中國水華藍藻新記錄屬
——澤鞘絲藻屬(Limnoraphis)

謝艷,張榮臻,張葵東,呂興菊,張和,肖鵬,李仁輝,程耀,耿若真

(1.溫州大學 生命與環境科學學院,浙江 溫州 325035;2.溫州市珊溪水利樞紐管理中心,浙江 溫州 325000;3.大理州洱海湖泊研究院,云南 大理 671000)

藍藻分類學是認識和評價藍藻生物多樣性的重要方法,對于了解自然生物群落中藍藻種群的功能非常重要.作為地球上最古老的生物類群之一,藍藻具有漫長且復雜的進化歷史,部分藍藻化石的形態與現在的物種非常相似,是一類非常具有挑戰性的分類群體[1-2].在藍藻的原核特性被發現之前,由于藍藻形態多樣,傳統的藍藻分類系統主要以形態學為基礎,遵循植物學命名法則進行命名和描述[3].隨著分子生物學的發展及系統發育分析的出現,利用分子手段解決藍藻的分類學問題已被越來越多的分類學家所接受,藍藻的整個分類階層(目、科、屬、種)經歷了廣泛的重組和修訂[4-5].在這個過程中,基于形態學、分子系統發育學和生態學等特征相結合的多相分析方法,逐漸成為研究藍藻分類學的最佳方法[6-8].藍藻分類學研究中多相方法的應用導致大量屬種的修訂和新屬種的建立,為解決系統發育的單系分類問題提供了方法[5,9].

澤鞘絲藻屬(Limnoraphis)隸屬于顫藻目(Oscillatoriales),Sirenicapillariaceae,是一種能形成水華的浮游性絲狀藍藻,于2013年由KOMREK等人從鞘絲藻屬(Lyngbya)分離出來而成立為新屬,模式種為希羅澤鞘絲藻(Limnoraphishieronymusii)[10].該屬在形態學上與鞘絲藻類(Lyngbya-like)藍藻相似,均為絲狀,不分枝;藻絲單列,具鞘,橫壁處不收縊或稍收縊,細胞圓盤狀;無異細胞和厚壁孢子.其中,澤鞘絲藻屬的種類因能夠在細胞中形成氣囊從而在水體中自由漂浮,這是區分澤鞘絲藻屬和不含氣囊而非浮游性的鞘絲藻屬(Lyngbya)最主要的形態學特征.目前澤鞘絲藻屬中的4個物種均為淡水種類,在生態學上也能與海洋習性的鞘絲藻屬區分開來.此外,二者的系統發育關系也相距較遠,擁有獨立的系統發育位置,彼此之間的16S rRNA基因相似度也低于細菌學和現代藍藻分類學中屬的界限[11-13].因此,KOMREK等將包含模式種在內的4個原來歸屬于鞘絲藻屬的種類(LyngbyahieronymusiiLemmermann 1905、LyngbyabirgeiG.M.Smith 1916、LyngbyacryptovaginataSchkorbatov 1923以及Lyngbyahieronymusiif.robustaParukutty 1940)從鞘絲藻屬中分離并成立了新型浮游性藍藻屬——澤鞘絲藻屬.

在本研究中,從中國云南省大理市的洱海北部湖灣采集并分離出一株浮游絲狀藍藻藻株,在形態學上與鞘絲藻屬相似,基于16S rRNA基因的系統發育分析發現分離的藻株與澤鞘絲藻屬的藻種聚為緊密的一個系統進化分支,并顯示出最高的序列相似度(>99.84%).進一步通過形態學觀察和比較,確定該藻株為澤鞘絲藻屬的模式物種希羅澤鞘絲藻.這也是我國對澤鞘絲藻屬的新記錄屬的報道.

