含ACC脫氨酶的植物促生菌對荷花耐鎘性及鎘富集的影響

江婷，李澤鑫，胡途，徐迎春，金奇江，王彥杰

（南京農業大學園藝學院/農業農村部景觀農業重點實驗室/國家林業與草原局華東地區花卉生物學重點實驗室/農業農村部花卉生物學與種質創制重點實驗室，南京 210095）

近幾十年來，由于工業污水和生活污水的不合理排放，大量重金屬污染物進入河流、湖泊，對生態環境造成了嚴重污染[1]。據不完全統計，我國80%以上的水體都受到重金屬污染[2]。鎘（Cd）是我國水體主要重金屬污染物之一，容易在植物或動物體內積累并難以被排出體外，這不僅影響動植物正常生長，而且其還能通過食物鏈進行轉移和富集，最終危害人類健康[3]。因此，水體Cd 污染的治理迫在眉睫。重金屬污染水體的修復方法包括物理修復、化學修復和生物修復等[4]。其中，植物修復作為一種重要的生物修復技術，因具有綠色環保且成本低廉等特點而被廣泛關注[5]。而利用觀賞植物修復污染環境不僅具有生態效果，還能夠美化環境，因此成為近年來的研究熱點[6-7]。但這種修復方法常因為植物受到重金屬不同程度的毒害而影響修復效率[8]。因此，提高植物對重金屬的耐受性對于改善植物修復方法十分重要。

植物促生菌（PGPB）是指生活在植物健康組織或根際土壤中的一類可以促進植物生長的有益微生物[9]。一些PGPB 的代謝產物如1-氨基環丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）脫氨酶可以將乙烯合成前體ACC 水解為α-酮丁酸和氨，降低植物體內乙烯的水平，從而緩解逆境脅迫下植物的不良反應，促進植物生長，進而提高植物修復的效率[10-11]。目前，已有一些有關產ACC 脫氨酶的PGPB 可提高植物Cd 耐受性的報道。如Zafar 等[12]發現對Cd 脅迫下的小麥接種產ACC 脫氨酶的PGPB 能夠通過提高植株體內光合色素的含量減少小麥對Cd的吸收，從而促進植物生長；Pramamnik等[13]指出對水稻接種產ACC 脫氨酶的菌株MCC3091，能夠減少植物體內應激乙烯的產生，進而緩解Cd 脅迫對水稻根長和芽長的抑制；Liu 等[14]從Cd 污染土壤中篩選出一株產ACC 脫氨酶的PGPB，將其接種于五節芒后，其能夠促進植物生長并增加植物對土壤中Cd 的富集。然而，這些產ACC 脫氨酶的PGPB 增強植物重金屬耐性的相關研究主要集中在模式植物和農作物方面，其對重金屬脅迫下水生觀賞植物的生長及抗逆性的作用研究還鮮見報道。

荷花（Nelumbo nucifera）為蓮科蓮屬多年生挺水花卉，是中國十大傳統名花之一，具有很高的觀賞價值、經濟價值和文化價值。荷花根據用途不同可分為花蓮（觀賞荷花）、藕蓮和子蓮，其中觀賞荷花花大色艷，是現代園林水景營造中不可或缺的重要植物材料[15]。近年來的研究表明，荷花具有高效吸收重金屬的能力，其對水中Cd 的去除率高達85%[16-17]，另外荷花適應性廣、生長快、生物量大，因此可以作為修復污染水體的候選植物。然而荷花長時間處于高濃度Cd脅迫下會出現毒害表型[18-20]。乙烯被證實在荷花響應Cd 脅迫中起重要作用，減少乙烯含量或控制乙烯感知能增強荷花耐Cd 性[20]。但有關產ACC 脫氨酶的PGPB 能否影響Cd 脅迫下荷花生長及耐Cd 性的研究迄今尚未見報道。鑒于此，本研究選取從重金屬污染區的雙子葉植物中分離出來的具有較高耐Cd性的兩種產ACC 脫氨酶的PGPB——Pantoea vagansSo23 和Pseudomonas veroniiE02[21]，通過盆栽試驗，對觀賞荷花品種“秣陵秋色”分別接種So23和E02，研究這兩種PGPB 對Cd 脅迫下荷花生長、生理代謝及其Cd 吸收積累能力的影響，以期為利用PGPB 提高荷花及其他水生觀賞植物對重金屬逆境的適應能力、提高植物修復效率提供理論依據，本研究對推動水生植物聯合微生物治理重金屬污染水體具有重要實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及培養

