糖尿病視網膜病變患者血清circFTO和miR-141-3p表達情況及其與病變分期的關系

田 濤,劉 茹,彭婧利,鄺國平,周小平,姚曉喜

0 引言

中國是受糖尿病影響人數最多的國家,糖尿病可能導致心血管、腦血管、神經性、腎病、視網膜病和足部疾病,給醫療系統帶來了巨大負擔[1]。糖尿病不僅會影響血管自動調節,也會損害微血管系統,尤其是視網膜和視神經[2]。其中糖尿病視網膜病變是糖尿病常見的微血管并發癥,也是造成視力下降的主要原因[3]。因此,糖尿病視網膜病變的早期檢測有助于預防和治療。環狀RNA(circRNA)在眼部疾病中的作用引起了越來越多的關注,其中circFTO(又稱circ_0005941)可通過上調硫氧還蛋白相互作用蛋白促進血管生成并損害血視網膜屏障[4]。微小RNA-141-3p(microRNA-141-3p,miR-141-3p)可通過抑制含有sushi結構域的蛋白2促進視網膜母細胞瘤患者的疾病進展[5]。本研究旨在檢測不同疾病分期糖尿病視網膜病變患者血清circFTO、miR-141-3p水平變化,探討二者水平與疾病進展的關系。

1 對象和方法

1.1 對象選取2019-10/2022-11本院收治的198例2型糖尿病患者為研究對象,患者年齡36～78歲,根據我國糖尿病視網膜病變診療指南將患者分為非糖尿病視網膜病變(nondiabetic retinopathy,NDR)組70例、非增殖期糖尿病視網膜病變(nonproliferative diabetic retinopathy,NPDR)組66例、增殖期糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)組62例;同期選取67例本院體檢正常的志愿者作為對照組,年齡34～78歲。納入標準:(1)患者分期符合《我國糖尿病視網膜病變診療指南(2014年)》[6]及中華醫學會糖尿病視網膜病變分期標準;(2)視網膜病變患者眼底檢查發現視網膜有出血、滲血、新生血管等;(3)未合并糖尿病腎病、糖尿病周圍神經病變等其他糖尿病微血管病變者。排除標準:(1)急慢性感染、血液系統疾病、肝腎等臟器功能障礙者;(2)有高血壓視網膜病變及其他引起視網膜出血的眼底病變者;(3)已行視網膜激光光凝術者;(4)合并惡性腫瘤疾病、嚴重心腦血管疾病者。本研究受試者均簽署知情同意書,通過本院臨床研究倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集收集四組年齡、性別、體質量指數(BMI)、病程、吸煙史、飲酒史、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)。

1.2.2 血清circFTO和miR-141-3p水平檢測采集空腹5mL外周靜脈血樣,室溫放置一段時間后,離心機3500r/min轉速離心處理10min,保留上層血清置于-80℃保存待測。采用RNA提取試劑盒(北京康潤誠業生物科技有限公司,P118)提取血清中的RNA,使用cDNA第一鏈合成試劑盒(北京賽百盛基因技術有限公司,貨號:FFS-25)將RNA反轉錄為cDNA,引物序列見表1,采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法檢測血清circFTO和miR-141-3p水平。配制反應體系后依照以下程序反應:95℃預熱3min;95℃ 15s,60℃ 15s,72℃ 15s,重復40個循環。反應結束后根據循環曲線分析CT值,分別以GAPDH和U6為內參,采用2-ΔΔCT法計算circFTO和miR-141-3p相對表達量,引物由北京華大基因公司合成。

表1 引物序列

2 結果

2.1 四組一般資料比較四組年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史、TG、TC、LDL-C比較,差異無統計學意義(均P>0.05)。PDR組SBP、DBP高于對照組、NDR組、NPDR組,HDL-C低于對照組、NDR組、NPDR組(均P<0.05)。NDR組、NPDR組、PDR組FPG、HbA1c高于對照組(均P<0.05)。PDR組病程高于NDR組、NPDR組(均P<0.05),見表2。

表2 四組一般資料比較

2.2 四組血清circFTO和miR-141-3p水平比較PDR組血清circFTO水平顯著高于對照組、NDR組、NPDR組,miR-141-3p水平顯著低于對照組、NDR組、NPDR組(均P<0.05),見表3。

表3 四組血清circFTO和miR-141-3p水平比較

2.3 糖尿病視網膜病變患者血清circFTO和miR-141-3p與各指標間的相關性Pearson相關分析結果顯示,糖尿病視網膜病變患者血清circFTO與miR-141-3p呈負相關(r=-0.450,P<0.05),見圖1。糖尿病視網膜病變患者血清circFTO、miR-141-3p與年齡、BMI、病程、TG、TC、LDL-C、HDL-C無顯著相關性(均P>0.05)。circFTO與SBP、DBP、FPG、HbA1c呈正相關(均P<0.05),miR-141-3p與SBP、DBP、FPG、HbA1c呈負相關(均P<0.05),見表4。