1 材料與方法

1.1 樣品的采集、藻種分離及培養

2007年7月,使用25#浮游生物網在云南省大理市洱海北部湖灣表層水體的0.5 m處呈“∞”字形緩慢拖動采集浮游植物.首先對聚集的群落進行簡單解聚和分散,待群落里面的藻體或者藻絲分散開來以后使用毛細管分離藻種,即在40倍的倒置顯微鏡(Olympus CKX31,Japan)下用巴斯德吸管制作成的毛細管挑取單根藻絲或單個細胞,在干凈的無菌培養基中清洗數次后轉入含有無菌CT培養基的24孔板中培養.一定時間后,將鏡檢為單種藍藻的孔中的培養物轉移到含有10 mL無菌CT培養基的螺口管中,放置在培養條件為溫度25 ℃,光暗周期12 L:12 D,光照強度2 000 lx的培養箱中保存,每隔1～2月進行藻種轉接.

1.2 藻株的形態觀察及形態特征計量

光學顯微鏡觀察:藻株生長至一定生物量時,無菌操作取1 mL藻液,適當稀釋后用移液槍吸取適量藻液置于載玻片上,于Nikon eclipse 80i(Nikon,Japan)光學顯微鏡下進行形態觀察,顯微鏡配備DS-Ri1用于顯微照片的拍攝,NIS-Elements 3.2 D用于形態特征的測量(Nikon,Japan).對不同藻株的每個形態特征(如藻絲和營養細胞的長與寬等)均進行100次以上的測量.

1.3 DNA的提取,PCR擴增,克隆及測序

分離得到的藻株采用改良后的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取藻株DNA.將16S rRNA作為 PCR 擴增的目標基因和序列測定,擴增引物為PA(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)[14]和B23S(5′-CTTCGCCTCTGTGTGCCT AGG T-3′)[15].PCR擴增體系為20 μL體系:由1 μL基因組DNA(100 ng/μL),0.5 μL每個引物(10 μmol/L),8 μL無菌水和10 μL 2×PCR TSINGKE Taq聚合酶(Beijing Tsingke Biotech Co.,Ltd.,Beijing,China)組成.擴增程序為:95 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s共35個循環;72 ℃延伸5 min.PCR產物通過質量濃度1%瓊脂糖凝膠電泳分析,切取的目的條帶使用TSINGKE DNA凝膠提取試劑盒(Beijing Tsingke Biotech Co.,Ltd.,Beijing,China)進行純化回收,然后取5 μL純化產物在pMD18-T載體(TaKaRa,TaKaRa BioInc.,Otsu,Japan)進行連接,并轉化到大腸桿菌Trans5α(TransGen Biotechnology,China)細胞中輕輕混勻,冰浴30 min后42 ℃熱擊30 s,冰上放置5 min后,在超凈臺中加入無氨芐青霉素的LB液體培養基200 μL,于37 ℃轉速設置為190 r/min的搖床振蕩培養45 min后,取70 μL菌液均勻涂布在含Amp+的LB固體培養基上,于37 ℃的恒溫培養箱過夜培養12 h.挑取單克隆子菌落加入800 μL LB液體培養,37 ℃,190 r/min振蕩培養4～5 h后對菌液進行PCR檢測,提取陽性克隆子重組質粒進行Sanger雙向測序,測序平臺為ABI 3730XL自動測序儀(PerkinElmer,Waltham,Massachusetts USA).每個目標片段至少獲得3個陽性克隆序列.

1.4 序列比對分析及系統進化樹的構建

測序獲得的序列首先在NCBI 網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進行BLAST比對分析,檢測序列是否正確擴增.目的序列與從NCBI網站上下載的相關序列利用BioEdit version 7.2.5.0軟件進行比對分析,手工檢查并校正,校正后的序列用于系統發育樹的構建.系統發育樹的構建采用最大似然法(Maximum Likelihood,ML)和貝葉斯推理法(Bayesian Inference,BI),其中最大似然法基于GTR+I+G核酸替代模型,使用PhyML 3.0[16]軟件構建ML系統發育樹,步展值設為10 000.貝葉斯推理法使用軟件MrBayes v3.2.6[17]構建貝葉斯系統進化樹,共運行160萬代,每100代采樣一次,舍棄前25%樣本樹.軟件Fig Tree version 1.4.3(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)用于系統進化樹可視化編輯.

