火龍果汁涼茶的制備品質與生產經濟優化

林大成,陸明盈,鐘摟,陳美花,王劍峰,顏財發

(1.北部灣大學 a.食品工程學院;b.廣西高校北部灣特色海產品資源開發與高值化利用重點實驗室,廣西 欽州 535011;2.廣西靈山縣宇峰保健食品有限公司,廣西 靈山 535400;3.廣州工商學院 商學院,廣州 510800)

現代健康養生觀念的興起,使開發綠色天然果汁飲料具有潛在市場價值.但要取代一般化學勾兌飲料仍有很大的質量改善空間,例如果汁飲料內容物的沉淀穩定[1]、色素保質[2-3]、食源性污染菌[4]及原料成本[5]等四大問題.解決問題的關鍵在于綠色制備與生態型保質方法.果汁飲料常見內容物的沉淀分層問題涉及均勻乳化性與穩定性[1].對穩定性問題大都關注穩定劑的種類、濃度及添加量,并以離心沉淀率作為判斷指標[1],而少有以生物乳化劑作為生態型保質劑.色素保質問題涉及溫度與酸堿性對花青素或甜菜苷色素的含量與保留率[2-3],而少有以中藥促進生物乳化,強化天然色素的保護作用.食源性污染菌問題涉及中藥的活性成分、多酚類物質及多糖等對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度與抑菌圈敏感性[6],而少有結合生物保質劑與低pH發酵的抑菌作用.原料成本問題大都關注原料添加的配方比例與制備條件優化,而少有關注綠色制備方式與生態型保質劑.

火龍果汁涼茶屬創新產品,火龍果果肉富含營養、甜菜色素及膳食纖維,具有抗氧化、降低膽固醇、預防便秘等功效.結合養生中藥與益生乳酸菌發酵,適合于深加工.本研究旨在火龍果汁飲料產品的保質期限內,解決一般果汁飲料的穩定性、色素保存、污染菌及原料成本等四大問題,為創新產品從生產理論轉化成商品提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

火龍果,檸檬(市售),仙草(廣西靈山縣宇峰保健食品有限公司),中藥(山藥、枸杞、紅曲)(西安百慶生物科技有限公司);混合乳酸菌種(嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌)(山東菌樂生物科技有限公司),苯酚、濃硫酸、三氯乙酸、95%乙醇及葡萄糖等均為分析純(廣州柏研生物科技有限公司).

主要儀器:Evolution 201 &220紫外-可見光分光光度計(上海譜祥科學儀器有限公司);TG16MW臺式高速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司);AE300L-H臺式高速分散均質機(深圳市良誼實驗室儀器有限公司);KTNK-80冷凍干燥機(上海喬楓實業有限公司);DG250密封式厭養操作臺(上海迪發儀器儀表有限公司).

1.2 實驗設計

基于先前研究火龍果汁涼茶最佳配料組合(糖添加量140 g/L,復方中藥濃縮液添加量30 mL/L,乳酸菌種添加量100 mL/L及檸檬汁添加量70 mL/L)的結果為基礎,再以胞外多糖產量(EPS)為指標,利用單因素分析與正交試驗進行篩選火龍果汁涼茶的最佳經濟組合為實驗組(EX),探討生產條件的優化參數.同時以僅不添加中藥為控制組(CL),僅不添加乳酸菌發酵為對照組(CK)及不添加乳酸菌與中藥的火龍果汁為空白組(BK),進行6月加速實驗的各項性能評估,包含乳化性、穩定性及抑菌作用等,并測定甜菜苷色素含量與保留率.6月加速實驗乃對實驗各組在其相同條件下預做相同的6項產品再于每月進行破壞性測定試驗.復方中藥濃縮液制備工藝為各組分經清洗后50 ℃烘干磨粉的樣品,分別稱取干粉5.0 g加純水300 mL熬煮濃縮成200 mL,3種中藥濃縮液混合比例為V山藥∶V枸杞∶V紅曲=1∶1∶1.混合乳酸菌為分別取含量109CFU·L-1的3種菌混合而成,混合比例為V嗜酸乳桿菌∶V德氏乳桿菌保加利亞亞種∶V嗜熱鏈球菌=1∶1∶1.

