血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表達水平與糖尿病性黃斑水腫程度的相關性

龐久彥,寇姣姣,康 平,王冬梅,周 玉

0 引言

糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)是糖尿病患者最常見的威脅視力的并發癥,其能夠引起高滲透性視網膜毛細血管產生的細胞外液水平增加,造成黃斑增厚,導致糖尿病視網膜病變和視力喪失[1]。大約25%的2型糖尿病患者在首次診斷后10a內發展為DME[2]。不同嚴重程度DME治療方法有所不同[3],因此迫切需要尋找與DME嚴重程度相關的因子,從而為臨床治療提供針對性意見。微小RNA(miRNA)是高度保守的內源性ncRNAs的短序列(約22個核苷酸長),參與許多重要生物過程(包括細胞生長、分化和凋亡)[4]。miRNA具有很長的半衰期,并且已經發現其在許多生物液體中是穩定的,包括人血清、血漿、尿液、唾液、眼淚、房水和玻璃體液等[5]。miR-377-3p對多種疾病的發展有抑制作用,如后囊混濁[6]、糖尿病腎病[7]等。miR-365-3p與糖尿病視網膜病變相關[8-9]。關于miR-377-3p和miR-365-3p與DME嚴重程度相關性的研究目前并不多見,因此本研究通過檢測不同嚴重程度DME患者血清及房水中miR-377-3p和miR-365-3p表達水平,研究其與DME嚴重程度的相關性。

1 對象和方法

1.1 對象前瞻性研究。選取2021-02/2022-02三六三醫院收治的初診為DME患者60例60眼(如雙眼發病取嚴重眼入組,若兩眼程度一致取右眼)。納入標準:(1)均診斷為2型糖尿病并伴有黃斑水腫,黃斑水腫符合以下要求:1)距黃斑中心凹500μm內視網膜增厚;2)距黃斑中心凹500μm內硬性滲出伴相鄰視網膜增厚;3)距黃斑中心1個視盤直徑范圍內超過1個視盤大小的視網膜增厚;(2)根據糖尿病視網膜病變和相關黃斑水腫的國際臨床分類標準[10]對DME患者進行分組,輕度組24眼:視網膜后極部可見部分厚度增加及硬性滲出,距黃斑中心較遠(大于1倍ODD半徑圓形區域);中度組21眼:視網膜后極部可見一定程度部分厚度增加,硬性滲出靠近黃斑中心,但未及1/3～1倍ODD環形區域;重度組15眼:視網膜厚度增加明顯,滲出累及黃斑中心;(3)臨床資料齊全;(4)最佳矯正視力(BCVA)為0.05～0.5;排除標準:(1)既往玻璃體腔注藥史、全視網膜光凝史、閉角性青光眼病史;(2)1a內腦梗塞病史、心機梗塞病史;(3)其他因素引起的黃斑水腫,如視網膜靜脈阻塞、葡萄膜炎、高血壓視網膜病變,脈絡膜新生血管,藥物及內眼手術等。 另選同期本院收治的未發生DME的2型糖尿病患者60例作為對照組。對照組均診斷為2型糖尿病,無眼底病變,臨床資料齊全,排除標準同DME組。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則,經醫院倫理委員會批準同意[倫理批號:(2021)科研倫審第(045)號]。所有患者及家屬均知情同意并簽署同意書。

1.2 方法收集所有受試者基本臨床資料,包括BMI、吸煙史、飲酒史、高血壓、高血脂、糖尿病病程。全自動生化分析儀檢測空腹血糖,全自動糖化血紅蛋白分析儀檢測糖化血紅蛋白,酶法測定同型半胱氨酸(Hcy)。

1.2.1 采集血清樣本所有受試者采集清晨空腹肘靜脈血6mL,以3000r/min的速度離心10min,取上層血清,置于EP管中,-80℃冰箱存儲,待檢。

1.2.2 采集房水樣本使用30號針頭于角膜緣(角虹膜緣3.5～4mm處進針)刺入前房,通過透明角膜穿刺術收集DME患者約0.10mL房水。將房水樣品收集在無菌EP管中,2h內進行下一步處理,3000r/min離心10min以防止細胞/細胞碎片污染,取離心后上清液于-80℃儲存,所有操作均在無菌環境下進行。