2 結 果

2.1 形態學觀察

澤鞘絲藻屬(Sirenicapillariaceae,Oscillatoriales)

希羅澤鞘絲藻(圖1)

Limnoraphishieronymusii(Lemmermann)J.Komárek,E.Zapomelová,J.Smarda,J.Kopecky,E.Rejmánková,J.Woodhouse,B.A.Neilan &J.Komárková,2013

生境:在淡水水體中自由漂浮.

分布:云南省大理市洱海.

標本號:WZUH-ZLYN200701.

參考藻株:CHAB 3367.

絲狀體單生或以小的聚集體生長,不分枝,直或稍彎曲,自由漂浮,具明顯鞘.鞘堅固,無色,透明,薄或稍加寬,在末端開放.藻絲單列,圓柱形,藍綠色到棕綠色,衰老時變黃,在橫壁處不收縊或稍收縊,向端部不漸狹.藻絲中部寬12～14 μm,頂端細胞圓形.細胞短柱形或盤狀,長1.00～1.84～3.54 μm,寬8.75～10.60～12.90 μm,長短于寬,含顆粒狀內容物,具有氣囊,細胞壁無色.無異形胞和厚壁孢子.通過藻殖段進行繁殖.

從形態學特征來看,分離的藻株CHAB 3367為絲狀,不分枝,具鞘等特點與鞘絲藻相似,但因該種類具有氣囊,能在水體中自由漂浮,因此屬于從鞘絲藻中分出來的一類具有兼性氣囊的澤鞘絲藻類群.從細胞大小來看,CHAB 3367絲狀體和藻絲的寬度都比KOMREK等人于2013年描述的希羅澤鞘絲藻略窄,除此之外與該物種具有非常相似的形態學特征,因此,我們從洱海分離的藻株CHAB 3367為中國新記錄屬澤鞘絲藻屬的模式新記錄種,即希羅澤鞘絲藻(Limnoraphishieronymusii).

2.2 分子系統學分析

通過一代測序我們獲得了CHAB 3367藻株的16S rRNA基因序列(1 463 bp),其與澤鞘絲藻屬藻株16S rRNA的序列相似度為99.84%～99.92%(表1),高于細菌學中物種劃分的界線.基于ML和BI方法,本研究以黏菌藻目的藻株(GloeobacterviolaceusPCC 7421)為外類群,使用顫藻科和Sirenicapillariaceae下的68條序列來構建系統發育樹.從圖2可知,CHAB 3367跟澤鞘絲藻屬的序列聚為一個緊密的系統進化分支(clade A),ML步展值和貝葉斯后驗概率分別為100%和0.998,與Sirenicapillariaceae中其他的6個屬分離(clade B～clade G),很大程度上表明分離的藻株CHAB 3367歸屬于澤鞘絲藻屬(圖2).

表1 CHAB 3367與澤鞘絲藻屬藻株16S rRNA基因序列相似度比較

3 討 論

隨著大量DNA序列的出現和分子生物學的發展,藍藻的分類學系統經歷了幾番變化,多相特征方法在藍藻分類學中的大量應用導致許多新屬和新種的出現,并使藍藻屬向狹義單系的“小屬”方向推進[5,9,18].在過去幾十年里,顫藻目中具有大型盤狀細胞的無異形胞分化的絲狀藍藻已被廣泛報道[18].其中,鞘絲藻類藍藻是一類廣泛存在于多種生境中的無異形胞分化的絲狀藍藻.根據國際權威藻類數據庫Algaebase統計,目前已有952個淡水/海洋鞘絲藻屬的種類被記錄描述,只有218個物種被現代分類系統有效接受.眾多的分子生物學證據表明鞘絲藻屬是一個高度多系屬,系統發育關系上由幾個不同的進化分支組成,一些與模式物種相距較遠的類群如Moorea、澤鞘絲藻屬(Limnoraphis)、Okeania和微線藻屬(Microseira),都是近年來從該屬中分離出來而成立的新屬[10,20-22].鑒于鞘絲藻屬的模式物種為海洋種類,預計這一擁有眾多物種的絲狀藍藻屬將在未來得到更多的修訂和關注.