1.3 單因素試驗與正交試驗

為考量產品質量與生產經濟性,單因素試驗主要考察料液比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)、pH值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、發酵溫度(31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃)及發酵時間(8 h、12 h、16 h、20 h、24 h)等四因素對火龍果汁涼茶中EPS產量的影響,其中以各因素的中間值為固定因素水平.根據單因素試驗結果,進行四因素三水平L9(34)的正交優化試驗.發酵溫度選擇一般微生物生長的最佳溫度37 ℃為中間值,再各取上下差值為3 ℃以求其差異具有顯著性.

1.4 胞外多糖的提取與測定

EPS提取參考文獻[7].首先取各試驗樣品溶液進行抽濾,收集濾液后加入0.4 mol/L的三氯醋酸10 mL,將錐形瓶放入冰箱4 ℃靜置3 h后,取體積分數95%酒精以1∶2的料液體積比抽提上清液12 h后,放入冰箱4 ℃靜置24 h,以5 000 r/min離心20 min,離心后提取沉淀物,再以分子量6 000～8 000 kD透析膜進行24 h透析,最后收集透析液于冷凍干燥器中進行72 h干燥恒重稱量,得粗多糖干質量.胞外多糖測定參考文獻[8],采用苯酚硫酸法.首先制備葡萄糖標準曲線,配制葡萄糖標準液(100 mg/L)后稀釋5個梯度(5,10,25,50,100 mg/L),以分光光度計在490 nm 測吸光值,在同一波長下測定多糖樣品,3個平行取平均值,利用葡萄糖標準曲線計算多糖質量濃度.

1.5 乳化性與穩定性測定

采用乳化指數(E24)法,參考文獻[7]的方法稍加修改.配制實驗組與控制組各樣品EPS溶液,分別以體積比2∶3加入色拉油混合,進行震蕩2 min,靜止24 h后測量乳化層和總高度,計算乳化指數,

E24=(Eh/EH)×100%,

(1)

式中,E24:乳化指數(%),Eh:乳化層高度(mm),EH:總溶液高度(mm).

穩定性采用離心沉淀法,參考文獻[9],測定離心沉淀率并同時計算穩定性.量取各試驗組 5 mL 火龍果汁涼茶飲料于10 mL 離心管中,在 3 000 r/min下離心10 min,棄去上清液,稱量沉淀質量,計算離心沉淀率,

Sr=(Sm/Ss)×100%,St=100%-Sr,

(2)

式中,Sr:離心沉淀率(%),Sm:沉淀質量,Ss:樣品質量,St:穩定性(%).

1.6 甜菜色素的提取測定與保留率確定

根據甜菜苷色素含量作為產品質變的判定指標,甜菜苷色素含量越低表示質變作用越大[3].火龍果汁涼茶中總甜菜色素含量的提取與測定參考文獻[2]方法.稱取一定量火龍果汁涼茶飲料置于離心管,超聲波震蕩20 min,以10 000 r/min離心10 min提取紅色素并稀釋一定倍數,與蒸餾水組進行對照,在535 nm波長下測其吸光值,計算紅色素含量,

C=A535×MW×V×DF×(ε×L×W)-1×105mol·cm·g·L-2,

(3)

式中,C:待測樣品中甜菜苷質量濃度(g/L),A535:樣品在535 nm處的吸光度值,MW:標準甜菜苷摩爾分子質量,550.46 g/mol,V:樣品溶液體積(mL),DF:稀釋倍數,ε:標準甜菜苷摩爾消光系數,L:試管的透光路徑長度(cm),W:原料的鮮質量(g).

將不同處理的火龍果紅色素提取液在535 nm波長下測定吸光值,計算色素保留率,

R/%=(A1/A0)×100%

(4)

式中,R:火龍果色素保留率(%),A1:各處理后火龍果紅色素提取液在535 nm下的吸光值,A0:新鮮火龍果紅色素提取液在535 nm下的吸光值.