1.2.3qRT-PCR法檢測miR-377-3p和miR-365-3p表達水平使用RNA提取試劑盒(Aldrich,USA)提取總RNA。使用高容量cDNA逆轉錄試劑盒(Applied Biosystems,USA)將提取的RNA合成cDNA。使用cDNA和SYBR green dye(Applied Biosystems,USA)進行qRT-PCR反應分析,反應體系:10μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ,0.2μL正向引物,0.2μL反向引物,0.4μL ROX Reference Dye Ⅱ,6.0μL ddH2O;擴增條件:95℃ 90s,95℃ 30s、63℃ 30s、72℃ 30s共循環40次,使用U6作為內參基因,引物序列見表1。各樣品重復3次,取平均值,使用2-ΔΔCt方法(Ct為循環閾值)計算目的基因miR-377-3p、miR-365-3p的相對表達量。

表1 引物序列

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較DME組患者60例其中男35例,女25例,年齡50～70(平均50.72±10.20)歲。對照組患者60例其中男33例,女27例,年齡51～71(平均51.35±11.32)歲,DME組患者糖尿病病程、糖化血紅蛋白、空腹血糖、Hcy均顯著高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者血清中miR-377-3p和miR-365-3p表達水平比較DME組患者血清中miR-377-3p(0.67±0.18)和miR-365-3p(0.59±0.16)表達水平均低于對照組(1.01±0.21,1.00±0.32),差異均有統計學意義(t=9.522,8.877,均P<0.01)。

2.3 不同嚴重程度DME患者血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表達水平及CMT比較DME組患者房水中miR-377-3p為0.35±0.11,miR-365-3p為0.46±0.13。DME組中輕度組24眼;中度組21眼;重度組15眼。不同嚴重程度DME患者血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表達水平及CMT比較差異均有統計學意義(P<0.01)。重度組患者血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表達水平顯著低于中度組和輕度組,中度組顯著低于輕度組,差異均有統計學意義(P<0.05);重度組CMT顯著高于中度組和輕度組,中度組顯著高于輕度組,差異均有統計學意義(P<0.05),見表3。

表3 不同嚴重程度DME患者血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表達水平及CMT比較

2.4DME組患者血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表達水平與CMT的相關性DME組患者血清中miR-377-3p和miR-365-3p表達水平與CMT呈負相關(r=-0.342、-0.374,均P<0.05);房水中miR-377-3p和miR-365-3p表達水平與CMT呈負相關(r=-0.425、-0.503,均P<0.05)。

2.52型糖尿病患者發生DME的多因素Logistic回歸分析以2型糖尿病患者是否發生DME為因變量,單因素分析中有差異的糖尿病病程、糖化血紅蛋白、空腹血糖、Hcy及血清中miR-377-3p和miR-365-3p表達水平為自變量進行多因素Logistic回歸分析,結果見表4,糖尿病病程、空腹血糖及Hcy增加是2型糖尿病患者發生DME的危險因素,血清中miR-377-3p和miR-365-3p是2型糖尿病患者發生DME的保護因素(P<0.05)。

表4 多因素Logistic回歸分析

3 討論

DME發生的主要原因是黃斑增厚,其是糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)患者視力喪失的最常見原因,隨著2型糖尿病的全球流行,其患病率不斷增加[11-12]。其病理生理學始于視網膜氧分壓降低,表現為由血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和視網膜血管自動調節介導的視網膜毛細血管通透性增高和血管內壓升高[13]。在本研究中,糖尿病病程及Hcy均是2型糖尿病患者發生DME的危險因素,這與Hsieh等[14]的研究結果類似,這可能是因為糖尿病患者長期高血糖會影響DME的發展,Hcy在DME發生、發展中的機制尚不明確,可能與Hcy參與損傷血管內皮細胞,導致微血管損傷相關[15]。