供試菌株Pantoea vagansSo23 和Pseudomonas ve-roniiE02由南京農業大學生命科學學院提供，菌株均從重金屬污染區的雙子葉植物地上部分離，具有較高耐Cd 性且具有產ACC 脫氨酶、產IAA 等特性[21]。將甘油保存的菌株So23 和E02 從超低溫保藏冰箱中取出后分別活化，并接入無菌LB 液體培養基，30 ℃、180 r·min-1條件下振蕩培養18~24 h后于室溫下3 000 r·min-1離心10 min，收集菌體，用無菌水重懸制成濃度為1×108CFU·mL-1的菌懸液。

觀賞荷花品種“秣陵秋色”（N.nucifera‘Molingqi-use’）為中小株型，花為重瓣型、黃色，種藕由南京藝蓮苑花卉有限公司提供。4 月選取生長健壯、大小一致的帶頂芽種藕，種植在直徑為53.5 cm 的無孔塑料花盆中，每盆裝土30 kg，每盆種植一支種藕，荷花生長期間進行正常的水肥管理。

1.2 盆栽試驗

盆栽試驗在南京農業大學龍潭荷花基地通風透光的塑料棚中進行。試驗共設4 個處理：（1）Cd 脅迫下接種So23 處理（So23+Cd）；（2）Cd 脅迫下接種E02處理（E02+Cd）；（3）未接菌Cd 處理（Cd）；（4）未接菌且未進行Cd 處理的對照（CK）。每個處理4 個重復。具體處理方法如下：待每盆荷花長出5~6 片立葉時，選取生長健壯且長勢一致的荷花，在其根際周圍分別注射濃度為1×108CFU·mL-1的So23 和E02 菌懸液各150 mL，每7 d 注射一次，共注射4 次，未接菌組以注射等體積無菌水代替。第一次接菌后對荷花進行Cd脅迫處理，Cd 添加量以現行土壤環境質量標準[22]及前人對盆栽荷花Cd 添加量的篩選[18]為依據，設置為30 mg·kg-1。將CdCl2·2.5H2O 溶于無菌水中，以水溶液的形式施入盆中，未進行Cd 處理組用等體積無菌水代替。試驗過程中定期補水，保持水位距離盆上口邊10 cm。Cd處理當日計為第0天，每隔7 d進行一次形態指標的觀測，并在Cd 處理后第28 天對荷花各器官及底泥進行取樣，用于后續試驗測定。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 形態指標觀測

試驗期間持續觀察荷花株高、葉面積、立葉數和開花數的變化。其中株高指從水面到荷花葉片頂端的距離；每盆隨機選擇3片立葉量取荷花葉面積。

1.3.2 丙二醛含量測定

丙二醛（MDA）含量測定參考李合生[23]的方法。取0.2 g 荷花葉片，加入2 mL 10%的三氯乙酸（TCA），研磨成勻漿，4 ℃、4 000g條件下離心10 min。取0.5 mL上清液，加入0.5 mL 0.6%的硫代巴比妥酸（TBA），以0.5 mL蒸餾水代替提取液作為空白對照，混勻后沸水浴中煮沸15 min，離心取上清液測定600、532 nm 和450 nm處的OD值。計算MDA含量的公式如下：