1.7 最小抑菌濃度與抑菌圈測定

采用二倍稀釋法參考文獻[10].首先取火龍果汁涼茶的最佳實驗組合(EX)100 mL,EPS為(1 168±120)mg/L,以減壓濃縮機進行10倍體積濃縮,得(1 136±180)mg/L,再進行8個梯度的二倍稀釋法,稀釋后的質量濃度為:(5 680±90)、(2 840±50)、(1 420±230)、(710±11)、(355±6)、(178±3)、(89±1)mg/L.同時做不加菌液的陰性對照,與不加樣品的陽性對照.試驗菌種包含常見的食品污染菌例如大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli,EL),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA),志賀氏菌(ShigellaCastellani,SC),及沙門氏菌(Salmonella,SM)等.

抑菌圈測定采用瓊脂打孔法參考文獻[11].首先以NB培養基進行37 ℃,24 h震蕩培養四種污染菌,分別吸取適量污染菌液均勻涂抹于培養基.在平板上打孔4個后,其中一孔設置無菌水作陰性對照.將配制一定多糖溶液質量濃度(11.68±0.12)mg/mL并稀釋5個梯度的多糖溶液分別加入其余3個孔穴中,靜置 3 min,放入37 ℃培養箱培養24 h,用游標卡尺測量抑菌圈直徑,同時做對照組與控制組實驗如同實驗組步驟,平行3次試驗,取平均值.本抑菌試驗對象包含上述4種食品污染菌.抑菌圈(DI)敏感度參考文獻[12]定義為:DI>20 mm為極敏,DI:16～20 mm為高敏,DI:11～15 mm為中敏,DI:5～10 mm為低敏,DI<5 mm為極低敏,DI:0 mm無抑菌圈為不敏感.

1.8 感官評價與產品品質分析

感官評價實驗方法參考文獻[13].生產發酵后產品品質分析包含微生物與理化指標的測定如乳酸菌數、可溶性固形物含量、pH、固形物含量、總糖、總酸等分別參照文獻[14-18].

1.9 生產經濟性的計算方法與統計分析

生產經濟性的計算方法為以最適化條件對預實驗條件或單因素試驗的水平條件之差值與最適化條件的百分比,并以影響EPS產量無顯著差異的驗證條件為依據.

每一試驗皆做3重復試驗,方差分析利用軟件SPSS 26處理,數據分析采用Duncan多重比較在95%或99%水平的統計顯著差異.

2 結果與分析

2.1 EPS產量的單因素分析

2.1.1料液體積比對EPS產量的影響

火龍果汁料液體積比對EPS產量的影響如圖1(a)所示.隨著料液體積比的增加,EPS的產量呈先上升后下降并趨平緩的現象.一般乳酸菌EPS屬代謝副產物,通常于穩定期產生[19-20].開始階段料液體積比1∶1營養豐富,乳酸菌的生長最為旺盛,處于生長對數期,EPS產量最少.當料液體積比1∶3時乳酸菌的生長平穩,EPS產量最高達(1 178±20)mg/L.由于料液體積比1∶5與1∶4的EPS產量(1 038±18)mg/L和(1 056±19)mg/L二者并無顯著差異(p>0.5),但顯著高于料液體積比1∶2者(987±17)mg/L(P<0.5),因此從成本經濟考量,取水平3,4 和 5為佳,以進行正交試驗.

2.1.2pH對EPS產量的影響

pH對EPS產量的影響如圖1(b)所示,pH值大約與EPS產量呈負相關.隨著初始環境pH值的增加,EPS的產量呈先上升后下降的趨勢.一般乳酸菌生產EPS的最佳pH在3.5～5.5之間[20].當pH低于4.0時,酸度低抑制乳酸菌的生長,但有利于EPS生產,因此EPS產量相對高于對數生長期[20].當pH高于4.0時,乳酸菌繁殖旺盛處于對數生長期,不利于乳酸菌EPS的生成,因此EPS產量低.當pH為4.0時,乳酸菌的生長最穩定,EPS的產量最高達(1 156±15)mg/L,與其他pH值的產量相比具有顯著差異(p<0.05),此時發酵作用最為旺盛,最適合EPS的生產,故最適pH值為4.0.