DME發病機制復雜,可能與長期高血糖及血糖相關的高滲透損傷視網膜微血管相關[14]。糖尿病患者長期高血糖導致內層視網膜灌注減少和內層視網膜氧張力降低、毛細血管承受的血管內壓力升高從而損害毛細血管,同時,視網膜氧張力的降低上調VEGF和其他滲透性因子的合成,從而增加了微血管滲漏,細胞外液通過人視網膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)細胞的泵送作用重新進入更下游的視網膜血管或穿過脈絡膜而被吸收[13]。Huai等[6]發現,沉默miR-377-3p能夠逆轉姜黃素對晶狀體上皮細胞的保護作用,而miR-377-3p的上調能夠抑制TGF-β2誘導的晶狀體上皮細胞惡性變化。在本研究中,DME組患者血清中miR-377-3p水平明顯低于對照組,與Jiang等[16]的研究具有一致性,提示miR-377-3p與DME的發生有關,分析原因為VEGF是參與調節血管生成和血管通透性的重要因子,在高糖環境下,VEGF過度表達導致RPE細胞增殖,同時促進血管生成和血管通透性[17],從而引起DME,而VEGF是miR-377-3p的靶基因,MTT分析顯示miR-377-3p過表達導致RPE細胞增殖顯著減少,且miR-377-3p是DME的診斷標志物[16]。進一步比較不同嚴重程度DME患者miR-377-3p水平并分析發現,miR-377-3p水平隨DME患者病情程度增加而降低,提示miR-377-3p與DME患者病情嚴重程度有關,可能參與DME病情發展。為驗證推測,進行了相關性分析,發現miR-377-3p水平與CMT呈負相關,且miR-377-3p是2型糖尿病患者發生DME的保護因素,提示miR-377-3p可能參與2型糖尿病患者DME的發生發展且具有正向調控作用。

許多研究發現miRNA在某些眼部疾病患者中存在差異表達,有證據表明,miRNA在血清、玻璃體等中的表達水平與眼內病理狀況有關,針對影響視網膜的糖尿病并發癥,已發現一些miRNA在玻璃體和血清樣本中表達差異,如miR-145、miR-92a和miR-375,且其有作為生物標志物或視網膜病變治療資源的潛力[18]。miRNA在調節幾個重要的生物學途徑和細胞功能中是必不可少的,研究表明,血清miRNA能夠作為各種疾病的生物標志物,包括DR、DME[19]。據報道,多種miRNA與糖尿病患者DME有關:通過PCR陣列檢測84個miRNA,Cho等[20]發現,與白內障患者相比,DME患者房水中59種miRNA的表達顯著下調,Grieco等[19]研究表明,DME患者血漿及房水中miR-365-3p顯著下調,miR-365是糖尿病的潛在治療靶點,它能夠作為內分泌信號分子和潛在疾病生物標志物一樣發揮作用[20]。在本研究中,DME組血清miR-365-3p水平顯著低于對照組,與Grieco等[19]的研究具有一致性,提示miR-365-3p參與了2型糖尿病患者DME的發生過程,進一步比較分析發現,DME患者病情越嚴重,miR-365-3p水平越低,提示miR-365-3p可能與DME患者的病情進展有關,其可能正向調控DME病情,為驗證推測,進行了相關性分析,發現miR-365-3p水平與CMT呈負相關,且miR-365-3p是2型糖尿病患者發生DME的保護因素,驗證了我們的推測,提示miR-365-3p可能是2型糖尿病患者發生發展的重要正向調控因子。

綜上所述,miR-377-3p、miR-365-3p在DME患者血清中低表達,與DME患者嚴重程度呈負相關,臨床用來評估DME患者病情嚴重程度可能具有一定價值,或可依據miR-377-3p、miR-365-3p水平在DME患者血清和房水中的動態變化及時進行不同階段的針對性治療。但本研究納入樣本量相對較少、地域性較強,并且缺乏動態監測數據,后續將擴大樣本納入范圍繼續研究。