澤鞘絲藻屬因其具有氣囊而浮游的特性,區別于傳統的附著類的鞘絲藻類,是一類可以形成水華的無異形胞分化的絲狀藍藻[10].澤鞘絲藻屬最初被描述為Lyngbyahieronymusii[23],2013年,KOMREK等[10]基于形態學與分子生物學的差異,將具有氣囊能漂浮生長的4個鞘絲藻物種Lyngbyahieronymusii、Lyngbyabirgei、Lyngbyacryptovaginata以及Lyngbyahieronymusiif.robusta從鞘絲藻屬中分離出來成立為新屬,即澤鞘絲藻屬,并在次年提出的8目系統中的顫藻目顫藻科中占據一席之地,該屬也是當時顫藻科下唯一一個細胞具氣囊能形成水華的絲狀藍藻屬[5,10].2022年,BERTHOLD等[24]基于16S rRNA基因序列及p-距離的系統發育分析表明,具有高支持度的7個絲狀藍藻屬,即Sirenicapillaria、Tigrinifilum、Affixifilum、Capilliphycus、Limnoraphis、Limnospira和Neolyngbya在系統發育樹上聚為一個大的緊密的單系系統進化支,因而將該分支重新定義為一個藍藻新科Sirenicapillariaceae.至此,澤鞘絲藻屬的分類地位較為明確地確定下來.

由于澤鞘絲藻屬物種間基因型的高度相似性,該屬內的種類主要依據形態特征作為進一步的分類依據.當前澤鞘絲藻屬中包括4個物種,基于絲狀體和藻絲寬度,這4個種類由寬到窄依次為L.birgei、L.robusta、L.hieronymusii及L.cryptovaginata[10].本研究中從洱海分離得到的藻株具有與澤鞘絲藻屬相似的形態學特征,其中該藻株的絲狀體寬12～14 μm,藻絲寬8.75～10.60～12.90 μm,與KOMREK等[10]2013年描述的L.hieronymusii相比略小一些(絲狀體寬12～16 μm;藻絲寬11～14 μm),這可能是由于不同水體分離的藻株具有一定的生態表型差異.由于分離的藻種仍處于該種類的形態特征的大致范圍內,我們仍將CHAB 3367定種為澤鞘絲藻屬的模式物種,即L.hieronymusiiCHAB 3367.從16S rRNA基因構建的系統發育樹來看,CHAB 3367和包括模式種在內的澤鞘絲藻屬的序列聚為一個緊密的進化分支(圖2 clade A),擁有極高的ML步展值和BI后驗概率(100/0.998).根據p-距離計算的16S rRNA基因相似度可知,CHAB 3367與該屬所有序列的相似度>99.84%(表1),遠高于細菌學與藍藻分類學中物種的分界線[10-12],進一步證實了形態學的鑒定結果.

此外,澤鞘絲藻屬在世界范圍分布廣泛,目前已知的有歐洲的德國[25]、捷克[26]、烏克蘭[27],中東的土耳其[28]、以色列[29],亞洲的薩哈(雅庫特)共和國[30]及塔吉克斯坦[31]等.本研究則是澤鞘絲藻屬在中國(洱海)的首次報道,也顯示出我國無異形胞絲狀藍藻的物種多樣性.同時,澤鞘絲藻屬作為一種能產生水華的絲狀藍藻,與浮絲藻(Planktothrix)/擬浮絲藻(Planktothricoides)[32],氣絲藻(Aerosakkonema)[33]等無異形胞分化的顫藻目藍藻相似,其形成的藍藻水華的危害及生理生態學的研究仍需要更多的藻株來證實.未來我們期待更多具有氣囊能形成藍藻水華的無異形胞的絲狀藍藻被發現、分離和鑒定,利用更加先進的宏基因組和高通量測序技術等探索不同氣候、不同生境(湖泊、河流、溫泉等)下的藍藻多樣性和豐富度信息.