式中：C為上清液MDA 的濃度，μmol·L-1；A532、A600、A450分別為上清液在532、600 nm和450 nm處的OD值。

1.3.3 抗壞血酸和還原型谷胱甘肽含量測定

抗壞血酸（AsA）和還原型谷胱甘肽（GSH）含量測定參考蔡慶生等[24]的方法。取0.2 g荷花葉片，加入1.5 mL 5%的TCA 在冰上研磨成勻漿，4 ℃、15 000g條件下離心10 min，上清液即為提取液。AsA 含量測定：取0.2 mL 提取液，加入0.2 mL 150 mmol·L-1PBS、0.2 mL ddH2O，混合均勻30 s 后加入0.4 mL 10%的TCA、0.4 mL 44%的H3PO4、0.4 mL 4%的2，2-聯吡啶，混勻后加入0.2 mL 3%的FeCl3，于37 ℃水浴反應1 h，反應結束后測定OD525nm值。GSH 含量測定：取0.2 mL 提取液，加入2.6 mL 150 mmol·L-1PBS 和0.15 mL 6 mmol·L-1DNTB，混勻后30 ℃水浴反應5 min，測定OD412nm值。同時用AsA 和GSH 標準樣品配制不同濃度的標準溶液，構建標準曲線，計算各樣品中的AsA和GSH含量。

1.3.4 Cd含量測定

Cd 含量的測定采用微波消解-電感耦合等離子體發射光譜法[25]。將荷花新鮮的根、根狀莖、葉片先用自來水沖洗，再用去離子水清洗3 遍，用吸水紙擦干表面水分后殺青烘干。土樣在通風避光處自然風干。植物材料和土樣研磨過60 目篩網后，分別稱取0.2 g 和0.1 g 放入消解管中，加入5 mL HNO3消解后，用電感耦合等離子體發射光譜儀測定各樣品的Cd含量，樣品測定值均在標準值范圍內。以生物富集系數（BCF）和生物轉運系數（TF）來表示荷花對Cd 的富集和轉運能力，計算公式如下：

富集系數=植株各器官或全株Cd含量（mg·kg-1）/底泥Cd含量（mg·kg-1）

器官A-器官B 的轉運系數=植株器官B 的Cd 含量（mg·kg-1）/植株器官A的Cd含量（mg·kg-1）

1.4 數據處理

統計分析及制圖采用Excel 軟件和GraphPad Prism8軟件完成。采用SPSS 22軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），均值的多重比較采用鄧肯（Duncan）新復極差測驗法檢驗（α=0.05）。

2 結果與分析

2.1 PGPB對Cd脅迫下荷花生長的影響

正常條件下（對照）荷花的株高和葉面積隨處理時間延長逐漸增加，未接菌Cd 處理的荷花株高和葉面積增長非常緩慢，且始終明顯低于對照（圖1），說明Cd脅迫抑制了荷花株高及葉片的增長。與未接菌Cd 處理相比，接種So23 或E02 均使Cd 脅迫下荷花株高和葉面積在早期快速增加，特別是接種So23 的荷花，其株高和葉面積自處理后第14 天起顯著高于未接菌Cd 處理組（P<0.05），甚至略高于對照。此外，與對照相比，未接菌Cd 處理顯著抑制了荷花的立葉數和開花數（圖2），而接種So23 或E02 在一定程度上緩解了Cd 脅迫對荷花立葉數的抑制，但對開花數沒有顯著影響，接種So23 和接種E02 處理的立葉數比未接菌Cd處理分別增加了26.32%和31.57%，且與對照間差異不顯著（圖2A）。以上結果表明接種So23 或E02 均能夠有效緩解Cd 脅迫對荷花生長的抑制，促進荷花株高和葉片的生長。

圖1 不同處理下荷花株高和葉面積隨時間的變化Figure 1 Variation of plant height and leaf area of lotus with time under different treatments