圖1 糖尿病視網膜病變患者血清circFTO與miR-141-3p的相關性。

表4 糖尿病視網膜病變患者血清circFTO和miR-141-3p與各指標間的相關性

2.4 糖尿病視網膜病變影響因素的多因素Logistic回歸分析將糖尿病視網膜病變是否發生(賦值:0=否,1=是)作為因變量,以circFTO、miR-141-3p、SBP、DBP、FPG、HbA1c為自變量進行多因素Logistic回歸分析(逐步回歸進行變量篩選),結果表明,circFTO是影響糖尿病視網膜病變的危險因素,miR-141-3p是影響糖尿病視網膜病變的保護因素(P<0.05),見表5。

表5 糖尿病視網膜病變影響因素的多因素Logistic回歸分析

3 討論

根據疾病不同時期可將糖尿病視網膜病變分為NPDR和PDR,NPDR的早期標志包括血管內皮損傷、微動脈瘤的形成和視網膜內點狀出血[7-8]。隨著疾病進一步發展,血管收縮和毛細血管閉塞導致視網膜缺血,糖尿病視網膜病變進展至末期,嚴重缺氧會造成新生血管、玻璃體出血和視網膜脫離[9-10]。若能早期發現、早期診斷、有效治療,可延遲糖尿病視網膜病變的發作及進展,為其診治提供幫助。

本研究結果顯示,健康人群、NDR患者、NPDR患者、PDR患者中SBP、DBP、HDL-C、FPG、HbA1c存在顯著差異,與張秋艷[11]研究結果部分一致。提示血糖、血脂代謝異常在糖尿病視網膜病變發生、發展中發揮重要作用,可導致病情加重。

circRNA是通過前mRNA的反向剪接產生的,circRNA的閉環結構比線性RNA更為穩定,目前circRNA作為miRNA海綿的調節機制已有研究[12-13]。既往研究顯示,miRNA可通過與mRNA的堿基配對,抑制mRNA的翻譯并下調特定基因表達,這是circRNA下游的主要調控機制[14]。本研究結果顯示,隨著糖尿病視網膜病變的發展,血清circFTO水平逐漸增加,miR-141-3p水平逐漸降低。推測:(1)circFTO、miR-141-3p可能通過影響炎癥反應參與疾病進展。Huang等[15]研究發現,circFTO的缺失可以抑制氧化應激和炎癥,進而減少高糖誘導的人視網膜色素上皮(adult retinal pigment epithelium-19,ARPE-19)細胞損傷。而既往研究中miR-141-3p是具有炎癥抑制作用和神經保護作用的miRNA[16-18]。基于上述研究分析推測本研究糖尿病視網膜病變發生初期,患者視網膜屏障的通透性和流動性發生改變,造成許多功能受損,患者血清miR-141-3p水平降低,miR-141-3p表達缺失造成circFTO大量表達,進而誘導炎性因子大量釋放,加重炎癥水平,加速血液-視網膜屏障的破壞及多種炎性細胞因子的進一步釋放,最終可能會導致新生血管、玻璃體出血和視網膜脫離。(2)circFTO、miR-141-3p可能通過影響血管生成參與疾病進展。Liu等[5]研究中,miR-141-3p過表達增加了視網膜母血管瘤的生長與血管生成。基于上述研究分析推測本研究糖尿病視網膜病變發生后,病理損傷造成circFTO、miR-141-3p表達異常,進而協調促進病理性視網膜新生血管生產,推動病理進展。(3)circFTO、miR-141-3p可能通過影響細胞功能參與疾病進展。既往研究結果表明,糖尿病視網膜病變的具體機制目前尚未完全闡明,除涉及非特異度炎癥和氧化應激外,還包括細胞凋亡等多種病理生理過程[19]。而Yang等[14]研究結果表明,circFTO表達上調可能促進腎透明細胞癌細胞的增殖和侵襲能力。此外,Tang等[20]研究表明,人參皂苷Rh3可通過誘導小鼠視網膜中miR-141、核因子E2相關因子2表達增加,保護視網膜細胞免受紫外線傷害。推測本研究中circFTO、miR-141-3p表達異常,亦可能通過調控視網膜細胞功能參與糖尿病視網膜病變。

本研究相關性結果進一步顯示,circFTO、miR-141-3p與FPG、HbA1c水平顯著相關。提示circFTO、miR-141-3p水平變化可能與長期血糖控制水平相關,推測circFTO異常升高和miR-141-3p異常降低可能通過慢性調節血糖變化加速糖尿病視網膜病進展。進一步多因素Logistic回歸分析發現,circFTO、miR-141-3p均是糖尿病視網膜病變的影響因素。提示circFTO水平增加、miR-141-3p水平降低一定程度上反映出血糖控制不佳,間接提示糖尿病視網膜病變的嚴重程度,二者可能共同參與疾病進展。

綜上所述,circFTO、miR-141-3p可能參與了糖尿病視網膜病變的發生發展,且與疾病分期密切相關,動態監測二者水平變化有助于評估疾病病變程度。然而circFTO、miR-141-3p參與糖尿病視網膜病變的具體作用機制不明確,仍需基礎研究證實。且本研究未對糖尿病視網膜病變患者治療前后的血清circFTO、miR-141-3p水平進行對比分析,未探討二者在疾病治療中的價值。