIF-1α過表達組細胞24、48、72h A值均顯著減少,細胞凋亡率顯著增加,差異有統計學意義(t=4.65、8.41、5.32、32.02,均P<0.01)。對照組和甘露醇組細胞24、48、72h A值和細胞凋亡率比較差異無統計學意義(t=0.01、0.18、0.06、0.77,均P>0.05),見圖4,表2。

表2 各組細胞不同時間點細胞增殖和凋亡率比較

圖4 Hoechst 33342染色法檢測各組細胞凋亡情況 A:對照組;B:甘露醇組;C:miR-519d-3p過表達組;D:miR-519d-3p聯合HIF-1α過表達組。

2.5 各組細胞外液炎癥因子表達和血管生成情況比較ELISA法檢測各組細胞外液TNF-α、IL-1β、IL-6濃度比較,差異有統計學意義(F=65.59、74.91、57.88,均P<0.01)。小管形成實驗檢測各組中新生毛細血管管腔樣結構數量比較,差異有統計學意義(F=163.50,P<0.01)。與對照組比較,miR-519d-3p過表達組中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度均顯著減少,新生毛細血管管腔樣結構數量顯著減少,差異有統計學意義(t=14.94、25.28、7.29、16.19,均P<0.01)。與miR-519d-3p過表達組比較,miR-519d-3p聯合HIF-1α過表達組中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度均顯著增加,新生毛細血管管腔樣結構數量顯著增加,差異有統計學意義(t=7.32、17.05、26.81、6.34,均P<0.01)。對照組和甘露醇組中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度和新生毛細血管管腔樣結構數量比較,差異無統計學意義(t=0.20、0.32、0.55、0.17,均P>0.05),見圖5,表3。

表3 各組細胞外液炎癥因子表達和血管生成情況比較

圖5 小管形成實驗檢測各組新生毛細血管管腔樣結構形成情況 A:對照組;B:甘露醇組;C:miR-519d-3p過表達組;D:miR-519d-3p聯合HIF-1α過表達組。

3 討論

DR基本病理變化包括周細胞選擇性缺失、毛細血管基底膜增厚、微血管瘤形成、內皮細胞增殖及新生血管導致的視網膜脫離。HRMEC在維持視網膜毛細血管的完整性方面發揮重要作用,高糖引起HRMEC功能障礙,破壞血-視網膜屏障,導致視網膜出血、滲出、脫離,促進DR的發生和惡化。研究發現,多種因素可以引起HRMEC功能障礙,如高級糖基化終產物積累、過氧化物酶體增殖體激活受體γ的失活、慢性炎癥、氧化應激異常、生長因子及細胞因子表達失調等[8]。此外,高糖還會影響負責表觀遺傳修飾和非編碼RNA功能的酶的活性,導致非編碼RNA表達異常。近年來,miRNAs因其廣泛的調節功能而受到青睞,目前已發表的8篇相關論文共報道了93個miRNAs在DR患者和非DR患者中呈差異表達,如miR-27b、miR-320a、miR-423-5p等[9],闡明這些miRNAs的作用機制將為DR治療提供新的線索。HG誘導HRMEC細胞模型是研究DR的常用體外模型,可用于研究該病的分子機制及防治策略。本研究發現,高糖誘導HRMEC模型中miR-519d-3p表達下調,與既往文獻[5]報道一致,表明結果可信。隨后本研究通過一系列細胞實驗證實,miR-519d-3p可以減輕高糖誘導的HRMEC功能障礙并抑制血管生成。