圖2 不同處理對試驗結束時荷花立葉數和開花數的影響Figure 2 Effects of different treatments on the number of standing leaves and flowering of lotus

2.2 PGPB對Cd脅迫下荷花MDA含量的影響

如圖3 所示，對照組荷花葉片中MDA 含量為2.42 nmol·g-1，而未接菌Cd 處理下荷花葉片中MDA含量顯著增加。Cd 脅迫下接種So23 或E02 后，荷花葉片中MDA 含量與未接菌Cd 處理相比分別顯著下降了38.39%、31.21%，且接種So23 處理組葉片MDA含量與對照組間無顯著差異。由此可見，接種So23或E02 均能顯著降低荷花葉片中Cd 脅迫誘導的膜脂過氧化產物。

圖3 不同處理對荷花葉片MDA含量的影響Figure 3 Effects of different treatments on MDA content in lotus leaves

2.3 PGPB對Cd脅迫下荷花AsA和GSH含量的影響

各處理下荷花葉片的AsA 和GSH 含量變化如圖4 所示。與對照相比，未接菌Cd 處理下荷花葉片的AsA 和GSH 含量顯著降低。Cd 脅迫下接種So23 或E02 后，荷花葉片的AsA 含量分別為957.87 mg·kg-1和845.18 mg·kg-1，比未接菌Cd 處理顯著提高了54.85%和36.64%，其中接種So23 處理組的AsA 含量恢復至對照水平（圖4A）。荷花葉片的GSH 含量在Cd 脅迫下接種So23 或E02 后分別上升為746.89 mg·kg-1和757.48 mg·kg-1，相比未接菌Cd 處理分別增加了29.36%和31.19%。可見，接種So23 或E02 可以有效提高荷花葉片抗氧化劑特別是AsA的含量，從而可以緩解Cd脅迫對荷花產生的毒害。

圖4 不同處理下荷花葉片AsA和GSH的含量Figure 4 AsA and GSH contents in lotus leaf under different treatments

2.4 PGPB對Cd脅迫下荷花富集Cd能力的影響

對荷花的根、根狀莖及葉中Cd含量進行測定（圖5）發現，對照組荷花各器官中均未檢測到Cd的積累，而Cd 處理下荷花各器官Cd 含量顯著增加。其中，根部的Cd 含量最高，達到48.38 mg·kg-1，其次是葉和根狀莖。Cd脅迫下接種So23或E02對荷花各器官中Cd的積累量有明顯影響：與未接菌Cd 處理相比，接種So23 或E02 使得荷花根部的Cd 含量分別顯著降低了52.77%和49.51%；葉片中Cd 含量的變化表現出與根部相似的降低趨勢，其中接種E02 處理組葉片Cd 含量顯著低于未接菌Cd 處理組；而接種So23 或E02 使得根狀莖中的Cd 含量顯著增加，與未接菌Cd 處理相比分別增加了87.69%和80.76%。

圖5 不同處理對荷花各器官Cd含量的影響Figure 5 Effects of different treatments on Cd content in organs of lotus

各處理組荷花底泥中Cd 含量變化如圖6 所示。對照組的底泥中未檢測到Cd，而未接菌Cd 處理組底泥中Cd 含量為11.81 mg·kg-1，Cd 脅迫下接種So23 后底泥中Cd含量為5.14 mg·kg-1，顯著低于未接菌Cd處理和接種E02處理組（9.94 mg·kg-1）。

圖6 不同處理對荷花底泥中Cd含量的影響Figure 6 Effects of different treatments on Cd content in sediment of lotus

2.5 轉運系數與富集系數

對不同處理下荷花各器官的轉運系數（表1）分析發現：未接菌Cd 處理下荷花根-根狀莖和根狀莖-葉的轉運系數分別為0.04和1.90；接種So23或E02使得荷花根-根狀莖的轉運系數顯著提高，分別為0.16和0.17，而根狀莖-葉的轉運系數顯著下降，分別為0.81 和0.58。這表明接種So23 或E02 促進了荷花根部的Cd 離子向根狀莖轉運，同時抑制了Cd 從地下部向地上部葉片的轉移。