2.1.3發酵溫度對EPS產量的影響

EPS產量隨發酵溫度升高而呈先上升后下降的趨勢(圖1(c)).當發酵溫度達40 ℃時,乳酸菌的生長最為穩定,EPS產量最高達(1 102±15)mg/L,而一般微生物生長的最佳溫度為37 ℃.故除37 ℃外與其他溫度的產量相比具有顯著差異(p<0.05),因此,最佳EPS產量的溫度為40 ℃左右.適當的發酵溫度可使中藥中活性物質釋出,以刺激乳酸菌外源性酶充分分解營養基質,促進EPS產量[21].

2.1.4發酵時間對EPS產量的影響

發酵液中 EPS 的產量隨著發酵時間延長而增加后呈穩定的趨勢.如圖1(d)所示,8～16 h乳酸菌處于快速生長的對數期,于16～20 h后達穩定期,20 h后 EPS產量也達到最高,此時 EPS產量為(1 152±21)mg/L.因此,最適發酵時間約為 20 h,除24 h 外與其他發酵時間的產量相比具有顯著差異(p<0.05).充足的發酵時間可使內源性酶充分進行生化反應,以促進乳酸菌發酵作用生產EPS[22].

2.2 EPS產量的正交分析

由單因素分析結果見表1,據此進行四因素三水平的正交優化試驗,結果如表2所示.各因素對EPS產量影響的主次順序由大到小為A(料液體積比),C(發酵溫度),B(pH),D(發酵時間),即料液體積比對EPS產量影響最大,其次為發酵溫度,再次為pH,發酵時間的影響最小.最優組合為A3B1C1D2,即料液體積比1∶5,pH=4.0,發酵溫度37 ℃,發酵時間20 h.適當的料液體積比供應營養,可使乳酸菌生長穩定而不會過度生長繁殖,以最經濟的原料產生最大量的EPS.最佳的pH值可抑制乳酸菌過度繁殖使其生長處于穩定期,又可抑制雜菌生長.以較低的發酵溫度與適當的發酵時間,可降低乳酸菌發酵的能源消耗,對EPS生產最具經濟效益.

表1 火龍果汁涼茶正交試驗因素水平

表2 正交試驗結果與分析

2.3 結果驗證與方差分析

由附表Ⅰ方差分析可知,在不考慮交互作用的情況下,液料體積比、pH、發酵溫度及發酵時間對火龍果汁涼茶EPS產量都有極顯著的影響(p<0.01),再次驗證液料體積比對EPS產量的影響最大,而發酵時間影響最小.由于發酵時間的影響最小,故考慮生產經濟性可彈性調整發酵時間范圍為16～20 h.故由正交試驗得EPS產量的最佳組合為 A3B1C1D2,但因此組合不在正交表上,故進行驗證試驗,得到產量為(1 178±14)mg/L與最大產量組合(A3B2C1D3)的(1 183±17)mg/L并無顯著差異(p>0.05),因此驗證可行,即最適生產EPS的經濟效益組合為液料體積比1∶5,pH4.0、溫度37 ℃及發酵時間20 h.由于發酵時間的影響最小,故再驗證A3B1C1D1得EPS產量為(1 168±12)mg/L與最大產量組合(A3B2C1D3)的(1 183±17)mg/L亦并無顯著差異(p>0.05),因此驗證也可行.故料液體積比可從1∶1調理為1∶5,原料成本可降低5倍;發酵溫度可從42 ℃調降至37 ℃,減少5 ℃能源;發酵時間從20 h調降為16 h,可減少4 h生產時間;EPS產量可從(983±10)mg/L提高為(1 168±12)mg/L,增加(18.8±2.4)%,故最適生產EPS的經濟效益組合為液料比1∶5、pH4.0、溫度37 ℃及發酵時間16 h.總體可提高生產成本的經濟性.