高糖可以引起視網膜內皮細胞的增殖失調,加速DR進展。同時,高糖還能誘導視網膜血管內皮細胞凋亡增加,而用抗氧化酶處理能保護細胞免受氧化應激,并降低細胞凋亡。研究顯示,炎癥因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6在DR進展中起著重要作用[10]。持續的高血糖導致視網膜缺血性改變,刺激血管內皮生長因子釋放,最終促進新生血管生成。近年研究表明,一些異常表達的miRNAs在DR的發生發展中發揮重要作用,如miR-15b、miR-181、miR-373、miR-425-5p等,利用這些miRNAs有望開發DR治療的新靶點[11-14]。miR-519d-3p位于人基因組19q13.42區域,參與調控細胞增殖、凋亡和炎癥等過程。本研究利用miR-519d-3p模擬物在高糖誘導的HRMEC模型中成功過表達miR-519d-3p,經CCK-8法和Hoechst 33342染色法發現,miR-519d-3p過表達組細胞24、48、72h吸光度值較對照組均顯著增加,而細胞凋亡率較對照組顯著減少。該結果與miR-519d-3p在其他類型細胞中的功能一致,提示miR-519d-3p在DR中具有促進細胞增殖作用。經ELISA法檢測發現,miR-519d-3p過表達組細胞外液TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度較對照組均顯著減少,提示miR-519d-3p在DR中具有抗炎作用。這一結果與miR-519d-3p在初級成纖維細胞中促炎作用相悖,具體原因有待進一步考究。此外,小管形成實驗結果顯示,miR-519d-3p過表達組新生毛細血管管腔樣結構數量較對照組顯著減少,與既往文獻[4]報道一致,提示miR-519d-3p在DR中具有抗血管生成作用。基于以上結果,可以得出miR-519d-3p在DR發生和發展中均具有重要作用。

眾多研究表明,miRNAs參與負性調控目的基因表達,其作用方式主要通過與目的基因3’-UTR中特定核苷酸序列結合,進而導致轉錄或翻譯過程抑制。經TargetScan 8.0(https://www.targetscan.org/vert_80/)、miRDB(https://mirdb.org/)、miRTarBase 7.0(https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/)數據庫預測miR-519d-3p調控的目的基因,發現HIF-1α預測分數較高,推測HIF-1α可能是miR-519d-3p的靶基因。先前關于胰腺導管腺癌細胞與子宮內膜上皮細胞的研究中也曾報道,miR-519d-3p對HIF-1α具有負調控作用[15-16]。本研究發現,miR-519d-3p過表達組中HIF-1α蛋白表達水平較對照組顯著減少,提示miR-519d-3p對HIF-1α具有負調控作用。隨后經熒光素酶報告基因實驗驗證miR-519d-3p中“CGUGAAA”序列可與HIF-1α中“GCACUUU”序列特異性結合,提示HIF-1α是miR-519d-3p的靶基因。

HIF-1α蛋白分子量約為92kDa,作為腫瘤治療中的一個明星分子靶點,其廣泛參與細胞增殖和凋亡、腫瘤轉移、血管生成及葡萄糖代謝等過程[17]。近年來,HIF-1α被報道與糖尿病及其并發癥的發生和發展密切相關。Ilegems等[18]研究揭示HIF-1α可以介導糖尿病小鼠模型中胰島β細胞的損傷,而其抑制劑PX-478則可改善胰島β細胞的胰島素分泌指數。Zhang等[19]發現DR小鼠模型中視網膜血管生成與HIF-1α水平的增加密切相關,沉默HIF-1α可以降低血管內皮生長因子的表達,并以時間依賴的方式抑制血管生成。Jiang等[20]報道HIF-1α通過血紅素氧合酶1介導的對線粒體動態控制可以改善糖尿病腎病的腎小管損傷。本研究發現,miR-519d-3p聯合HIF-1α過表達組細胞24、48、72h 吸光度值較miR-519d-3p過表達組均顯著減少,細胞凋亡率較miR-519d-3p過表達組顯著增加,細胞外液TNF-α、IL-1β、IL-6濃度較miR-519d-3p過表達組均顯著增加,新生毛細血管管腔樣結構數量較miR-519d-3p過表達組顯著增加,與既往文獻[19]報道結果一致,提示HIF-1α可以逆轉miR-519d-3p的作用。由此得出,HIF-1α是miR-519d-3p發揮功能的關鍵下游分子,miR-519d-3p/HIF-1α通路在DR發生和發展中均具有重要作用。

綜上所述,高糖誘導HRMEC模型中miR-519d-3p表達下調,而HIF-1α蛋白表達上調。HIF-1α是miR-519d-3p的靶基因。miR-519d-3p靶向HIF-1α增加細胞增殖并降低細胞凋亡和炎癥反應,從而減輕高糖誘導的HRMEC功能障礙并抑制血管生成。本研究尚存幾點不足:(1)由于本研究不涉及組織樣本,故未能檢測miR-519d-3p和HIF-1α表達水平的相關性;(2)未能從基因干擾層面觀察沉默miR-519d-3p對高糖誘導的HRMEC功能障礙和血管生成的影響;(3)未能使用HIF-1α抑制劑佐證miR-519d-3p/HIF-1α通路的功能。