表1 不同處理下荷花各器官對Cd的轉運系數Table 1 Translocation of Cd in organs of lotus under different treatments

不同處理下荷花對Cd的富集系數如表2所示，Cd處理下無論是否接種PGPB，荷花根部的Cd富集系數均顯著高于其他器官（P<0.05），表明荷花吸收的Cd主要集中于根部。與未接菌Cd 處理組相比，接種So23使得荷花的Cd富集系數有所提升，其根系、根狀莖、葉及全株Cd 富集系數分別是未接菌Cd 處理組的1.12、4.22、1.88 倍和1.30 倍，且根狀莖和葉對Cd 的富集能力顯著高于未接菌Cd 處理組。此外，Cd 脅迫下接種E02對荷花各器官Cd富集系數的影響不顯著。

表2 不同處理下荷花各器官及全株對Cd的富集系數Table 2 Enrichment coefficient of Cd in various organs and whole plants of lotus under different treatments

3 討論

重金屬污染環境修復成為當前社會普遍關注的問題，近年來，利用植物-微生物聯合修復重金屬污染環境成為一種新的技術途徑[4，14]。研究表明，PGPB可以通過一種或多種機制促進植物生長并增強植物抗逆性，其中產ACC 脫氨酶的PGPB 可以有效提高植物對重金屬的耐受性，因此備受國內外研究者的關注[26-27]。本研究中Cd脅迫明顯抑制了荷花的生長，而接種產ACC 脫氨酶菌株So23 或E02 后，荷花的株高及葉面積、立葉數均有不同程度的增加。陳糧等[28]的研究也發現接種產ACC 脫氨酶的PGPB 能夠緩解Cd脅迫對擬南芥株高、地上生物量的抑制。其可能原因是，Cd脅迫下荷花等植物會產生大量脅迫乙烯[8，19-20]，而PGPB 產生的ACC 脫氨酶可以將乙烯合成前體ACC 裂解為α-酮丁酸和氨，抑制植物體內乙烯的大量合成，從而降低過量乙烯對植物的抑制作用，促進植物生長發育[13，29]。此外，前人檢測發現產ACC 脫氨酶菌株So23 和E02 還能分泌IAA[21]。有研究報道將產IAA 的PGPB 接種到田菁[30]、燕麥[31]等植物上可以促進植株生長。因此，本研究推測Cd 脅迫下接種So23和E02能夠促進荷花生長可能還與這兩種PGPB具有合成IAA的能力[21]有關。值得注意的是，Cd脅迫下接種So23 菌株后荷花各生長指標高于接種E02 菌株的處理，這可能與Cd 脅迫下接種So23 后植株體內的IAA產量明顯高于接種E02[21]有關。不同菌株對逆境下植物生長的影響存在差異的現象在五節芒[14]、柳枝稷[21]、苜蓿[32]中也有報道，這主要是由于不同菌株產IAA、溶磷等其他促生特性的差異，導致其在與ACC 脫氨酶協同促進植物響應逆境脅迫時表現出明顯區別。