2.4 乳化性分析

乳化性可評估產品內容物的分布均勻性,可根據乳化指數(E24)作為產品乳化效果的判定指標,乳化指數越大表示乳化效果越佳,即火龍果汁涼茶飲料的料液均勻分布越佳,且與胞外多糖的產量有關[23].在6月的加速實驗中,乳化性分析結果如圖2顯示,最佳組合的實驗組(EX)皆比對照組(CL)與控制組(CK)及空白組(BK)具有較良好的乳化性,各月數值(85.8±0.9)%至(86.5±0.8)%并無顯著差異;而僅不添加中藥的控制組(CL)與僅不添加乳酸菌的對照組(CK)均無法維持平穩的乳化性,曲線逐漸呈下降趨勢,因此唯有二者的協同作用產生足夠的胞外多糖以維持乳化穩定; 另外中藥里的山藥富含黏性蛋白多糖,可增加乳化液黏性,有利于形成具強度的界面膜,可促進與水的親和力,以維持平穩的乳化性[23-25],故以中藥強化乳酸菌可提高胞外多糖產量,增加體系黏度以提高產品的乳化性而維持料液內容物的分布均勻性[25].

2.5 穩定性分析

一般酸性含乳飲料常見沉淀或分層的質量問題.而產品的穩定性可以利用離心沉淀率作為判定的指標.沉淀率與體系的穩定性成反比,離心沉淀率越低穩定效果越佳.在6月的加速實驗中,穩定性分析結果如圖3顯示,最佳組合的實驗組(EX)皆比對照組(CL)與控制組(CK)及空白組(BK)具有較良好的穩定性,且各月數值(99.62±0.07)%至(99.67±0.03)%并無顯著差異;而僅不添加中藥的控制組(CL)與僅不添加乳酸菌的對照組(CK)均無法長久維持良好的穩定性,沉淀率曲線呈逐漸上升趨勢,因此唯有二者的協同作用產生較多的胞外多糖,使具有較高的乳化性得以維持良好的穩定效果[24].故中藥強化乳酸菌發酵作用可提高胞外多糖產量,以增強產品的穩定性,維持產品內容物不致沉淀分層.與魏然等[9]研究比較,以離心沉淀率考察乳酸菌飲料的最佳穩定性為0.45%,該研究最佳組合的實驗組(EX)約為0.33%～0.38%,結果稍優,推論中藥促進乳酸菌的協同作用提高胞外多糖產量涉及均質與抽濾等工藝的聯合作用.由于飲料顆粒直徑越小,沉降速度越小,飲料溶液在乳化體系中越趨穩定[25-26].

2.6 甜菜苷色素含量與保留率分析

火龍果具有豐富的甜菜苷紅色素但對光熱缺乏穩定性且易受氧化而褪色,因此甜菜苷含量可作為評估產品質變的指標之一.在6月的加速實驗中,甜菜苷色素含量分析如圖4所示,最佳組合的實驗組(EX)皆比對照組(CL)、控制組(CK)及空白組(BK)具有較高且穩定的甜菜苷色素含量(78.8±0.5)～(80.4±0.4)mg/L,各月數值(98.01±0.63)%至(100.25±0.87)%并無顯著差異;而僅不添加中藥的控制組(CL)與僅不添加乳酸菌的對照組(CK)均無法維持平穩的甜菜苷色素含量,曲線逐漸呈下降趨勢,因此唯有二者的共同作用生產足夠的胞外多糖,得以維持平穩的甜菜苷色素含量,且能使火龍果汁釋放出更多的甜菜苷色素,其保留率在6月后仍可達(98.01%±0.63)%,如圖5所示,各月數值并無顯著差異,此與文獻[3]在低溫低酸性環境的保留率(100±10.0)%結果相似,推測該研究與胞外多糖的乳化作用、枸杞多糖與中藥多酚類物質的抗氧化護色效果及乳酸菌發酵產生乳酸形成酸性環境有關[2,27].故中藥強化乳酸菌可提高胞外多糖產量與總酚含量,以增強產品的甜菜苷色素含量以維持產品的質量.李霞等[2]以加入抗壞血酸促進丙二甜菜苷的轉化,而保持甜菜苷含量達成護色效果,與該研究產生胞外多糖的抗氧化效果相同.一般火龍果pH在3.5～5.5時色素最穩定[28],此階段為乳酸菌胞外多糖高產量的穩定期,而且胞外多糖具有乳化穩定甜菜苷的護色作用[3].因此保持酸性、低溫、避光和隔氧可達到防止甜菜苷色素質變的目的[29-30].

2.7 抑菌作用分析

以最佳組合的實驗組(EX)進行抑菌作用分析,結果見附表Ⅱ和Ⅲ,最小抑菌質量濃度(MIC)(mg/L)的大小順序為大腸桿菌(0.355±0.006)mg/L<志賀氏菌(0.710±0.011)mg/L<沙門氏菌(1.42±0.23)mg/L<金黃色葡萄球菌(5.68±0.09)mg/L,此與HEYDARIAN等[31]的研究結果相似.顯示抑菌作用以對大腸桿菌(EL)為最強,而對金黃色葡萄球菌(SA)為最弱.對大腸桿菌而言,該研究最小抑菌濃度為MIC:(0.355±0.006)mg/L與阿木古楞等[6]研究結果MIC:31.50 mg/L,比較結果抗性優于后者,與孫長花等[11]研究結果MIC:62.50 mg/L比較也有更優的效果.由于金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌,其細胞壁中肽聚糖壁較革蘭氏陰性菌的大腸桿菌為厚,不易為多糖所溶解破壞而表現出較強的抗性,導致具有較大的MIC[31].

抑菌圈由大到小為大腸桿菌(EL),志賀氏菌(SC),沙門氏菌(SM),金黃色葡萄球菌(SA),各菌的抑菌圈與抑菌濃度呈量效關系(R2=0.983 2～0.987 8),抑菌圈隨抑菌濃度的增加而增大.從敏感度分析以(11.36±0.18)g/L為基礎,大腸桿菌(21.2±0.6)mm屬極高敏,志賀氏菌(18.2±0.7)mm與沙門氏菌(15.7±0.8)mm屬高敏,金黃色葡萄球菌(10.4±0.5)mm 屬中敏.當抑菌質量濃度為(11.36±0.18)g/L時,二者抑制圈分別為(21.2±0.6)mm與(10.4±0.5)mm,前者對后者大約有2倍的抑制效力,此亦與HEYDARIAN等[31]的研究結果相當.與已有研究比較[6,11],該研究結果DI(11.36±0.18)g/L:(21.2±0.6)mm,呈現抑菌濃度小而抑菌圈大的效果.故推論為中藥與乳酸菌的協同作用所致[21],表現出良好的抑菌活性,此可能與該研究含有胞外多糖的生物活性成分有關,或與中藥促進乳酸菌發酵產生外源性酶增強抑菌活性有關,因為中藥中紅曲發酵后可產生輔酶Q10,是細胞代謝與細胞呼吸的激活劑[27].另外乳酸菌發酵的作用更能促進檸檬中的有機酸、火龍果中的花青素,酚類等抑菌活性物質的釋出,皆能使抑菌效果大為增強,故抑菌作用除胞外多糖外乃前述多種抑菌活性物質的綜合效果.

2.8 感官評價與產品品質分析

經濟性優化產品發酵后的感官評分結果與原生產發酵條件的最佳配方組合分別為(91.8±1.2)分、(92.5±1.6)分,并無顯著差異,因此驗證可行.最佳產品品質分析結果顯示乳酸菌數量為2.2×1011CFU·L-1、pH為(4.0±0.2)、可溶性固形物含量:(16.3±0.5)%、不溶性固形物含量:(0.36±0.05)%、總糖含量:(14.2±0.8)%、總酸(以醋酸計):(1.28±0.12)mg/L.

3 結 論

最佳實驗組(EX)對各組實驗(CL、CK、BK)的各項指標:乳化性,穩定性,甜菜苷含量及甜菜苷保留率等分別提升了1.1～1.5倍,27.6～91.6倍,1.4～4.7倍及1.1～1.5倍,而對食源性污染指標菌的大腸桿菌具有最大的抑菌圈與最小的抑菌濃度.在生產經濟性方面,結果顯示在果汁原料成本,發酵溫度能源及發酵時間等分別提高了80%,12%,20%的經濟性.

附 錄

附表Ⅰ～Ⅲ見電子版(DOI:10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.04.017).

附表Ⅰ 火龍果汁涼茶正交試驗的方差分析

附表Ⅱ 最佳實驗組對4株菌種的最小抑菌質量濃度

附表Ⅲ 最佳實驗組對4株菌種的抑菌圈直徑