植物在逆境脅迫下，體內會誘導產生大量的活性氧（ROS），造成氧化傷害。膜脂過氧化是氧化應激的生化標志之一，可通過產物MDA 的含量來衡量[33]。本研究中，接種兩種產ACC 脫氨酶的PGPB 后，荷花葉片中MDA 含量均較未接菌Cd 處理顯著下降，表明接菌降低了Cd 脅迫對葉片細胞膜的損傷，進而減輕了荷花葉片的膜脂過氧化反應。這一結論與趙會會等[34]研究Cd 脅迫下產ACC 脫氨酶的PGPB 對一年生黑麥草葉片中MDA 含量影響的結果一致。植物在長期進化過程中形成了一系列復雜的機制以抵御逆境脅迫造成的氧化傷害，其中抗壞血酸-谷胱甘肽循環是植物抗氧化系統中清除ROS 的重要途徑，與植物抗逆性密切相關[35]。AsA 和GSH 是該循環中兩種重要的抗氧化劑，可以通過淬滅ROS 來調節氧化應激并保持細胞的氧化還原平衡狀態[36]。本研究中，Cd脅迫下荷花葉片的AsA 和GSH 含量顯著降低，究其原因可能是逆境脅迫下植物體內大量ROS 分子積累，導致AsA 和GSH 被消耗，同時植物體內AsA 和GSH 合成受阻，造成細胞氧化還原狀態失衡[37]，引起Cd 毒害；而接種So23 或E02 使得荷花葉片中AsA 和GSH 含量（特別是AsA）明顯升高，增加的抗氧化劑能夠用來清除Cd誘導的過量ROS，維持細胞氧化還原平衡狀態[38]，進而緩解Cd脅迫對荷花葉片細胞膜的損傷及植株生長的抑制。重金屬脅迫下接種PGPB通過增加植物體內AsA和GSH含量，進而使植物最大限度地減少氧化應激誘導損傷的現象在玉米響應Zn脅迫[39]、芥菜響應Cr脅迫[40]中也有類似發現。

接種產ACC 脫氨酶的PGPB 不僅能促進植物生長，還對Cd 的吸收和轉運有一定的調控作用[21]。本研究中，Cd 脅迫下無論是否接菌，荷花都表現為根部的Cd 含量明顯高于其他器官。前人的研究同樣發現，對Cd 脅迫下的一年生黑麥草[34]、白車軸草[41]接種或不接種PGPB，各處理均表現為植株根部Cd含量最高。與未接菌Cd 處理相比，接種So23 或E02 均能顯著抑制Cd 向荷花地上部葉片的轉移，使荷花葉片Cd含量減少，從而減輕重金屬對荷花葉片的毒害。有研究發現PGPB 定殖后可以通過調節大量金屬轉運蛋白及其編碼基因表達等來調控Cd 在植物體內的轉運，緩解Cd 脅迫對植物的毒害[42-43]。本研究顯示，接種So23 使得荷花對底泥中Cd 的富集系數明顯提升，這可能與So23 能夠產生有機酸[21]相關。大量研究證實土壤pH 的降低有利于增加土壤中酸可提取態Cd含量，使Cd 更容易被植物吸收。有研究指出，接種PGPB 能夠通過產生有機酸來降低土壤微環境pH，從而促進擬南芥、積雪草等植物對土壤中Cd 的富集[27，44]。此外，PGPB 還可以向胞外分泌聚合物，因聚合物帶有的負電荷官能團能夠與Cd 離子發生絡合、離子交換等作用，從而實現Cd 離子被細菌表面吸附[45]。本研究涉及到的兩種PGPB菌株均被證明能吸收Cd，且So23 細胞對Cd 的吸附量較E02 更高[21]。因此，推測接種So23 一方面通過分泌有機酸降低土壤pH，進而促進荷花對Cd 的吸收，另一方面通過菌種本身對Cd 的吸附作用[21]，導致底泥中更多的Cd 被吸收，改善了底泥環境。

4 結論

（1）Cd 脅迫明顯抑制了荷花的生長發育；接種產ACC 脫氨酶的植物促生菌（So23 和E02）可以增加荷花葉片中抗氧化劑特別是抗壞血酸的含量，降低丙二醛的含量，有效緩解了Cd脅迫對荷花的毒害，促進了荷花生長。

（2）接種So23 和E02 促進了Cd 在荷花體內的轉運，能夠通過限制Cd 從地下部向地上部葉片的轉移來抵抗Cd 脅迫。此外，接種So23 還增加了荷花對底泥中Cd的富集，改善了底泥環境。